人LIGHT-Fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的利用酵母表达系统制备人LIGHT-Fc融合蛋白。方法利用基因工程方法构建含人LIGHT胞外段基因和人Ig G4 Fc基因的重组质粒p PIC9K-LIGHT-Fc,经SalⅠ线性化后电转化感受态酵母菌GS115,PCR鉴定重组转化子。将阳性重组转化子经甲醇诱导表达后,RT-PCR法检测目的基因的转录水平,SDS-PAGE及Western blot法进行表达产物的鉴定。结果表达质粒p PIC9K-LIGHT-Fc经酶切及测序鉴定,证明构建正确。10个重组子均为Mut+型阳性转化子,经甲醇诱导后可扩增出特异性目的基因片段。表达的重组LIGHT-Fc融合蛋白相对分子质量约45 000,可与鼠抗人LIGHT多克隆抗体发生特异性结合。结论人LIGHT-Fc融合蛋白在毕赤酵母中已成功获得了表达,为进一步开展其生物学功能的研究奠定了基础。     

人热休克蛋白10在毕赤酵母中的表达及纯化

目的在毕赤酵母中表达及纯化人热休克蛋白10(heat shock protein 10,Hsp10)。方法取新鲜人胎盘组织提取总RNA,反转录合成c DNA。以其为模版PCR扩增Hsp10基因片段,构建外分泌重组表达载体pPIC9KHsp10,电击转化毕赤酵母GS115菌株,经组氨酸缺陷筛选,获得阳性菌株pPIC9K-Hsp10/GS115。重组菌经甲醇诱导,SDS-PAGE检测蛋白含量,Western blot分析Hsp10特异性。结果获取了序列正确的Hsp10基因及高表达菌株。表达产物在相对分子质量11 000处可见特异表达条带,Hsp10蛋白表达量为400 mg/L,纯度大于90%;Western blot分析表明,Hsp10具有良好的反应原性和特异性。结论 Hsp10在毕赤酵母GS115中成功表达,为该蛋白的放大生产及应用奠定了基础。     

乙酰肝素酶大亚基在毕赤酵母中的表达

目的构建乙酰肝素酶(HPA)大亚基片段真核表达质粒,并在毕赤酵母中表达重组蛋白。方法根据GenBank中登录的HPA大亚基基因序列设计引物,PCR方法扩增肝素酶基因,构建毕赤酵母真核表达质粒pPICZαA-HPA。电击穿孔法转化感受态毕赤酵母SDM1168,斑点免疫印迹法筛选重组菌株,PCR法鉴定阳性克隆。甲醇诱导表达重组蛋白,Western blot鉴定表达产物。结果构建的重组真核表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确;斑点免疫印迹法筛选出的9个单菌落经PCR扩增,均可见1161bp的目的基因条带;表达产物经Western blot分析,具有良好的反应原性,表达量约为5μg/L。结论已成功构建了HPA大亚基片段真核表达质粒pPICZαA-HPA,并在毕赤酵母SDM1168中分泌表达了HPA大亚基。     

表达HBsAg及rhIFNα2b融合蛋白的人参细胞株的建立

目的建立表达HBsAg及rhIFNα2b融合蛋白的人参细胞株。方法采用PCR方法分别扩增HBsAg及rhIFNα2b基因,以GS linker连接后,克隆入表达质粒pBI121,构建植物细胞表达质粒pBISI,转化农杆菌LBA4404,感染人参愈伤组织细胞。经G418筛选抗性细胞株,提取细胞基因组DNA,进行PCR检测;应用ELISA法检测HBsAg及rhIFNα2b的表达;通过Western blot分析表达蛋白的反应原性。结果重组表达质粒pBISI经酶切鉴定,表明构建正确。筛选得到3株正常生长的人参细胞株,基因组DNA扩增得到约1200bp的融合基因片段;经ELISA检测,其中1株能够表达HBsAg及rhIFNα2b;表达的蛋白与鼠抗HBsAg血清在相对分子质量35000处出现特异条带。结论已获得了表达HBsAg及rhIFNα2b融合蛋白的人参细胞株。     

