凋亡蛋白质的原核表达与纯化

目的构建来自鸡贫血病毒（CAV,chicken anaemia virus）VP3基因编码的凋亡蛋白质表达载体,在大肠杆菌中进行表达,并研究凋亡蛋白质的纯化和稳定性。方法PCR（polymerase chain reaction）获得正确编码VP3基因片断,构建表达质粒pET-28a-VP3在E．coli BL21（DE3）中表达。用Ni—NTA柱纯化可溶性目标蛋白质,并研究不同条件下凋亡蛋白质的稳定性。结果目标蛋白质在大肠杆菌中获得表达,纯化后蛋白质纯度高于90％,卡拉胶可明显提高重组蛋白质可溶状态下的稳定性。结论成功获得高纯度VP3可溶性蛋白质,增加了目标产物的稳定性,为进一步研究该蛋白质的临床应用奠定基础。     

海洋细菌Pseudoalteromonas sp.NJ631胶原蛋白酶的克隆与表达

对交替假单胞菌Pseudoalteromonas sp.NJ631基因组中潜在的胶原蛋白酶基因进行克隆与表达,并鉴定重组蛋白PNJC的酶活力。根据NJ631基因组序列草图,利用基因组信息发掘方法获得胶原蛋白酶功能提示的编码基因,进而利用高效表达质粒p ET28a构建重组表达系统。经IPTG诱导表达、亲和层析纯化获得重组蛋白纯化产物。以不溶性Ⅰ型胶原蛋白为底物,测定胶原蛋白酶酶活力。对Pseudoalteromonas sp.NJ631基因组信息挖掘,从中发现一条疑似编码胶原蛋白酶的基因序列,命名为Pnjc。该基因全长1 359 bp,GC含量45.62%,编码由452个氨基酸残基组成的约51 000大小的胶原蛋白酶。SDS-PAGE检测表明,胶原蛋白酶PNJC在0.2 mmol/L的IPTG诱导下得到高效表达。经过亲和层析获得纯化重组蛋白PNJC,蛋白质质量浓度约为1 mg/m L。酶活检测表明,PNJC的酶活力为160.34 U/mg,为标准品的70.48%。PNJC高酶活力表明,Pseudoalteromonas sp.NJ631来源的胶原蛋白酶具有重要的研究价值与工业开发潜力。     

昆明假单胞菌HL22-2海藻糖合酶基因的克隆、表达及酶学性质研究

采用热不对称交错聚合酶链式反应（Tail-PCR）克隆云南磷矿来源昆明假单胞菌（Pseudomonas kunmingensis）HL22-2的海藻糖合酶（TreS）基因HL22-2TreS,将该基因与表达载体pETM3C连接后在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）pLysS中进行异源表达,通过Ni-NTA柱纯化重组酶HL22-2TreS,并对其酶学特性进行分析。结果表明,HL22-2TreS基因全长3 336 bp,编码1 111个氨基酸,氨基酸序列与Genbank数据库中相关的海藻糖合酶具有极高的相似性。重组酶HL22-2TreS的分子质量约126 kDa,该酶的最适反应温度和pH值分别为40 ℃和7.0,在温度20～50 ℃及pH值6.0～9.0条件下比较稳定,Cu2+、Hg2+、Ba2+及Al3+对海藻糖合酶的活力有强烈的抑制效果。HL22-2TreS基因对麦芽糖和海藻糖的米氏常数（Km）分别为20.6 mmol/L和87.5 mmol/L,对麦芽糖具有更高的亲和性,更容易将麦芽糖转化成海藻糖。     

茶树单宁酶的原核表达及酶学性质表征

基于大肠杆菌的密码子偏好性，对茶树单宁酶基因CsTanA碱基进行优化，基因优化后GC含量为51.9%，密码子适应指数为0.8，优化前后基因序列的一致性为77.8%，以pET-30a为表达载体对优化基因进行重组表达及酶学性质分析。A600 nm约0.6的重组菌株以1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷在30 ℃诱导12 h，破碎上清液重组单宁酶rCsTanA比活力为0.35 U/mg，镍柱纯化后的rCsTanA比活力为1.53 U/mg，纯化倍数约为4.4。纯化重组单宁酶rCsTanA分子质量为39 kDa，其最适温度和最适pH值分别为40 ℃和7.0。不同金属离子浓度对酶活力的影响存在差异，在低浓度（1 mmol/L）条件下，K＋增强了rCsTanA 37.28%的酶活力，而Ag＋、Cu2＋和Fe3＋使该酶活力均丧失80%以上；而在高浓度（5 mmol/L）条件下，Cu2＋表现出完全抑制rCsTanA活性的特性。表面活性剂（十二烷基硫酸钠、吐温80和十六烷基三甲基溴化铵）和极性溶剂（甲醇、乙醇、丙三醇、异丙醇及丙酮）对rCsTanA活性具有较强抑制作用。本研究不仅实现了茶树单宁酶的表达和酶学性表征，同时也丰富了单宁酶资源，为植物单宁酶的进一步应用研究提供了必要的理论支撑。     

