家蚕znfhit基因的克隆表达及序列分析

在对家蚕蛹 cDNA文库的测序中发现了znfhit(zinc finger HIT)的 EST序列(GenBank登录号 DY230769).经过比对发现znfhit全长为1019bp,由297bp的 5'端非编码区序列(5'UTR)、462bp的开放读码框(ORF)和260bp的3'端非编码区序列(3'UTR)组成.将该基因的cDNA和家蚕基因组序列比对,此基因由3个外显子和2个内含子组成.ZNFHIT蛋白的疏水性最大值为1.533,最小值为-3.267,且不含跨膜区域.用PCR方法扩增获得znfhit基因,将其克隆至质粒pET-28a上,构建重组质粒pET-znfhit,并在大肠杆菌中大量表达,经镍离子亲和层析纯化得到重组蛋白,质谱鉴定其分子量为21.11KD,为后续研究其功能提供了条件.     

异源包装家蚕核型多角体病毒的特性研究

利用PCR方法分离AcMNPV多角体蛋白基因及其启动子的特异片段 ,将该基因片段正确克隆到转移载体pBacPAK(API 4)中 ,得到重组转移载体pBacOAc(API4)。将它与已缺失多角体蛋白基因的BmNPV(即 :CrBK)基因组DNA共转染BmN细胞 ,将AcMNPV多角体蛋白基因及慈菇蛋白酶抑制剂基因定向克隆到CrBK基因组中 ,得重组病毒BmNPV(OAc -API4)。发现该重组病毒能被AcMNPV多角体蛋白所识别 ,并形成多角体包埋型病毒 ;CrBK粒子能被正确包装 ,同时也能表达慈菇蛋白酶抑制剂。比较了该重组病毒在家蚕细胞及家蚕幼虫中的增殖情况 ,发现它的芽生型病毒能正常感染家蚕细胞和经皮下注射的家蚕幼虫 ,然而其包埋型病毒不能经口感染家蚕幼虫。表明NPV的经口感染与多角体蛋白的种类有关。     

家蚕新基因Bmbzj的表达、抗体制备及亚细胞定位

在自建的家蚕蛹cDNA文库中发现了一条新基因序列,GenBank登录号为DY231426.该基因是一个同源性很低的基因,未发现保守结构域,将其命名为Bmbzj.Bmbzj基因全长661bp,由99 bp的5'端非翻译区序列(5'UTR)、486 bp的开放读码框(ORF)和76 bp的3'端非翻译区序列(3'UTR)组成.生物信息学分析结果表明蛋白Bmbzj可能存在跨膜区和信号肽.将该基因插入到载体pGEX-4T-3中,构建了该基因编码的重组质粒pGEX-4T-3-Bmbzj,转化大肠杆菌Rosetta后,IPTG诱导表达了该融合蛋白,并利用亲和层析的方法纯化该重组蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体.亚细胞定位实验结果表明该蛋白只存在于细胞质中.     

信号肽引导源基因在昆虫表达系统中的分泌表达

将杆状病来源的gp67信号肽引导的慈姑蛋白酶抑制剂(API)基因与植物来源的慈姑蛋白酶抑制剂信号肽引导的慈姑蛋白抑制剂(API)基因，分别克隆到昆虫杆状病毒转载体pBacPAK8中，通过共转染将它们分别整合到昆虫病毒表达载体Bm—BacPAK6中，将获得的重组病毒CrBK—API2和CrBK—bpAPI4分别接种家蚕(Bombyx mori)细胞、家蚕幼虫及蛹体中，慈姑蛋白酶抑制剂得到了高效表达。从家蚕细胞的表达来看，外源表达产物大多存在于细胞外的上清液中；从家蚕幼虫体内表达来看，信号肽能引导外源基因高效表达，且表达产物的90％以上能分泌到细胞外；蛹体中的表达情况与幼虫中的相似，但表达产物出了不均一的现象，从表达产物的分子量测定来看，这两种信号肽在表达过程中都没有被切除。     

假单胞菌产弹性蛋白酶基因的克隆与表达

从假单胞菌(Pseudomonas sp.)XZG36中克隆弹性蛋白酶基因,构建原核表达载体,实现其在大肠杆菌(Escherichia coli)中的高效表达,并对表达产物进行酶学性质分析,为微生物发酵生产弹性蛋白酶奠定基础.以假单胞菌基因组DNA为模板,PCR扩增弹性蛋白酶基因,并将其开放阅读框(ORF)克隆至融合表达载体pET30a(+)进一步IPTG诱导表达;表达产物经His·Bind亲和层析纯化后对弹性蛋白酶进行酶学性质分析.实验成功克隆了弹性蛋白酶基因,DNA基因片段为1672bp、编码497个氨基酸残基的多肽,与预计长度相符合;实现了其在E.coli中的高效表达,表达量约占菌体总蛋白的20%;经SDS-PAGE分析,相对分子质量为48 000,与预期的一致;提纯后的表达蛋白SDS-PAGE分析可见单一条带,纯度可达92%以上.表达蛋白具有良好活性.     