应用毕赤酵母表达中国株HIV-1核心蛋白Gag

目的 构建含HIV-1Gag全长基因的重组酵母表达质粒pPICGAG，并在毕赤酵母中进行表达。方法用Not I和XhoI将含HIV－1 Gag全长基因的质粒pKSGAG双酶切后，克隆到酵母表达载体pPIC9中，构建了重组表达质粒 pPICGAG。pPICGAG用 SacI线性化后，电转化毕赤酵母 GS115，PCR鉴定阳性酵母转化子，并分别将PCR阳性的酵母转化子在BMGY和BMMY培养基中进行诱导表达，表达产物进行SDS-PAGE电泳分析。结果 酵母转化子的整合率为72．7％。SDS-PAGE结果显示表达蛋白的相对分子质量为55000左右，与预计计算的值相同。Western blot结果显示表达蛋白能与单克隆抗体发生特异性反应。结论 在毕赤酵母中成功地表达了HIV-1核心蛋白Gag，且表达的蛋白具有良好的反应原性和特异性。     

融合蛋白ABD-Fc-IL-2的真核表达及其生物学活性鉴定

目的 真核表达融合蛋白ABD-Fc-IL-2,并检测其生物学活性。方法 通过直接PCR及重叠延伸PCR法扩增目的基因SP-ABD-Fc-IL-2,连接至载体pcDNA3.1(+),获得重组质粒pcDNA3.1/SP-ABD-Fc-IL-2。将重组质粒转染CHO-S细胞表达融合蛋白ABD-Fc-IL-2,并进行Protein A beads亲和层析纯化。Western blot法检测纯化融合蛋白的特异性,CTLL-2/MTT细胞增殖比色法测定其生物学活性,pull down/Western blot法检测融合蛋白中链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域(albumin-binding domain,ABD)与人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)的相互作用。结果重组质粒pcDNA3.1/SP-ABD-Fc-IL-2经双酶切及测序鉴定,证明构建正确。纯化融合蛋白ABD-Fc-IL-2纯度达90%,可与鼠抗IL-2单克隆抗体发生特异性结合,生物学活性为3.29×108IU/mL,融合蛋白中ABD与HSA可相互结合。结论 真核表达的融合蛋白ABD-Fc-IL-2具有较高的生物学...     

辣根过氧化物酶基因与血管内皮生长因子基因的连接及克隆

目的连接辣根过氧化物酶(HRP)基因与血管内皮生长因子(VEGF)基因并进行克隆。方法用RT-PCR法从人肺肿瘤组织获得VEGF165基因,从含有HRPC3基因的质粒pMDC3EX中扩增得到HRPC3基因,将两种目的基因通过连接肽相应DNA序列进行连接,再以带有特定酶切位点的引物进行PCR,然后将目的基因插入到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建重组质粒,在大肠杆菌中克隆,并进行序列分析。再将重组质粒转入毕赤酵母中,筛选阳性克隆,提取基因组DNA,采用PCR法鉴定。结果用PCR扩增的VEGF165基因和HRPC3基因片段与预期相符,将二者连接后,克隆到pPIC9K质粒中,经DNA测序证明重组基因与公开发表的相同DNA同源性为97.3%。经PCR鉴定,目的基因已转入毕赤酵母中。结论已成功将辣根过氧化物酶基因与血管内皮生长因子基因连接并克隆。     

人脑钠肽与人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及其活性

目的在毕赤酵母中表达重组人脑钠肽(BNP)与人血清白蛋白(HSA)融合蛋白,并检测其活性。方法重叠PCR法拼接BNP二联体与HSA基因,插入表达载体pPIC9K,电穿孔法转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE分析、Western blot鉴定及活性检测。结果融合基因(BNP)2-HSA经测序正确,重组表达质粒经双酶切鉴定构建正确。诱导72h,融合蛋白表达量最高,可达200mg/ml,且具有良好的反应原性,其活性为rhBNP标准品的1%。结论已在毕赤酵母中成功表达了具有一定生物活性的(BNP)2-HSA融合蛋白,为开发BNP长效药物奠定了基础。     

SARS病毒S2蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的研究用毕赤酵母菌表达SARS病毒S2蛋白亚单位。方法依据GenBank中SARS基因组序列,采用人工合成的方法合成SARS病毒刺突蛋白S2亚单位的基因(1590bp),再与CTL表位基因(195bp)重组后,将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建重组表达质粒pPIC9K-S2,转化毕赤酵母GS115,并经MD和MM平板筛选及PCR鉴定,得到阳性重组酵母工程菌GS115/pPIC9K-S2。经诱导、表达,并对表达产物进行分析、鉴定。结果所构建的重组质粒pPIC9K-S2正确,在毕赤酵母中可高效表达,其表达产物与阳性SARS血清产生特异性反应。结论SARS病毒刺突蛋白S2亚单位可在毕赤酵母中高效表达,产物具有良好的抗原特异性。     