枯草芽孢杆菌精氨酸脱羧酶基因speA的表达与蛋白纯化

根据枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BJ3-2的精氨酸脱羧酶（ADC）的编码基因speA序列设计特异性酶切引物,克隆基因speA序列。测序结果显示,基因speA全长为1 473 bp,编码490个氨基酸,分子质量为58 ku。基因speA克隆至原核表达载体,获得重组菌pET28a-speA/BL21,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示,1.0 mmol/L的异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）28 ℃诱导4 h,上清液和菌体均能表达出ADC蛋白,上清液经纯化、透析、冷冻干燥可获得纯度97%的ADC酶,酶联免疫吸附检测（ELISA）ADC酶活为16 780 U/mg。为speA基因的表达、纯化及酶学性质研究奠定了理论基础。     

植物乳杆菌P-8羟基脂肪酸脱氢酶的克隆表达及活性鉴定

以植物乳杆菌P-8的基因组DNA为模板扩增出其羟基脂肪酸脱氢酶基因,对其进行生物信息学分析,结果表明该基因共编码286个氨基酸,蛋白质理论分子质量约为32 k Da,理论等电点为5. 15,不含跨膜区,是1个亲水性的细胞质蛋白。Ser、Thr、Tyr磷酸化位点个数分别为3、3、7。蛋白质的二级结构主要构成方式为α螺旋、无规则卷曲和β折叠。将此基因连接到p ET-28a(+)质粒载体中构建重组质粒p ET28a-DH,并转化入大肠杆菌E. coli Transetta (DE3)中获得重组大肠杆菌。重组菌在16℃条件下,经0. 1 mmol/L IPTG诱导16 h有可溶性表达,经Western Blot验证确定为重组羟基脂肪酸脱氢酶。通过镍柱亲和层析,得到纯化的重组酶。重组酶经初步活性检测,结果显示重组酶可以转化10-羟基-顺-12-十八碳烯酸为10-氧代-顺-12-十八碳烯酸,本研究为进一步探明植物乳杆菌P-8转化共轭亚油酸的机制奠定了基础。     

亮氨酸氨肽酶LapA在无孢黑曲霉中的重组表达优化及酶学性质

针对目前国产食品级亮氨酸氨肽酶的工业生产产量不高的现状,将米曲霉、黑曲霉和酱油曲霉的5 个亮氨酸氨肽酶基因（lapA、lap1O、lap2、lap1S、lap1N）在低蛋白背景的无孢黑曲霉HL-1中进行重组表达,通过信号肽替换对其编码区进行改造,利用杂合启动子PnaII及营养缺陷标记pyrG构建表达载体,并基于规律间隔成簇短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）/Cas9工具设计亮氨酸氨肽酶的基因组定点整合策略,获得高活力的亮氨酸氨肽酶表达菌株,重组菌株LapA-C的亮氨酸氨肽酶活力达到11 701.2 U/mL,比未利用CRISPR工具的LapA-T重组表达菌株的酶活力（2 476.0 U/mL）提高了约3.7 倍。此外,通过融合6×His标签实现了重组亮氨酸氨肽酶LapA的纯化,并对其进行了酶学性质研究：蛋白质大小约为35.0 kDa,重组亮氨酸氨肽酶LapA最适pH值为8.5,最适温度为65 ℃。综上所述,本研究基于CRISPR策略成功实现了亮氨酸氨肽酶在黑曲霉中的高效重组表达。     