嗜酸乳杆菌AS1.1854亚油酸异构酶基因的克隆与序列分析

将GenBank中已报道的罗伊氏乳杆菌亚油酸异构酶基因对已公布的嗜酸乳杆菌NCFM基因组全序列做tblast,找到一个同源编码框.参照此编码框的核苷酸序列及pQE30质粒图谱特性设计上、下游引物,利用PCR法扩增嗜酸乳杆菌AS1.1854亚油酸异构酶基因,并克隆到pQE30质粒载体上进行测序.分析测序结果表明,扩增得到的目的DNA全长1 776 bp,G C含量为37.5%,共编码591个氨基酸,理论相对分子质量67.5kDa.用Signal P3.0对其N端前70个氨基酸序列进行分析,结果表明,第20~40位氨基酸有较强的疏水性.不过,N端前70个氨基酸的C值、S值和Y值并不高,最有可能的酶切位点位于第45位与第46位氨基酸之间,但预测其被切割的可能性概率低于1%.可以推断,在嗜酸乳杆菌AS1.1854亚油酸异构酶的N端氨基酸序列中不存在信号肽序列.     

哈茨木霉几丁质酶基因的cDNA克隆及表达

为了研究全新几丁质酶基因Chit37(DQ647957)的特性与功能,将该基因在大肠杆菌中进行了外源表达.通过构建哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌丝生长期的cDNA文库及对部分表达序列标签序列的测定与生物信息学分析,成功获得了基因Chit37的全长cDNA序列.该基因的编码框长度为1032bp,编码343个氨基酸,理论分子量为36.6kDa.采用PCR扩增的方法克隆该基因并将其构建到原核表达载体pET28(a+)上,构建了原核表达载体pET-Chit37并转化宿主菌BL21(DE3),菌落PCR及酶切鉴定均证实转化子的正确性,重组蛋白经IPTG诱导后获得表达.优化的表达条件为终浓度0.1mM IPTG诱导培养4h.     

小麦麦谷蛋白高分子量亚基N端序列克隆及原核表达分析

为了探究麦谷蛋白高分子量亚基(HMW-GS)的N-末端结构域对面粉品质的影响,以HMW-GS的1Dx5的N-末端结构域(1Dx5-N)为目的基因进行序列克隆及原核表达,研究大肠杆菌BL21(DE₃)为载体菌进行转化,鉴定阳性克隆,以IPTG和乳糖作为诱导剂,并通过正交试验,筛选最佳的诱导条件。结果表明：1Dx5-N序列基因全长267 bp,共编码氨基酸89个,预测分子质量为16.211 kDa;经转化、阳性克隆鉴定后,证明了该表达载体能够在大肠杆菌中稳定遗传;IPTG和乳糖均可诱导1Dx5-N进行表达;SDS-PAGE表明1Dx5-N重组蛋白多为包涵体蛋白;IPTG诱导蛋白最佳表达条件为温度30℃,浓度0.6 mmol/L,诱导时间16 h;乳糖诱导蛋白最佳表达条件为温度30℃、质量浓度9 g/L、诱导时间16 h。通过对比发现,乳糖可代替IPTG诱导1Dx5-N蛋白表达。     

哈茨木霉丝/苏氨酸蛋白磷酸酶基因的克隆表达

为深入研究丝/苏氨酸蛋白磷酸酶的功能,从哈茨木霉cDNA文库中克隆丝/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2A)基因,并成功构建到原核表达载体pET28a,在大肠杆菌中表达.表达产物经SDS-PAGE电泳分析,在40.5kDa处出现特异性条带.在22℃以0.5mmol/L IPTG诱导时,目的蛋白大部分以可溶形式存在,在37℃以1.0mmol/L IPTG诱导时,目的蛋白则大部分以包涵体存在.全长cDNA序列为1286bp,5′非编码区91bp、3′非编码区237bp,编码327个氨基酸,没有信号肽.本研究为PP2A基因的功能验证奠定基础,以便进一步研究蛋白磷酸酶的功能,从而获得更多关于哈茨木霉蛋白磷酸酶作用机制的信息.     

提高碱性磷酸酶在E.coli胞内表达的可溶性及活性

以E.coli DH5a基因组为模板PCR扩增得到无信号肽的碱性磷酸酶基因片段,与胞内融合表达型T栽体连接得到重组质粒,转化表达宿主E.coli BL21(DE3)和E.coli origami(DE3),经0.1 mM IPTG诱导表达,超声破碎细胞后,SDS-PAGE分析可溶性,融合蛋白在E.coli origami(DE3)中的可溶蛋白含量比E.coli BL21(DE3)中高.融合蛋白的可溶部分经Ni2+螯合亲和纯化,纯化后E.coli origami(DE3)中蛋白活性比E.coli BL21(DE3)中明显提高,达到1 614.3U/mg蛋白.