蜂毒肽在大肠杆菌中的高效融合表达与纯化

生物法制备蜂毒肽是实现大量制备蜂毒肽的关键技术。为实现蜂毒肽的高效表达,通过化学法合成含信号肽、前导肽和成熟肽的蜂毒肽基因promet和蜂毒肽成熟肽基因met,与麦芽糖结合蛋白基因mbp连接,克隆到载体pET15-b,构建重组质粒pET-MBP-MET和pET-MBP-proMET。重组质粒转化大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）,以0.1 mmol/L IPTG进行诱导,30 ℃下过夜诱导,融合蛋白MBP-MET、MBP-proMET在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达。两种目标蛋白质经Ni柱和Dextrin Sepharose HP两步亲和纯化,得到了纯度达90%以上的融合蛋白MBP-MET、MBP-proMET,培养1 L大肠杆菌菌液能制备约20 mg纯蛋白质。通过牛津杯抑菌实验发现,MBP-MET、MBP-proMET能明显抑制细菌生长,产生明显的抑菌圈,MBP-MET和MBP-proMET最低抑菌浓度（MIC）分别为100 μg/mL和140 μg/mL。本研究首次实现了蜂毒肽的高效表达,并进行了抑菌功能验证,为生物法制备蜂毒肽提供了高效、安全的合成途径。     

基于模块优化强化大肠杆菌合成乳糖-N-新四糖的研究

乳糖-N-新四糖(lacto-N-neotetraose,LNnT)作为人乳寡糖核心组分之一,在婴幼儿成长发育过程中发挥着重要作用。为寻找高效的LNnT生物合成方法,探究模块优化对大肠杆菌合成LNnT产量的影响,以大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZ为出发菌株,根据合成路径中的关键代谢物质将LNnT合成路径划分为:外源酶所在路径的模块A,UDP-半乳糖合成路径的模块B和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖合成路径的模块C。利用不同拷贝数质粒初步优化模块A、B和C的表达强度,当大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZ共表达重组质粒pRSF-lgtA-A.act和pET-galE时,LNnT产量最高,达0.87g/L。通过CRISPR/Cas9技术敲除setA和ugd强化模块A和模块B,获得的重组菌株E20合成LNnT产量达1.16g/L。摇瓶发酵条件优化后,重组菌株E20合成LNnT产量达1.28g/L。在5L发酵罐中,LNnT分批补料发酵产量达15.53g/L,发酵过程最高生产强度为0.43g/(L·h)。模块优化强化大肠杆菌高效合成LNnT有望为人乳寡糖的高效生物合成提供理论基础,进而推进婴幼儿配方食品产业的革新。     

调整葡萄糖转运系统提高大肠杆菌L-苏氨酸产量

葡萄糖的有效利用是提高大肠杆菌合成L-苏氨酸能力的关键,作者通过优化葡萄糖转运来提高大肠杆菌L-苏氨酸合成能力。利用CRISPR基因编辑技术在大肠杆菌TWF001中分别敲除了PTS系统关键基因ptsH和ptsG,并在30 g/L葡萄糖质量浓度下进行了摇瓶发酵。与对照菌株TWF001相比,TWF001ΔptsH和TWF001ΔptsG合成L-苏氨酸能力均有明显改善;TWF001ΔptsH L-苏氨酸产量提升38.02%。在TWF001ΔptsH基因组上用trc启动子过表达galP基因,构建了TWF001ΔptsH,Ptrc：：PgalP。对3株突变菌在40、50、60 g/L葡萄糖质量浓度下进行了摇瓶发酵;36 h后TWF001ΔptsH,Ptrc：：PgalP在40 g/L葡萄糖质量浓度时,L-苏氨酸产量达到26.16 g/L,糖酸转化率为0.65 g/g,L-苏氨酸产量提升幅度达42.12%。研究结果说明优化葡萄糖转运可以有效提高大肠杆菌L-苏氨酸合成能力。     

