水产品中孔雀石绿检测方法的研究进展

孔雀石绿(malachite green, MG)由于其对水产品疾病防治的高效性和低廉的成本而被广泛用作水产养殖业的杀菌剂和杀寄生虫剂, 因此常见于水产品和环境用水中。但是, MG及其主要代谢产物隐性孔雀石绿(leuco-malachite green, LMG)也是有毒的有机污染物, 对人体和其他生物的健康有害。近年来, 已经提出了用于检测MG和LMG的多种方法。用于测定各种基质中MG和LMG的分析方法包括高效液相色谱法(与紫外-可见、荧光、质谱等检测器联用)、光谱法(紫外-可见分光光度法、荧光法、表面增强拉曼光谱法等)、电化学方法、免疫学测定法(酶联免疫法、化学发光免疫法、免疫层析法等)。本文对近10年来孔雀石绿和隐性孔雀石绿的检测方法进行综述, 并讨论了孔雀石绿和隐性孔雀石绿的未来检测发展趋势和所面临的挑战, 为水产中孔雀石绿的检测方法提供一定参考。     

超高效液相色谱-串联质谱法同时检测水产品中 孔雀石绿、结晶紫及其代谢物的残留

目的建立同时检测水产品中孔雀石绿(malachite green,MG)、隐色孔雀石绿(leucomalachite green,LMG)、结晶紫(crystal violet,CV)和隐色结晶紫(leucocrystal violet,LCV)等残留量的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)的分析方法。方法样品经乙腈提取,经中性氧化铝柱净化,采用超高效液相色谱-串联质谱法以电喷雾正离子化模式(electrospray ionization,ESI+)和多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)扫描模式进行测定,以同位素内标法定量。同时考察了基质效应对检测结果的影响。结果水产品中MG、LMG、CV和LCV的基质效应不同,其中LCV的基质效应最为明显,加标回收率较低(约50%)。MG、LMG、CV和LCV 4种物质在0.2~5.0 ng/mL浓度范围内呈良好线性,相关系数均大于0.999,方法检出限为0.1~0.2μg/kg。MG、LMG和CV的加标回收率为93.5%~109.2%,相对标准偏差为5.4%~9.6%(n=6)。结论该方法仪器分析时间短、定量准确、检出限低,可用于检测水产品中MG、LMG、CV和LCV的残留量。     

超高效液相色谱-串联质谱法检测鱼中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物

采用超高效液相色谱-串联质谱法同时测定鱼中孔雀石绿（malachite green,MG）、隐性孔雀石绿（leuco malachite green,LMG）、结晶紫（crystal violet,CV）、隐性结晶紫（leuco crystal violet,LCV）4 种物质残留。样品加入内标物D5-MG、D6-LMG、D5-CV、D6-LCV,经乙腈提取、离心、过中性氧化铝柱,氮气吹至近干,50%乙腈溶液定容,上机测定。MG和LMG线性范围为1～50 ng/mL,CV和LCV线性范围为1～100 ng/mL。4 种物质的检出限均为0.05 μg/kg,定量限均为0.15 μg/kg。在50、100、200 ng/mL 3 个添加水平下,回收率在87.80%～110.82%之间,相对标准偏差均小于等于4.32%（n=6）。该方法灵敏、准确、可靠,可以同时测定鱼中MG、LMG、CV、LCV残留。     