宏基因组文库新型β-葡萄糖苷酶的筛选、克隆及酶学性质分析

利用宏基因组文库方法,通过功能筛选法从文库中筛选到一个新型β-葡萄糖苷酶基因bgl2238（GenBank：KU320675.1）,对新基因进行生物信息学分析和原核表达,并研究其酶学性质。结果表明,该基因全长2238bp,可编码745个氨基酸,通过氨基酸序列分析,预测bgl2238蛋白分子质量为80.67kDa,pI值为4.95,是一种结构较稳定、疏水性高且无信号肽序列的酸性蛋白质;经同源性分析,发现其与来源于Bacteroides thetaiotaomicron的β-葡萄糖苷酶具有58%的相似性,属于GH3超家族和GH3C超家族酶。将重组质粒pET-32a（＋）-bgl2238转化入Escherichia coli BL2l（DE3）细胞进行异源表达,酶学性质测定结果显示,以对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside,pNPG）为底物,β-葡萄糖苷酶bgl2238最适反应pH值和温度分别为6.10、44℃,此时该酶最大比活力达到29.1U/mg;且在4～50℃范围内,热处理β-葡萄糖苷酶bgl22384h后仍保留70%以上的酶活力,热稳定性较好;其动力学参数Vmax为576μmoL/（L·min）,Km为0.296mmol/L;不同浓度的K＋、Na＋、Fe2＋、Mg2＋、Mn2＋、Ca2＋、Co2＋和Ni2＋对酶活力均有较大促进作用,其中Fe2＋对bgl2238酶活力的促进作用最大,10mmol/LFe2＋使相对酶活力高达260%,而重金属离子Ag＋、Hg2＋及Cu2＋对酶活力有抑制作用。bgl2238具有良好的酶学性质,可以尝试应用于工业上纤维素降解的生产。     

甜菜树贝壳杉烯合酶基因的克隆与原核表达

本文作者研究了赤霉素合成途径中的关键酶-贝壳杉烯合酶,对其功能的研究可以为以后优化品种提供基因层面的基础。首先通过RACE-PCR技术,从甜菜树叶片中克隆得到贝壳杉烯合酶基因(Ent-kaurene synthase gene,Yl KS)的全长c DNA,共2 512 bp(Gen Bank登录号为KP872698),其ORF长度为2 232 bp,共编码743个氨基酸,预测蛋白质相对分子质量大小为84 987,蛋白质等电点为5.264,表明该蛋白质呈酸性。将该基因构建到表达载体pET32a中,得到重组质粒pET-32a-Yl KS。通过将p GG/An2、p IRS和重组质粒pET-32a-Yl KS 3个质粒共转入菌株BL21(DE3)中,得到重组菌株,并进行发酵。通过SDS-PAGE分析发现,重组蛋白成功得到了表达。最后通过对发酵产物进行萃取,并使用GC-MS进行检测,确定了该基因所编码的酶确实是贝壳杉烯合酶。     

一种黑曲霉高耐热β-葡聚糖酶基因的克隆、表达及重组酶性质分析

通过RT-PCR克隆、鉴定了黑曲霉中编码1种葡聚糖酶基因eglA6,所编码的重组酶蛋白命名为AneglA6。通过密码子优化提高了AneglA6在巴斯德毕赤酵母中的表达水平,对重组酶进行纯化并研究酶学性质,重组酶表观分子量约为52 ku。以大麦葡聚糖为底物时,重组酶比酶活为12 450. 6 U/mg;以CMC-Na为底物时,酶活是1 645. 7 U/mg;以酵母葡聚糖等β-1,3-葡聚糖为底物时,重组酶未表现出明显的活力。重组酶最适温度为75℃,在75℃和70℃下半衰期分别为1. 9和4. 6 h。AneglA6最适pH为4. 0,在pH 3. 0～5. 5范围内具有酶活力的50%以上。AneglA6是一种在酸性和高温条件下有较高活力和稳定性的耐热内切-β-1,4-葡聚糖酶。     

代谢工程改造谷氨酸棒杆菌合成四氢嘧啶

为了获得四氢嘧啶生产菌株并利用此菌株提高四氢嘧啶产量,以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）野生菌株ATCC13032为研究对象,以赖氨酸积累量为评价指标,强化了天冬氨酸-β-半醛合成代谢流;通过阻断赖氨酸输出通道LysE,表达不同来源的四氢嘧啶操纵子ectABC,获得了四氢嘧啶生产菌株;通过强化天冬氨酸转氨酶和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）再生途径,进一步提高四氢嘧啶产量。结果表明,构建了一株高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌工程菌株LYS-3,赖氨酸积累量为28.48 g/L;表达操纵子HEectABC的谷氨酸棒杆菌ECT-3四氢嘧啶产量达到17.21 g/L;过表达基因aspC和ECpntAB谷氨酸棒杆菌ECT-6,摇瓶发酵四氢嘧啶产量达到21.85 g/L。研究结果可为天冬氨酸-β-半醛衍生物的生物合成提供参考。     