利用CRISPR-Cas9和Cre/loxP系统删除34个非必需基因构建L-苏氨酸生产菌

L-苏氨酸是一种被广泛应用于食品、饲料及医药等领域的必需氨基酸。大肠杆菌以葡萄糖为碳源合成L-苏氨酸的过程中,一些非必需基因的转录和翻译会消耗碳源。利用CRISPR-Cas9和位点特异性重组系统Cre/loxP,敲除了大肠杆菌MG1655基因组中puuE和ynaI区间的34个非必需基因（共30.372 kb）,获得了突变菌MG003,然后通过高表达L-苏氨酸合成途径中关键基因thrA*、thrB和thrC以及L-苏氨酸转运酶编码基因rhtA和rhtC提高L-苏氨酸产量。与对照菌MG1655/pFW01-thrA*BC相比,MG003/pFW01-thrA*BC生长加快,L-苏氨酸产量提高25.5%;MG003/pFW01-thrA*BC-rhtA的L-苏氨酸产量提高了43.3%;MG003/pFW01-thrA*BC-rhtC的L-苏氨酸产量提高了74.5%。研究结果表明,大肠杆菌基因组中34个非必需基因的删除有利于其提高L-苏氨酸合成能力。     

变形假单胞菌吡咯喹啉醌合成基因簇的克隆与分析

从变形假单胞菌JUIM01中克隆到吡咯喹啉醌(PQQ)合成基因簇,阐明了其基因组成和生物学信息。根据已报道的假单胞菌的基因组进行简并引物设计,采用LA-PCR技术克隆变形假单胞菌的PQQ合成基因簇,对克隆的基因片段进行测序并使用生物信息学方法进行综合分析。结果表明:克隆到的基因片段全长为11 659 bp,其中包括pqqF、pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE、pqqM、pqqH和pqqI共9个基因,编码PQQ生物合成的前体短肽PqqA和合成途径的相关酶;这些基因与荧光假单胞菌Pf0-1的PQQ合成基因簇的基因组成类似,相应基因的序列一致性达41%～94%。本研究中首次从变形假单胞菌中克隆到PQQ合成基因簇,并对其进行生物信息学分析,为变形假单胞菌的PQQ生物合成途径和胞内再生机制的研究奠定了基础,进而为提高2KGA的生产强度提供了理论支撑。     

长双歧杆菌A17胞外多糖合成基因簇的分析

为探究长双歧杆菌A17胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）生物合成途径，作者依托全基因组测序，利用eggNOG-mapper、KEGG、GO数据注释和局部序列比对等方法对EPS合成相关的基因进行注释与同源性分析。根据同源性分析得到一个长度约为20 kb由19个基因组成的A17 eps基因簇，预测到EPS前体糖核苷酸合成途径，同时发现该途径中的关键基因pgm并进行了异源表达。eps基因簇负责eps单体重复单元合成以及输出相关的EPS合成过程，在EPS前体糖核苷酸合成途径中双歧杆菌A17利用葡萄糖、乳糖形成UDP-Gal、UDP-Glc两种前体糖核苷酸。其中，pgm 编码1→6葡萄糖磷酸变位酶，该酶的产量和活性与EPS合成有关。     

鸡源大肠埃希氏菌mcr-1基因携带及分析

目的 了解在农业农村部禁止使用多黏菌素作为动物促生长使用后四川部分地区鸡源大肠埃希氏菌（E.coli）mcr-1基因的携带情况,为制定进一步防控措施提供依据。方法 采集四川部分地区市场售卖点肉鸡直肠拭子,用含有多黏菌素（终浓度4 μg/mL）的EC肉汤增菌接种含多黏菌素（终浓度4 μg/mL）的麦康凯平板,挑取可疑菌落,采用PCR方法鉴定菌株并检测mcr-1基因;微量肉汤稀释法测定mcr-1基因阳性菌株对临床常见抗菌药物耐药情况。脉冲场凝胶电泳（PFGE）对mcr-1基因阳性菌株进行同源分析。耐药基因质粒结合实验验证mcr-1基因传播途径。结果 从70份肉鸡样本中的13份检出mcr-1基因阳性大肠埃希氏菌,检出率18.57%（13/70）,对实验的13种抗生素,除13株mcr-1阳性菌株对头孢西丁有12株敏感以外,对其他抗生素都表现出不同程度的耐药,其中四环素和甲氧苄啶/磺胺甲恶唑耐药率最高,达到了100%（13/13）;其次是氨苄西林和氯霉素,耐药率为84.62%（11/13）。PFGE显示13株mcr-1阳性大肠埃希氏菌分属13个不同的型别;质粒结合实验显示mcr-1基因能够通过质粒传播。结论 mcr-1基因在鸡大肠内大肠杆菌中检测率比较高,且鸡大肠中mcr-1阳性大肠埃希氏菌的耐药情况比较严重。     