不同水产品中有色和无色孔雀石绿的降解动力学研究

目的 研究不同水产品基质中有色和无色孔雀石绿的降解规律。方法 样品经提取净化后, 用HPLC进行检测, 结果用SPSS软件、降解动力学软件进行分析。结果 三种基质中有色和无色孔雀石绿降解反应均符合准一级反应动力学。在10、50、100 μg/kg三个添加水平下, 三种基质中有色孔雀石绿平均降解率分别为57.9%、48.0%、23.0%, 无色孔雀石绿平均降解率分别为46.6%、43.4%、19.8%。添加浓度为50 μg/kg的鲤鱼基质, 采用自然解冻时有色和无色孔雀石绿降解速率常数分别为K(50 μg/kg)=0.00338 d?1, K(50 μg/kg)=0.00268 d-1, 采用微波解冻方式时有色和无色孔雀石绿降解速率常数分别为K(50 μg/kg)=0.00359 d?1, K(50 μg/kg)=0.00321 d?1。实际样品中无色孔雀石绿降解速率常数K(111.2 μg/kg无色, 鲤鱼)=0.000614 d?1, K(50 μg/kg无色, 鲤鱼)=0.00125 d?1。结论 有色孔雀石绿较无色孔雀石绿降解快, 低浓度比高浓度降解快; 两种解冻方式对有色和无色孔雀石绿降解影响较小; 实际样品中无色孔雀石绿降解速率常数均比空白基质中添加无色孔雀石绿降解慢。     

亮橙色荧光碳点探针快速检测水产品中孔雀石绿

摘 要：目的 建立以亮橙色荧光碳点（bright orange fluorescent carbon dots, BO-CNDs）为探针的荧光检测法快速灵敏测定水产品中的孔雀石绿（malachite green,MG）。方法 对工作参数进行优化后,研究该检测方法的线性范围、灵敏度、选择性及抗干扰性,探究BO-CNDs和MG之间的相互作用,进而提出MG对BO-CNDs荧光猝灭的机制,最终将该方法应用到水产品中MG含量的测定。结果 在最佳检测条件下,BO-CNDs对MG检测的线性范围为0.01~10.00 μmol/L,检测限低至4.23 nmol/L,表现出反应快、选择性好、灵敏度高的优势。MG对BO-CNDs的荧光猝灭是内滤效应（inner filter effect, IFE）和动态猝灭协同作用的结果。最终将该检测方法应用于白鲢鱼、黑鱼、武昌鱼、鲤鱼、草鱼等鱼类样品中MG含量的测定,回收率在96.00%~102.00%之间,相对标准偏差(relative standard deviations, RSDs)低于1.01%。结论 该方法检测限低、灵敏度高、准确性好,具有应用于水产品中MG快速检测的巨大潜力。     

液相色谱-线性离子阱质谱法检测草鱼中孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物

目的建立鱼中的孔雀石绿（MG）、结晶紫（GV）及其代谢物无色孔雀石绿（LMG）、无色结晶紫（LGV）的测定方法。方法使用液相色谱线性离子阱串联质谱技术和同位素稀释技术，Mcllvaine缓冲液和乙腈提取，OASIS MCX SPE柱净化，洗脱液在选择反应检测模式（SRM）下测定。结果方法的检出限CCα为0．03～0．05μg／kg，定量限CCβ为0．05～0．09μg/kg。5个不同加标水平鱼样中4种目标化合物的平均回收率为84．7％～105．1％，RSD为1．3％～14．9％（n=5）。结论本方法定量准确可靠，可用于鱼样品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物的测定。     

市售淡水鱼中孔雀石绿及其代谢物残留量的调查研究

目的 了解福建省餐饮环节淡水鱼孔雀石绿(MG)及其代谢物无色孔雀石绿(LMG)的残留情况.方法207份样品来自福建省6个市有关餐饮场所,共28个品种,制作为鱼肉浆,经前处理后,采用高效液相色谱/荧光法对鱼内浆中孔雀石绿及其代谢物的残留总量进行检测,阳性样品再用高效液相色谱/质谱法确证.结果 15个品种的48份样品检出孔雀石绿及其代谢物,检出率为23.2％,总MG含量在0.54～8 099μg/kg之间.桂花鱼检出率最高,达到92.9％ (26/28),草鱼检出率较低,为2.38％ (2/84).结论 餐饮环节销售的淡水鱼孔雀石绿及其代谢物的检出率相对较高,在某些品种淡水鱼供应链中滥用MG的现象较为突出,需要有关监管部门加大打击滥用MG的力度,确保淡水鱼的消费安全.     