Characterization of milk coagulating properties from the extract of Withania coagulans

Plant aspartic proteinases (APs) from Withania coagulans were extracted by using NaCl (0.85%) and were characterized by pH, temperature stability, rennet strength and CaCl₂ supplementation. Additionally, the milk-clotting enzyme was partially purified by fractional precipitation with ammonium sulphate and acetone followed by column chromatography of the most active fraction, giving specific activity of 12 307.6 U/mg. The maximum enzyme activity was observed at 4.25 pH and 37°C, which suggested its use in making cheese requiring moderate temperatures (Mozerella, Cheddar). The enzymatic activity increases as the concentration of CaCl₂ increases and decreases with the increase of temperature. SDS analysis showed the presence of a single unique band having a molecular weight of 66 KDa.     

不同连接肽在硫酸软骨素酶 ABC I重组表达中的应用研究

硫酸软骨素酶ABC I（ChSase ABC I）是一类能够将硫酸软骨素、软骨素、透明质酸等糖胺多糖降解为寡糖及不饱和二糖的裂解酶。该研究将硫酸软骨素酶ABC I基因与麦芽糖结合蛋白（MBP）基因分别用FFFFF和RRRRR两种连接肽连接，并克隆到pMAL-c2X载体上，在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)高效表达。结果表明，重组酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I的酶活和比酶活分别为716.5 IU/L发酵液和1.15 IU/mg蛋白，重组酶MBP-RRRRR-ChSase ABC I的酶活和比酶活分别为741.0 IU/L发酵液和1.13 IU/mg蛋白。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果表明，重组酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRR-ChSase ABC I的分子质量均为130 kDa，并且都为可溶性蛋白。     

Application of the FLP/FRT system for conditional gene deletion in yeast Saccharomyces cerevisiae

The yeast Saccharomyces cerevisiae has proved to be an excellent model organism to study the function of proteins. One of the many advantages of yeast is the many genetic tools available to manipulate gene expression, but there are still limitations. To complement the many methods used to control gene expression in yeast, we have established a conditional gene deletion system by using the FLP/FRT system on yeast vectors to conditionally delete specific yeast genes. Expression of Flp recombinase, which is under the control of the GAL1 promoter, was induced by galactose, which in turn excised FRT sites flanked genes. The efficacy of this system was examined using the FRT site-flanked genes HSP104, URA3 and GFP. The pre-excision frequency of this system, which might be caused by the basal activity of the GAL1 promoter or by spontaneous recombination between FRT sites, was detected ca. 2% under the non-selecting condition. After inducing expression of Flp recombinase, the deletion efficiency achieved ca. 96% of cells in a population within 9 h. After conditional deletion of the specific gene, protein degradation and cell division then diluted out protein that was expressed from this gene prior to its excision. Most importantly, the specific protein to be deleted could be expressed under its own promoter, so that endogenous levels of protein expression were maintained prior to excision by the Flp recombinase. Therefore, this system provides a useful tool for the conditional deletion of genes in yeast.     

大豆皮天冬氨酸蛋白酶的提取、纯化与鉴定

从大豆加工副产物——大豆皮的高值化利用出发,以大豆皮为原料,在纤维素酶辅助提取大豆皮蛋白质的基础上,利用CM-Sepharose柱离子交换层析纯化大豆皮蛋白粗提物,用SDS-PAGE分辨大豆皮蛋白粗提物和纯化后的蛋白质,对电泳凝胶分辨出来的蛋白条带用基质辅助激光解析电离飞行时间二级质谱(MALDI-TOF-TOF MS)进行鉴定,并测定了其在pH 2~6范围内的酶活性,结果表明首次从大豆皮中纯化鉴定出类猪笼草蛋白酶I大豆天冬氨酸蛋白酶,得率为233 mg/kg,纯化后的类猪笼草蛋白酶I大豆天冬氨酸蛋白酶在pH 3时对血红蛋白的比活力最高,为62.1 U/mg。     