产脂肪酶木糖葡萄球菌YCC3全基因组测序及序列分析

木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus,S. xylosus)YCC3是从发酵肉制品中分离筛选到的1株产脂肪酶活性高的菌株,为研究该菌株在香肠发酵过程中的代谢机理和功能,采用PromethION和Illumina HiSeq测序平台对S.xylosus YCC3进行完成图测序分析。结果表明,S.xylosus YCC3基因组为1套含有3个质粒的环状分子,基因组序列总长度为2773035bp,GC含量(鸟嘌呤和胞嘧啶占基因组序列的比率)为32.88%。基因组中预测到2540个编码基因,编码基因总长度为 2742136bp,平均长度为1079.58bp,占基因组的83.24%。S.xylosus YCC3的编码基因通过GO(Gene Ontology)数据库注释,预测到与抗氧化活性相关的基因3个;COG(Cluster of Orthologous Groups of Proteins)数据库注释到与脂质运输和代谢相关的基因中有8个含有脂肪酸合成基因、4个含有脂肪水解酶基因;KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库注释到与脂肪酸合成相关的基因16个,与脂肪酸降解相关的基因10个,与不饱和脂肪酸合成相关的基因3个。S.xylosus菌株的基因组基本功能注释和代谢通路基因信息注释旨在为菌株作为发酵剂在香肠发酵中的应用提供一定的理论依据。     

钙离子协同溶氧提高重组β-CGT酶的可溶性表达量

环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin glycosyltransferase,简称CGT酶)能够通过环化反应生成环糊精,但天然菌株发酵产酶的水平较低,使得环糊精的生产成本居高不下,因此旨在通过异源表达以及发酵优化策略来提高CGT酶的表达量。首先将来源于Bacillus xiaoxiensis STB08的cgt基因插入质粒pET-20b(+)中,在宿主菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行分泌表达,在适宜的培养基中发酵96 h后,胞外酶活为34.66 U/mL。然后对发酵条件进行优化,改变溶氧以及添加一定终浓度的Ca2+可使酶活提高到66.86 U/mL及83.15 U/mL,且溶氧与Ca²⁺协同作用可使酶活提高到105.69 U/mL,相比于优化发酵条件之前提高了204.93%。最后通过蛋白质定位分析及流式细胞分析对溶氧及添加Ca²⁺影响发酵水平的机理进行了研究。结果表明,较低的溶氧能够减少重组大肠杆菌包涵体的形成,且溶氧较低时细胞活性较高,但溶氧过低时菌体浓度太低,不能满足菌体正常生长及代谢的需求。而添加Ca²⁺能够减少包涵体的形成,同时Ca²⁺对细胞有较好的保护作用,因此,在溶氧以及Ca²⁺的协同作用下,能够保证菌体的高生长浓度,且Ca²⁺能够增加细胞透性并保护细胞,使得活细胞数目显著增多。该研究提高了CGT酶在大肠杆菌中的可溶性表达量,为该酶的工业化生产提供了新的策略及方法,也可为相关酶的发酵优化提供参考。     

利用代谢工程改造谷氨酸棒杆菌产丙酮酸研究

丙酮酸是一种重要的有机酸,可以作为前体物质,参与合成多种有机化合物,在生物体的能量代谢中发挥着重要作用。为提高丙酮酸产量,选择利用代谢工程改造谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)生产丙酮酸。利用同源重组的方法,依次敲除谷氨酸棒杆菌中与丙酮酸代谢支流相关的5个关键基因(丙酮酸醌氧化还原酶基因pqo、丙酮酸羧化酶基因pyc、转氨酶基因alaT、缬氨酸-丙酮酸氨基转移酶基因avtA、丙酮酸脱氢酶基因aceE),摇瓶发酵72h后丙酮酸的产量达到14.64g/L。通过过表达编码转酮醇酶基因tkt、转醛酶基因tal、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因pck,增加合成丙酮酸前体物质的供应。最终,复合培养基摇瓶发酵72h后,发酵液中丙酮酸的产量达到15.39g/L,与野生型菌株相比提高了28倍。研究旨在为利用微生物发酵生产丙酮酸提供一定的理论参考。     