水产品孔雀石绿和隐性孔雀石绿快速定量检测研究

采用胶体金免疫层析方法建立了水产品中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的定量检测,并对其样品前处理方法进行了研究。结果表明,孔雀石绿的线性范围为0.25μg/L~8μg/L,线性系数0.996 1;优化后孔雀石绿提取液的pH为4.5,对甲苯磺酸浓度为0.06 mol/L,净化剂为2 g中性氧化铝,脱水剂为2 g氯化钙,氧化剂为100μL 0.1%四氯苯醌;孔雀石绿加标回收率为80.1%~89.6%,隐性孔雀石绿加标回收率为66.9%~72.9%,相对标准偏差1.07%~8.14%。     

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留的拉曼光谱法快速检测

为实现水产品中孔雀石绿以及结晶紫残留的快速检测,建立了一种水产品中孔雀石绿以及结晶紫残留的表面增强拉曼光谱（SERS）快速检测方法。该方法通过乙腈提取、石油醚净化、硼氢化钾还原以及二氯二氰苯醌（DDQ）氧化等四步获取提取液,并通过单因素实验,确定了胶体金、提取液以及促凝剂的加入量。经研究,孔雀石绿拉曼特征位移为795、39、1215、1610 cm-1,结晶紫拉曼特征位移为795、939、1610 cm-1,根据其拉曼光谱特征峰及其强度,对孔雀石绿和结晶紫进行定性快速测定。结合检出概率模型（POD）,确定出孔雀石绿及结晶紫的虾、蟹类检出限为1.00 μg/kg,鱼、贝类检出限为0.50 μg/kg,灵敏性≥95%,特异性≥95%,假阴性≤5%,假阳性≤5%符合了快速检测定性的要求。该方法操作简单、快速准确,从样品前处理到结果显示仅需40 min,可用于水产品中的孔雀石绿和结晶紫的现场快速检测。     

一种柔性表面增强拉曼基底的制备及在孔雀石绿检测上的应用

目的 制备一种柔性表面增强拉曼(surface enhanced Raman scattering, SERS)基底。方法 采用原位合成法,通过在聚酯纤维表面沉积金纳米粒子,成功制备一种柔性SERS基底,且仍反应时间和氯金酸溶液浓度2个方面迚一步优化制备条件。结果 应用该基底实现了孔雀石绿(malachite green, MG)的高灵敏检测,其对MG线性检测范围为10~(-9)～10~(-4) mol/L,线性相关系数为0.995。将本方法用于超市养殖水样中MG含量检测,样品未检出MG;用MG标准溶液配制模拟样品,实际可检测的最低浓度为10~(-9) mol/L。结论 本方法有望用于水产品中孔雀石绿的快速高灵敏检测。     

水产品中残留孔雀石绿液质联用分析方法研究

研究了一种针对水产品中残留孔雀石绿和无色孔雀石绿的液质联用分析方法。采用固相萃取方法对样品中的目标物进行净化前处理,以乙腈- 醋酸铵缓冲液作流动相分析食品中的孔雀石绿和无色孔雀石绿,缩短了色谱分离时间,提高了检测灵敏度和分析结果的可靠性,并对柱后衍生化和非衍生化方法以及DAD 和MS 检测方法进行了比较。结果表明本方法具有准确、快速以及灵敏度高的特点,能够适应大规模样品的快速分析要求,目前此方法已经用于水产品中残留孔雀石绿的分析检测。     

固相萃取-高效液相色谱-荧光检测法测定水体中的孔雀石绿

应用固相萃取-高效液相色谱-荧光检测法建立环境水体中痕量孔雀石绿的分析方法。水样中的孔雀石绿用硼氢化钾还原为其相应的代谢产物隐色孔雀石绿,通过MCX固相萃取柱富集、净化后用0.25mol/L乙酸铵-甲醇溶液洗脱,以Agilent C18反相色谱柱为分析柱,0.05mol/L的乙酸铵(pH4.5)-乙腈(20:80,V/V)为流动相,采用荧光检测器分析,外标法定量。结果表明:孔雀石绿在0.005～0.5μg/mL范围内线性良好,检出限为0.05μg/L。以池塘水、江水和海水作为基底,加标质量浓度分别为0.200、1.00、5.00μg/L时,孔雀石绿的平均加标回收率分别为91.7%～92.6%、87.4%～94.6%和84.1%～92.6%,相对标准偏差分别为4.5%～5.9%、2.8%～4.1%和5.4%～6.5%。该方法灵敏度高、重现性好、杂质干扰小,适用于批量样品的测定。     