凝结芽孢杆菌混合碳源乳酸发酵研究

为了更好的研究工业乳酸发酵中的分解代谢物阻遏效应,在实验室规模反应器对凝结芽孢杆菌混合碳源乳酸发酵进行不同通气量、p H、中和剂等条件的发酵特性研究,并研究了不同金属离子、渗透压等条件对饥饿状态下凝结芽孢杆菌自溶的影响。结果表明：凝结芽孢杆菌葡萄糖+海藻糖混合碳源乳酸发酵呈现明显的分解代谢物阻遏效应,且发酵可分为葡萄糖消耗阶段、有机酸消耗阶段和海藻糖消耗阶段。不同发酵条件在葡萄糖消耗阶段对菌体生长和乳酸生成影响较小,但对发酵后期海藻糖利用阶段菌体生长和乳酸合成有明显影响。在海藻糖消耗阶段,通气量为7.2 L/h时有较高的底物消耗速率和产酸速率;用NaOH作为中和剂在p H6.5时海藻糖消耗速率和乳酸生成速率均高于pH6.0,而p H5.5时不利用海藻糖且不生产乳酸;与NaOH作为中和剂相比,在p H6.5条件下Ca(OH)₂作为中和剂使海藻糖消耗速率和乳酸生成速率分别提高21.0%和28.3%。发现Ca₂₊、Mg₂₊等二价离子确实对菌体自溶有一定的缓解作用,且Na₊能在饥饿状态下维持菌体的活性,为研...     

凝结芽孢杆菌中与乳酸生产相关的乳酸脱氢酶基因的研究

对5株凝结芽孢杆菌乳酸生产情况进行研究,并以凝结芽孢杆菌ATCC7050作为乳酸脱氢酶基因研究的对象,确定得出其乳酸生产关键的乳酸脱氢酶基因。结果表明:凝结芽孢杆菌生产的乳酸分两种类型:L型乳酸和D型乳酸,但主要以L型乳酸为主,其光学纯度达到97%以上。在凝结芽孢杆菌ATCC7050基因组中存在的ldhL1、ldhL2和ldhD三种乳酸脱氢酶基因中,ldhL2基因没有检测到转录信号,而ldhD转录水平很低,在生长对数期ldhL1基因的转录水平是ldhD基因转录水平的68倍,这说明ldhL1基因是凝结芽孢杆菌ATCC7050乳酸生产的关键性基因。本研究确定了凝结芽孢杆菌ATCC7050乳酸合成中最主要的乳酸脱氢酶基因,对凝结芽孢杆菌代谢研究和基因改造奠定了基础。     

太平洋鳕鱼排酶解产物的制备及其钙螯合活性研究

目的以太平洋鳕鱼排为原料,制备具有良好钙螯合活性的酶解产物,并对其促钙吸收转运功效进行评价。方法采用动物蛋白水解酶、中性蛋白酶和菠萝蛋白酶分别进行水解,比较3种酶解产物的水解度与蛋白回收率,确定最佳水解酶,并研究酶解产物的钙螯合活性与促钙吸收转运活性。结果经动物蛋白水解酶制备的酶解产物水解度与蛋白回收率最高。当酶解时间为320 min时,该酶解产物的钙螯合活性最高。氨基酸分析表明谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、丝氨酸和苏氨酸等特定氨基酸所占比例较高。该酶解产物对Caco-2细胞无毒性作用,能够明显促进钙转运率。结论太平洋鳕鱼排酶解产物具有较好的钙螯合活性与促钙转运活性。     

Purification and characterization of a novel aspartic protease from basidiomycetous yeast Cryptococcus sp. S-2

An aspartic protease (Cap1) was purified from basidiomycetous yeast Cryptococcus sp. S-2 (FERM ABP-10961) using HiTrap DEAE FF column and HiTrap Q HP column chromatography with azocasein as a substrate. Cap1 has a molecular mass of 34 kDa on SDS-PAGE. It was stable up to 50°C with maximum activity at 30°C. Maximum proteolytic activity was observed at pH 5.0. Cap1 was stable in the pH range 3.0-7.0. Its enzyme activity was strongly inhibited by pepstatin A, an inhibitor of aspartic proteases, indicating that Cap1 is an aspartic protease. Cap1 hydrolyzed protein substrates, including BSA, hemoglobin, α-casein, β-casein, and κ-casein. It showed activity on synthetic substrates, such as MOCAc-Gly-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-D-Arg-NH? and MOCAc-Ala-Pro-Ala-Lys-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-NH?. Hydrolysis of the oxidized insulin B chain followed by amino acid sequencing analysis of the cleavage products revealed that 9 of its 30 peptide bonds were hydrolyzed by Cap1. This result was similar to that observed with pig pepsin A and human pepsin A. Cap1 also exhibited milk-clotting activity. We cloned the cDNA of CAP1 gene, which contained a 1254 bp open reading frame encoding a protein of 417 amino acid residues. Homology search in the NCBI database revealed that the amino acid sequence of Cap1 showed less than 39% identity to other known proteins. Therefore, we proposed that Cap1 is a novel aspartic protease.