白酒酿造过程中Lactobacillus panis乳酸合成关键环境因子的鉴定

Lactobacillus panis是酱香型白酒酿造过程中主要产乳酸微生物。然而,不同环境因子对L.panis乳酸合成及乳酸合成途径关键基因的表达尚未有相关研究。作者分析了温度、乳酸、乙醇及葡萄糖4种不同的发酵过程相关的典型环境因子对L.panis乳酸产量的影响。结果表明,不同环境条件能够显著调节L.panis的生长和乳酸产量,且乳酸和乙醇是酿造过程中其乳酸合成的关键影响因素。当添加10.0 g/L乳酸后,L.panis的乳酸产量最高,达到12.3 g/L;当添加体积分数4.0%乙醇后,L.panis的乳酸产量最低,仅为7.2 g/L。使用实时荧光定量PCR方法对不同条件下L.panis乳酸合成相关基因的表达进行分析,结果表明添加乳酸能够显著上调包括编码L-乳酸脱氢酶和D-乳酸脱氢酶的ldhL和ldhD在内的乳酸合成基因的表达。然而,添加乙醇会导致L.panis乳酸合成相关基因的整体显著下调。分析调控乳酸合成的关键环境因素,对于白酒酿造过程中乳酸和酿造微生物群落调控及白酒质量控制具有重要意义。     

不同通路配置对大肠杆菌合成2’-岩藻糖基乳糖的影响

在大肠杆菌BL21 Star (DE3)中建立了2’-岩藻糖基乳糖（2’-fucosyllactose，2’-FL）的从头合成途径，通过CRISPR/Cas9系统敲除了β-半乳糖糖苷酶基因lacZ M15序列和尿苷二磷酸-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ，探究了操纵子、假操纵子和单顺反子3 种不同通路配置对重组大肠杆菌合成2’-FL的影响。结果表明：从头合成途径的基因在大肠杆菌BL21 Star (DE3)过表达后摇瓶发酵产生的2’-FL质量浓度为0.34 g/L。敲除lacZ M15和wcaJ后，重组菌产生的2’-FL质量浓度增加到了1.26 g/L。在操纵子形式下，重组菌BS-7摇瓶发酵产生的2’-FL质量浓度最高，达1.92 g/L。BS-7在10 L发酵罐中分批补料发酵37 h后产生的2’-FL质量浓度达到14.04 g/L，2’-FL产率为0.59 g/（L·h），乳糖转化率为63%。因此，大肠杆菌合成2’-FL过程中，较低的基因表达强度更有助于提高其产量，同时可提高底物的转化效率。     

改造乙酰羟酸合成酶提高L-亮氨酸产量

乙酰羟酸合成酶（acetohydroxy acid synthase,AHAS,编码基因ilvBN）是L-亮氨酸合成途径的第一个限速酶。以谷氨酸棒杆菌XL-3（Corynebacterium glutamicum XL-3）为底盘细胞,通过分析并改造AHAS增加其对底物丙酮酸的偏好性,从而提高L--亮氨酸产量。首先利用AHAS的氨基酸序列进行同源建模,根据蛋白质结构进行丙氨酸扫描,找到突变的潜在位点,通过测定突变体酶活力和重组菌株的L--亮氨酸产量寻找最适突变体。测定结果发现将157位Gln突变成Arg能够有效提高AHAS催化丙酮酸的能力,最终重组菌株的L--亮氨酸产量达到（23.5±1.8）g/L,比出发菌株谷氨酸棒杆菌XL-3增加了51%,同时副产物L--异亮氨酸产量有所下降。因此,通过对AHAS的理性改造促进了L--亮氨酸的合成,该研究结果对后续利用蛋白质工程强化微生物合成L-亮氨酸等支链氨基酸具有重要的参考价值。     

重组环糊精葡萄糖基转移酶温控型工程菌的构建及其培养条件的优化

采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）法从蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）中扩增了β-环糊精葡萄糖基转移酶（β-cyclodextrin glucanotransferase,β-CGTase）基因,将该基因克隆到pBV220质粒中,转化E.coli DH5α,经氨苄青霉素抗性筛选和酶切验证后,得到能表达β-CGTase的重组大肠杆菌E.coliDH5α/pBVcgt。通过对工程菌产酶条件的优化,得到最佳产酶条件为：OD600 nm值达到1.0、初始培养温度30 ℃、发酵培养基初始pH 8.0、温度梯度诱导39 ℃培养0.5 h,40 ℃培养0.5 h,41 ℃培养1 h,42 ℃培养2 h。酶活力由优化前的445 U/mL提高到956 U/mL,酶活力提高了1.15 倍。温度梯度诱导比直接诱导酶活力提高20%。该酶的克隆表达以及发酵条件的研究表明,该酶能在大肠杆菌原核表达体系中高效表达。     