基于混合抗体的酶联免疫分析方法同时检测孔雀石绿和隐孔雀石绿

孔雀石绿是"三致"物质,常被非法使用于渔业生产。水产品和环境中常以孔雀石绿和隐孔雀石绿两种形式同时存在,均具有强致癌性。但由于二者结构差异较大,现有的单克隆抗体只能分别检测样品中单一药物的残留量,难以客观地反映出孔雀石绿和隐孔雀石绿的总残留量。目前同时检测两种结构的免疫分析方法鲜有报道,本文分别制备了针对孔雀石绿和隐孔雀石绿的高特异性单克隆抗体,通过研究混合抗体模式建立了可以同时检测两种物质的酶联免疫分析方法,该方法对孔雀石绿和隐孔雀石绿混合物的半抑制浓度(50%inhibiting concentration,IC50)为3.27 ng/m L,检测线LOD(IC10)为0.24 ng/m L,线性范围为0.62~17.25 ng/m L。本方法的建立对保障水产品安全具有重要意义,也为混合抗体法同时检测两种或多种残留药物提供了方法借鉴。     

Determination of malachite green and crystal violet in processed fish products

This paper presents analysis of malachite green (MG) and crystal violet (CV) residues in processed fish products. Samples were homogenized and extracted with ammonium acetate buffer and acetonitrile. The extracted residues were partitioned into dichloromethane, in situ oxidized to chromic forms with 2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone, and cleaned up on neutral alumina and propylsulfonic acid cation-exchange solid-phase extraction (SPE) cartridges. MG and CV were determined at 618 and 588 nm using HPLC with a visible detector (LC–VIS) and confirmed by LC–electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC–ESI–MS/MS). The recoveries were as follows: MG (74.8–83.8%), LMG (80.0–88.4%), CV (68.6–73.9%), and LCV (85.5–90.0%). The method modified in this study has been evaluated by application in-house to a survey of 253 processed fish products. As a result of monitoring, MG and CV were positive in one shrimp and one eel sample, respectively. Our results showed that regular monitoring of these antibiotic residues is recommended for protection of public health.     

基于石石墨烯的丁酰胆碱酯酶传感器法快速测定水产品中的孔雀石绿

本文以壳聚糖（Chitosan）和石墨烯GS为复合修饰材料,通过交联技术固定化丁酰胆碱酯酶（BuChE）制备了BuChE/CS/GS/GCE纳米酶传感器,建立了一种快速而灵敏测定水产品中孔雀石绿（Malachite Green,MG）的方法。研究了BuChE/CS/GS/GCE纳米酶传感器修饰材料、电解质、固定酶量、抑制时间等对酶传感器响应电流的影响,优化了酶传感器法测定MG的试验条件,结果如下：修饰材料CS与GS之比为1:2、0.10 mol/L的PBS为电解质、pH 7、抑制时间为11 min、酶活是4.0 U/mL。在此条件下,该酶传感器的响应电流与电解质溶液中MG的浓度在1.0×10-7~1.1×10-6 mol/L范围内成线性关系（Ip=-6.97 C MG+22.81,R2=0.9885）,最低检测限为2.80×10-8 mol/L（S/N=3）,加标回收率在96.36%~99.78%。该方法用于水产品中MG的测定具有简捷、灵敏度高、选择性好、稳定性好、重复性好等优点,用于水产品中孔雀石绿的快速检测是可行的。     

