高压热杀菌处理对枯草杆菌芽孢皮层裂解酶活力的影响

高压热杀菌处理(HPTS)下芽孢皮层肽聚糖水解是造成细菌芽孢死亡的重要原因,芽孢自身皮层裂解酶活力变化对皮层肽聚糖水解有直接影响。本文从枯草杆菌芽孢中提取了皮层裂解酶,先研究了磷酸钠浓度、pH、温度和压力对皮层裂解酶活力的影响,在此基础上研究了HPTS对该酶活力的影响。结果发现,皮层裂解酶的最适磷酸钠浓度为0.05 mol/L,当磷酸钠浓度为0.35 mol/L 时,皮层裂解酶活力较低;当pH为7时,皮层裂解酶活力最强,偏酸或偏碱性条件下,活力均有所降低;在4~44 ℃时皮层裂解酶均具活力,酶活变化无明显规律,但当温度升至68 ℃时皮层裂解酶基本失活;在150~530 MPa压力范围内,压力对皮层裂解酶活性基本无影响,然而HPTS处理时(530 MPa、68 ℃、15 min),皮层裂解酶基本失活,而皮层裂解酶是芽孢中唯一能特异性地水解皮层肽聚糖的酶,由此可推测HPTS处理下皮层肽聚糖发生了非酶水解。     

芽孢皮层裂解酶的提取与SDS-PAGE分析

使用2,6-吡啶二羧酸(DPA)、L-丙氨酸、肌苷等诱导芽孢萌发,从萌发液中提取芽孢皮层裂解酶。提取的芽孢皮层裂解酶经超滤浓缩后进行SDS-PAGE垂直板电泳分析。研究发现:DPA、L-丙氨酸、肌苷以及L-丙氨酸结合肌苷对枯草芽孢杆菌芽孢均有诱导萌发的作用,且DPA诱导枯草芽孢杆菌芽孢萌发效果最好。进行SDS-PAGE电泳时,进样量为15μL,分离胶浓度为10%的凝胶板跑出的蛋白条带分离的较好,凝胶板上有4条蛋白条带,通过蛋白质分子量标准曲线可得出,目标蛋白分子量大约分别为:61.10、48.64、43.25、31.28 k Da。本研究初步提取纯化了皮层裂解酶,为后继进一步提纯皮层裂解酶、研究HPTS对该酶活性和结构的影响提供试验材料,有助于阐明高压热处理下芽孢死亡的机理,推动HPTS技术在食品工业中的应用。     

中温结合乙醇处理对枯草芽孢杆菌芽孢皮层裂解酶活性及结构的影响

以枯草芽孢杆菌芽孢皮层裂解酶为研究对象,研究中温结合乙醇处理对其活性及结构的影响。采用紫外可见分光光度法测定酶活性,荧光光谱和傅立叶变换红外光谱法(fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)分析处理前后酶二三级结构的变化。结果表明,80℃结合体积分数为30%、75%乙醇处理20 min时,杀灭芽孢效果最佳,皮层裂解酶活性最弱,仅为(24. 3±2. 73)、(20. 42±2. 17) U/L。中温结合乙醇处理使皮层裂解酶荧光强度下降,80℃时红移3 nm,三级结构发生变化。随着温度和乙醇体积分数逐渐增加,二级结构发生变化,α-螺旋及β-折叠含量减少、无规卷曲含量显著增加,75%(体积分数)乙醇80℃处理时变化最显著,含量分别为(10. 98±0. 03)%、(25. 41±0. 03)%、(48. 24±0. 06)%、(15. 37±0. 02)%。中温结合乙醇处理后皮层裂解酶结构发生变化,从而导致酶活力的改变。     