Fe 3O 4-COOH纳米材料对大肠杆菌菌株水平的指纹峰确定

通过合成Fe ₃O ₄COOH纳米颗粒提高MALDI-TOF MS对大肠杆菌菌株水平的鉴别,并利用Fe ₃O ₄-COOH纳米对大肠杆菌K-12和大肠杆菌DSM 30083T裂解液中的菌体蛋白进行富集,不仅增加MALDI-TOF MS检测的分辨率和灵敏性,而且可以大大增加大肠杆菌菌株水平的指纹峰,根据实验结果,大肠杆菌K-12有4个匹配的指纹峰,而大肠杆菌DSM 30083T获得8个指纹峰,从而提高MALDI-TOF MS对大肠杆菌菌株水平的鉴别。     

Behaviour of Escherichia coli O157:H7 during the fermentation of Datta and Awaze, traditional Ethiopian fermented condiments, and during product storage at ambient and refrigeration temperatures

The survival of E. coli O157:H7 in fermenting foods and its prolonged survival in refrigerated fermented foods is documented. This prompted the study to evaluate survival of E. coli O157:H7 during the fermentation of Datta and Awaze, traditional Ethiopian condiments. Datta was prepared by wet milling a variety of spices along with green or red chilli and fermenting it by lactic acid bacteria. Awaze is a slurry made of red pepper, garlic and ginger to which various other spices were added and fermented by lactic acid bacteria (LAB) and yeasts. The Datta or Awaze slurry was separately inoculated with three strains of E. coli O157:H7 and the fermentation was allowed to proceed at ambient (20–25°C) temperatures for 7 days. When fermenting Datta or Awaze was initially inoculated at low inoculum level (3 log cfu/g), the test strains were not recovered after 24 h of fermentation. At higher initial inoculum level (6 log cfu/g), however, counts of the test strains in Datta at day 7 were less by about 1.5 log unit than the initial inoculum level. In fermenting Awaze, all test strains were completely eliminated in 7 days. The pH of the fermenting green and red Datta was reduced from 5.2 to 4.4 and that of Awaze dropped from 4.9 to 3.8 during this time. In another experiment, the fermented products were separately inoculated with the E. coli O157:H7 test strains at levels of 6 log cfu/g and incubated at ambient and refrigeration (4°C) temperatures for 7 days. In fermented Datta, two of the three strains were not recovered by enrichment after 6 days of storage at ambient temperatures. In fermented Awaze, all strains were below countable levels at day 5, but could still be recovered by enrichment at day 7. At refrigeration storage, counts of the test strains in Datta and Awaze products were <3 log cfu/g at day 7. The inhibition of our E. coli O157:H7 test strains in Datta and Awaze may be due to the antimicrobial activity of spices and other metabolites produced by LAB which may be effective at low pH.     

The prevalence of Listeria, Salmonella, Escherichia coli and E. coli O157:H7 on bison carcasses during processing

Bison meat is a relatively new, emerging meat species gaining increased popularity in the US and European meat markets, but little is known of its microflora or pathogens that may be present. This study was carried out to determine the incidence of the foodborne pathogens Listeria, Salmonella, Escherichia coli/E. coli O157:H7 on slaughtered bison and to evaluate the bison slaughter process. Bison carcass sampling was carried out at monthly intervals over a period of 1 year at a Bison processing facility in the Midwestern United States. A total of 355 Bison carcasses were sampled by surface swabbing the carcasses at five points on the production line: pre-dehiding, post-evisceration, post-USDA inspection, post-washing and 24 h chilled carcass. Overall, the prevalence of Listeria spp., Salmonella spp., E. coli and E. coli O157:H7 was 18.3%, 3.94%, 38.3% and 1.13%, respectively. The prevalence of Listeria spp. at each sampling point tested was 42.24%, 18.1%, 6.03%, 1.72% and 3.77% while the prevalence of E. coli at each sampling point was: 88.79%, 73.28%, 52.59%, 56.89% and 11.3%, respectively. The data obtained suggests that current antimicrobial intervention strategies used at the plant are relatively effective in reducing Listeria and E. coli contamination on bison carcasses to some extent, however further study is required to determine the influence of current slaughter practices on carcass contamination. The data reported in this study to the authors’ knowledge is some of the first information reporting on the bacteriological status of Bison, and provides some useful baseline information for future research.