Development of a sensitive and group‐specific polyclonal antibody‐based enzyme‐linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of malachite green and leucomalachite green in water and fish samples

BACKGROUND: Malachite green (MG) is widely used in fishery, since it is easily adsorbed by fish during waterborne exposure and is rapidly metabolised into leucomalachite green (LMG). However, both MG and LMG are potential carcinogens, teratogens and mutagens. In this study the LMG derivative bearing an amino group on the phenyl ring was synthesised and coupled to carrier proteins. An LMG polyclonal antibody‐based enzyme‐linked immunosorbent assay (ELISA) was developed and characterised. RESULTS: The ELISA standard curve was constructed with concentrations of 0.1–100 ng mL^?1. The IC₅₀ value for nine standard curves was in the range 0.9–2.6 ng mL^?1 and the limit of detection at a signal‐to‐noise ratio of 3 was 0.02–0.10 ng mL^?1. The cross‐reactivity values of the LMG antibody with MG, crystal violet and leucocrystal violet were 95.25, 29.07 and 212.38% respectively, while less than 0.2% cross‐reactivity was found with eight other compounds. For LMG‐spiked water and fish samples, recoveries were 76.2–95.0% and the correlation coefficient of ELISA with high‐performance liquid chromatography (HPLC) was 0.9752 (n = 7). For (LMG + MG)‐spiked fish samples the results of ELISA were similar to those of HPLC. CONCLUSION: The proposed ELISA can be utilised as an analytical tool for detecting the sum of MG and LMG in water and fish muscle samples. Copyright © 2009 Society of Chemical Industry     

超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法快速筛查水产品中16 种激素残留

建立改良的QuEChERS前处理方法,结合超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱快速筛查水产品中16?种激素残留。样品均质后经体积分数1%乙酸-乙腈提取,氯化钠和无水硫酸镁盐析,正己烷脱脂和十八烷基键合硅胶吸附剂（C18）净化后,采用BEH?C18色谱柱分离,以0.1%甲酸溶液和甲醇为流动相进行梯度洗脱,电喷雾正离子模式检测。16?种激素在1～100?μg/L范围内线性关系良好,相关系数（r2）为0.990?6～0.999?9,4?种不同水产品（南美白对虾、大黄鱼、梭子蟹、草鱼）在3?个添加水平下,回收率为53.6%～135.2%,相对标准偏差为0.93%～10.9%。方法检出限为0.2～2.7?μg/kg,方法定量限为0.8～8.2?μg/kg。建立的方法快速、准确,适用于水产品中激素的快速筛查。     

Quantification of malachite green in fish feed utilising liquid chromatography-tandem mass spectrometry with a monolithic column

The purpose of this study was to develop a rapid and sensitive method for the quantification of malachite green (MG) in fish feed using LC-ESI-MS/MS with a monolithic column as stationary phase. Fish feed was cleaned using ultrasonic assisted liquid–liquid extraction. The separation was achieved on a Chromolith^® Performance RP-18e column (100 × 4.6 mm) using gradient mobile phase composition of methanol and 0.1% formic acid at the flow rate of 1.0 ml min^–1. The analyte was ionised using electrospray ionisation in positive mode. Mass spectral transitions were recorded in selected reaction monitoring (SRM) mode at m/z 329.78 → m/z 314.75 with a collision energy (CE) of 52% for MG. The system suitability responses were calculated for reproducibility tests of the retention time, number of theoretical plates and capacity factor. System validation was evaluated for precision, specificity and linearity of MG. The linearity and calibration graph was plotted in the range of 15.0–250 ng ml^?1 with the regression coefficient of >0.997. The lower limits of detection and quantification for MG were 0.55 and 1.44 ng ml^?1, respectively, allowing easy determination in fish feed with accuracy evaluated as a percentage recovery of 92.1% and precision determined as % CV of < 5. The method was also extended to the determination of MG in an actual fish feed. The sensitivity and selectivity of LC-ESI-MS/MS using monolithic column offers a valuable alternative to the methodologies currently employed for the quantification of MG in fish feeds.