芽孢杆菌植酸酶基因的克隆及生物信息学分析

采用PCR技术从Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061中克隆到植酸酶的全长基因phyC(1152bp),并将该基因成功克隆到表达载体pET22b(+),经PCR鉴定和DNA测序证明,pET22b(+)-phyC重组质粒构建成功。将该酶的氨基酸序列在Swiss-prot数据中进行BLAST比对发现,该序列未见报道,其与来自Bacillus subtilis的植酸酶序列(Swiss-prot ID: O31097)最相似,序列一致性为98.7%。分析可知该氨基酸序列在位点为128、144、153、257和370处分别变异为Ala、Ile、Ser、Pro和Lys。运用SignalP 3.0服务器对其信号肽进行预测,表明该酶N端1～26个残基可能是信号肽序列。运用SWISS-MODEL服务器进行同源建模,经PROCHECK V3.5软件对其Ramachandran plot、G-factor等进行评价,结果显示结构模型中的键长、键角及二面角的分布及结构合理。该基因已在GenBank上登录(登录号为HM747163)。     

板栗过氧化氢酶基因CAT1的克隆及生物信息学分析

为研究板栗过氧化氢酶基因CAT1的功能,旨在为其采后贮藏中品质变化研究提供分子机理基础。以板栗为试材,提取总RNA,通过c DNA末端快速扩增技术（RACE）,克隆到板栗CAT1基因c DNA全长,并对其进行生物信息学分析。结果表明,该基因序列全长1485 bp,包含一个1479 bp的开放阅读框,编码492个氨基酸。氨基酸序列分析表明,板栗CAT1与枣（Ziziphus jujuba）、烟草（Nicotiana tabacum）、陆地棉（Gossypium hirsutum）等植物过氧化氢酶CAT1氨基酸序列有较高的相似性。蛋白分析表明,该蛋白分子量为56947.31 Da,理论等电点6.65,属稳定性亲水蛋白;亚细胞定位于过氧化氢酶体,存在30个磷酸化位点,无信号肽。二级结构以α螺旋、无规则卷曲为主。保守结构域预测表明,该基因编码蛋白属于Catalase-like超家族。本研究克隆获得了板栗CAT1基因,为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。      

高压热杀菌结合葡萄糖对枯草芽孢杆菌芽孢的杀灭效果

作者研究了葡萄糖结合高压热杀菌（HPTS）处理对枯草芽孢杆菌芽孢的杀灭效果及其内膜的影响,通过平板计数法、电导率测定、流式细胞术分析及傅里叶变换红外光谱分析等对枯草芽孢杆菌芽孢的灭菌效果、离子释放量、内膜通透性及膜结构稳定性进行了研究。结果表明：在600 MPa、75 ℃条件下,芽孢死亡量达到4.64个对数值,而在添加了质量分数60%的葡萄糖溶液后,芽孢的死亡量减少了约2个对数值。随着葡萄糖质量分数的升高,芽孢的离子释放量显著下降（P<0.05）;流式细胞术结果显示在600 MPa、75 ℃结合质量分数60%葡萄糖溶液处理下样品的阳性区域（M2）占比为92.88%,这表明芽孢内膜通透性显著增加（P<0.05）;通过分析样品在3 000~ 2 800 cm-1波段的傅里叶变换红外光谱,发现与单独HPTS处理相比,添加葡萄糖可以使芽孢内膜的—CH₂/—CH₃官能团吸收峰明显减弱,葡萄糖可有助于维持芽孢内膜结构的稳定性。由此可知,葡萄糖含量对HPTS灭活枯草芽孢杆菌芽孢的效果有重要影响。     

枯草芽孢杆菌脂肪酶LipA的生物信息学分析

该研究应用生物信息学方法对枯草芽孢杆菌脂肪酶LipA进行分析,旨在为LipA的后续研究奠定一定的理论基础。采用一系列在线网站或软件对LipA的一级结构、亲疏水性、基本特性、二级结构、特殊卷曲螺旋、模体以及富含脯氨酸（P）、谷氨酸（E）、丝氨酸（S）和苏氨酸（T）的PEST序列等进行预测和分析,并对三级结构进行同源建模,对其表面电位、可及性分布以及Ramachandran图等进行分析。枯草芽孢杆菌脂肪酶LipA是一种由212个氨基酸组成的稳定的脂溶性蛋白质,其亲、疏水性最强的区域分别为Lys75~Asn81和Val9~Leu17;不存在稳定的二聚体、三聚体卷曲螺旋和非PEST序列;有3种可能参与不同的生化反应的模体;有5段α-螺旋、6段β-折叠的α/β类蛋白;整体呈弱正电势;LipA的可及性和Ramachandran图表明建模得到的三维结构是合理、可靠的。该研究为后续对枯草芽孢杆菌脂肪酶LipA的分子设计和改造提供了一定的理论基础。     