人Cu,Zn-SOD基因在毕赤酵母中的表达及稳定性

目的构建人Cu,Zn-SOD基因的真核表达载体,转化毕赤酵母,并检测表达产物的稳定性。方法根据酵母密码子偏好性,合成人Cu,Zn-SOD基因,克隆至真核表达载体pPIC9k中,转化毕赤酵母GS115。甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。优化表达条件,并检测粗酶液的稳定性。结果经SDS-PAGE和Western blot检测,表达的目的蛋白相对分子质量为18000左右;最佳表达条件为pH6.0,甲醇浓度1.5%,持续培养96h;目的蛋白占分泌蛋白总量的27%,最高表达量为91mg/L;最佳条件下培养液上清的酶活性最高达334U/ml,粗酶对氯仿和乙醇稳定,对H2O2不稳定,对温度有一定的耐受性,pH在6和8时较稳定。结论在毕赤酵母GS115中成功表达了具备酶活性的人Cu,Zn-SOD基因。     

人巨细胞病毒pp65基因在毕赤酵母中的表达

目的构建表达人巨细胞病毒(HCMV)pp65336-507基因的毕赤酵母工程菌。方法扩增HCMVpp65336-507基因,构建重组表达质粒pPIC9/pp65336-507,转化毕赤酵母菌GS115。PCR法筛选阳性克隆,SDS-PAGE及Westernblot鉴定表达产物。结果已构建和筛选到阳性表达克隆株,表达的pp65336-507蛋白的相对分子质量约为26000,能与特异的pp65抗体结合。结论已成功构建了分泌表达pp65336-507蛋白的毕赤酵母工程菌,表达的目的蛋白具有良好的反应原性。     

经基因优化的HPV16L1蛋白在毕赤酵母中的表达

目的利用毕赤酵母表达系统(Pichia pastoris)高效表达HPV16L1蛋白。方法按照Pichia pastoris密码子偏爱性合成HPV16L1基因,构建pAO819r-16L1表达载体,电转化至GS115菌株中,经MD板和不同浓度G418筛选,挑取高拷贝整合菌株,甲醇诱导目的蛋白的表达,用HPV16L1抗血清,经Western blot检测蛋白的特异性。结果重组质粒pAO819r-16L1在甲醇营养型酵母菌株中经甲醇诱导后可表达HPV16L1蛋白,在试管中的表达量超过10mg/ml,经Western blot验证,该蛋白可与抗血清特异结合,在相对分子质量55000附近出现目的条带,证明该蛋白确为HPV16L1蛋白。结论利用毕赤酵母表达系统可高效表达HPV16L1蛋白,为研制HPV疫苗奠定基础。     

人血管抑制因子Vasostatin(120～180aa)的真核表达、纯化及活性鉴定

目的利用毕赤酵母表达系统表达人血管抑制因子Vasostatin(120～180aa),经纯化后,观察其抑制血管内皮细胞增殖的活性。方法采用PCR技术扩增出人血管抑制因子Vasostatin(120～180aa)的全长cDNA序列,将其克隆至真核表达载体pPIC9K中,转化毕赤酵母KM71,以甲醇诱导表达,并进行Western blot检测及金属螯合层析纯化。采用MTT法检测纯化的血管抑制因子对血管内皮细胞增殖的抑制作用。结果重组表达质粒pPIC9K-Vasostatin(120～180aa)经菌落PCR、酶切和测序鉴定,证明构建正确。经Western blot检测可见一条特异条带,纯化后的蛋白纯度达88.76%,浓度为300μg/ml,在体外可抑制人脐静脉血管内皮细胞ECV304的增殖。结论人血管抑制因子Vasostatin(120～180aa)可在毕赤酵母中以分泌形式表达,并具有抑制血管内皮细胞增殖的活性。     

胆盐水解酶基因在毕赤酵母中的表达

目的在毕赤酵母中表达胆盐水解酶(Bile salt hydrolase,BSH)基因。方法以重组质粒pMD18-BSH为模板,PCR扩增BSH基因,克隆至毕赤酵母表达载体pGAPZαA上,经AvrⅡ线性化,电转化至毕赤酵母SMD1168,PCR筛选阳性重组子,诱导表达,表达产物经Western blot进行分析。结果重组表达质粒pGAPZαA-BSH经双酶切及测序证明构建正确;经PCR鉴定阳性的重组酵母菌的诱导表达产物经SDS-PAGE分析,可见相对分子质量约35000的目的蛋白表达条带;表达的重组蛋白可与兔抗植物乳杆菌多克隆抗体发生特异性反应。结论在毕赤酵母中成功表达了BSH,为BSH结构与相关功能及高效降解胆固醇的基因工程菌株的研究奠定了基础。