酸土脂环酸芽孢杆菌DnaK基因克隆及生物信息学分析

利用同源克隆和基因组步移技术克隆得到酸土脂环酸芽孢杆菌(DSM 3922T)DnaK基因全序列,其ORF全长1 854 bp,编码617个氨基酸,推测其氨基酸序列与来源于A.acidocaldarius LAA1的分子伴侣蛋白DnaK同源性最高,相似性达86%。利用同源建模对DnaK的二级结构和超二级结构的预测结果显示,该伴侣蛋白主要由α-螺旋和β-折叠组成,基本不含无规则卷曲,具有耐热蛋白质的特征。     

利用芽孢杆菌发酵生产褐藻胶裂解酶的研究

芽孢杆菌在以褐藻酸钠为唯一碳源的培养基中进行驯化培养后,可在褐藻酸钠的诱导下分泌胞外褐藻胶裂解酶,经过发酵实验,其最佳氮源为蛋白胨和尿素,褐藻酸钠的较适浓度为0.5%~0.6%,在培养初始pH值为7.5、32℃、180r/min的条件下摇床发酵36h~84h时,产酶效果较好。     

红曲黄酒来源芽孢杆菌普鲁兰酶基因克隆和生物信息学分析

红曲黄酒酿造原料为大米,淀粉质量分数在70%以上,微生物来源淀粉酶系对淀粉的水解至关重要,影响甚至决定红曲黄酒酿造的原料转化过程和产品品质。从酒曲中分离具有淀粉水解能力的芽孢杆菌2?株,编号BHQ03和BHQ06,进行分子生物学鉴定并分别从2?株菌中克隆获得pulL1和pulL2,pulL3和pulL4共4?个I型普鲁兰酶基因,其中基因pulL1和pulL3均编码713?个氨基酸,序列相似度96.31%,基因pulL2和pulL4均编码852?个氨基酸,序列相似度99.77%。对基因pulL1和pulL2编码蛋白PulL1和PulL2进一步分析发现,二者均属于G13家族,具有4?段特征性保守区域。PulL2的N-端含有32 个氨基酸残基的信号肽序列,且催化活性位点存在突变（D407G）。结合文献研究和三维结构模拟,分析普鲁兰酶的具体催化过程。上述研究为科学解析红曲黄酒酿造的淀粉水解过程提供参考。     

凝结芽孢杆菌中耐热木酮糖激酶基因的克隆表达及生信分析

该研究以凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）IPE22为研究对象,通过聚合酶链式反应（PCR）扩增获得木酮糖激酶基因Bc-XK,将其与载体pET-30a连接后,在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)中进行诱导表达。然后采用镍柱亲和层析纯化重组酶Bc-XK,对基因Bc-XK及其编码的蛋白质进行生信分析。结果表明,纯化后重组酶Bc-XK的酶比活力为（20.56±3.31） U/mg,热稳定性好,在60 ℃保持活力180 min以上,具有很好的工业应用潜力。Bc-XK基因含有一个1 536 bp的开放阅读框,共编码511个氨基酸,其编码的蛋白质为亲水蛋白,等电点（PI）为5.46,分子质量为56.15 kDa,二级结构中α-螺旋、无规卷曲和延伸链含量丰富,3个催化位点分别为天冬氨酸-8、苏氨酸-11、天冬氨酸-239,高度保守。     

枯草芽孢杆菌胺氧化酶基因的克隆与表达

以细菌型豆豉工业发酵菌种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BJ3-2为材料,根据NCBI中菌株B. subtilis 168的胺氧化酶（AMO）基因序列设计同源引物,克隆获得菌株B. subtilis BJ3-2的胺氧化酶基因YobN序列。测序结果显示,YobN基因开放阅读框（ORF）长为1 437 bp,编码478个氨基酸,分子质量为53.79 ku,与菌株B. subtilis 168同源性达98%。目的基因克隆至原核表达载体,获得重组菌pET28a-YobN/BL21,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示,浓度为1.0 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）22 ℃诱导5 h,表达量最高达1.30 mg/mL。该研究为AMO活性的研究奠定了基础,对豆类发酵食品中生物胺的控制具有重要意义。     

The impact of high pressure and temperature on bacterial spores: inactivation mechanisms of Bacillus subtilis above 500 MPa

Abstract: High‐pressure thermal sterilization (HPTS) is an emerging technology to produce shelf stable low acid foods. Pressures below 300 MPa can induce spore germination by triggering germination receptors. Pressures above 500 MPa could directly induce a Ca⁺²‐dipicolinic acid (DPA) release, which triggers the cortex‐lytic enzymes (CLEs). It has been argued that the activated CLEs could be inactivated under HPTS conditions. To test this claim, a wild‐type strain and 2 strains of Bacillus subtilis spores lacking germinant receptors and one of 2 CLEs were treated simultaneously from 550 to 700 MPa and 37 to 80 C (slow compression) and at 60 to 80 C up to 1 GPa (fast compression). Besides, an additional heat treatment to determine the amount of germinated cells, we added TbCl₃ to detect the amount of DPA released from the spore core via fluorescent measurement. After pressure treatment for 120 min at 550 MPa and 37 °C, no inactivation was observed for the wild‐type strain. The amount of released DPA correlated to the amount of germinated spores, but always higher compared to the belonging cell count after pressure treatment. The release of DPA and the increase of heat‐sensitive spores confirm that the inactivation mechanism during HPTS passes through the physiological states: (1) dormancy, (2) activation, and (3) inactivation. As the intensity of treatment increased, inactivation of all spore strains also strongly increased (up to ?5.7 log₁₀), and we found only a slight increase in the inactivation of one of the CLE (sleB). Furthermore, above a certain threshold pressure, temperature became the dominant influence on germination rate. Practical Application: The continuous increase of high‐pressure (HP) research over the last several decades has already generated an impressive number of commercially available HP pasteurized products. Furthermore, research helped to provoke the certification of a pressure‐assisted thermal sterilization process by the U.S. FDA in February 2009. However, this promising sterilization technology has not yet been applied in industrial settings. An improved understanding of spore inactivation mechanisms and the ability to calculate desired inactivation levels will help to make this technology available for pilot studies and commercialization at an industrial scale. Moreover, if the synergy between pressure and elevated temperature on the inactivation rate could be identified, clarification of the underlying inactivation mechanism during HP thermal sterilization could help to further optimize the process of this emerging technology.     

枯草芽孢杆菌BJ3-2精氨酸脱羧酶基因speA的克隆与序列分析

根据GenBank中枯草芽孢杆菌168菌株的精氨酸脱羧酶基因speA序列设计特异性引物,提取Bacillus subtilis BJ3-2基因组DNA进行PCR扩增,并克隆至pGEM-T载体后测序。序列分析结果表明,Bacillus subtilis BJ3-2 speA基因ORF长为1 473 bp,可编码490个氨基酸,分子质量为53.53ku,基因登录号为KJ561348,与已报道枯草芽孢杆菌的speA基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性均达93%以上,精氨酸脱羧酶氨基酸序列系统进化树分析,发现Bacillus subtilis BJ3-2的ADC与Bacillus subtilis 168亲缘关系最近,属于典型的III型PLP依赖型鸟氨酸/赖氨酸/精氨酸脱羧酶家族成员。speA基因序列分析及其蛋白保守结构域的分析,为有效控制水豆豉产品中生物胺含量的研究提供了理论依据。     

枯草芽孢杆菌BJ3-2赖氨酸脱羧酶基因yaaO的克隆与序列分析

根据GenBank中的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 168菌株假定的赖氨酸脱羧酶基因（LDC）序列设计同源引物,提取枯草芽孢杆菌BJ3-2基因组DNA进行PCR扩增,并克隆至pGEM-T载体后测序.序列分析结果表明：Bacillus subtilis BJ3-2 yaaO基因开放阅读框（ORE）长为1 443bp,获得基因登录号为KJ561349,BLAST比对与已报道枯草芽孢杆菌的yaaO基因核苷酸序列及氨基酸序列同源性均高达90％以上,对赖氨酸脱羧酶氨基酸序列构建系统进化树分析,发现Bacillus subtilis BJ3-2的LDC与B.subtilis JS亲缘关系最近,SWISS-MODEL预测该蛋白的3D结构与鸟氨酸/赖氨酸/精氨酸脱羧酶蛋白相似性为39.22％,属于典型的Ⅲ型磷酸吡哆醛（PLP）依赖型鸟氨酸/赖氨酸/精氨酸脱羧酶家族成员.yaaO基因序列分析及氨基酸保守结构域的分析,为有效控制水豆豉产品中尸胺含量过高的研究提供了理论基础.     

枯草芽孢杆菌BJ3-2 S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因speD的克隆与序列分析

S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（SAMDC）是多胺合成过程中的限速酶。根据GenBank中枯草芽孢杆菌168菌株的S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因（speD）序列设计同源引物,PCR扩增Bacillus subtilis BJ3-2gDNA,并克隆至pGEM-T载体后测序。序列分析结果表明：B. subtilis BJ3-2 speD基因ORF为381 bp,可编码126个氨基酸,分子质量为13.87 ku,基因登录号为KJ561347,Blast比对,SAMDC基因和蛋白序列的同源性都达到90%以上。B. subtilis BJ3-2的SAMDC具有丙酮酸依赖型脱羧酶的酶原剪切结构域[GVSGVVIISESHLTIH]和保守结构域[TCG],属于典型的I类B型SAMDC家族。SAMDC在多胺生物合成过程中扮演重要的角色,是多胺合成途径中的关键酶。研究为控制发酵豆豉中生物胺含量奠定了基础。     

微波处理对枯草杆菌芽孢致死效果研究

通过比较不同温度和时间下微波和水浴对枯草杆菌黑色变种芽孢的致死效果,以探讨微波杀菌的热效应与非热效应。枯草杆菌黑色变种芽孢活化后,制成104CFU/mL 的孢子悬浮液,然后分别用微波和水浴加热对芽孢进行灭菌,最后测定灭菌后的单位体积菌落总数,计算致死率。结果表明,微波和水浴加热在92℃时的致死率都高于85℃时的致死率。在相同的温度和时间下,微波的杀菌效果好于水浴加热,存在非热效应。只有在92℃,20min 时,微波和水浴加热对芽孢的致死率差异不显著,非热效应不明显。     

枯草芽孢杆菌克隆与表达微小毛霉凝乳酶基因

从自制的酒酿利用酪蛋白培养基分离纯化到了一株产凝乳酶的微小毛霉菌株（ZZMZ-19）,从ZZM-19菌株的cDNA文库筛选到了两个凝乳酶基因chl和ch2并实现了凝乳酶基因ch1和ch2在枯草芽孢杆菌菌株（ZZMZ-01）中的的克隆与表达。chl和曲2阳性克隆菌株在酪蛋白培养基r1]发酵30h左右的时间凝乳酶酶活达到最人,分别为48．27SU／mL和41．02SU／mL,相比出发菌株发酵时间缩短了15h。用交联葡聚糖凝胶柱G100分离纯化其发酵卜清液后,用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测得CHII和cHIII分子草分别为32ku和30ku。