烟草抗病新品系“转基因NC89”的大田试验

对转“黄瓜花叶病毒外壳蛋白（ＣＭＶＣＰ）＋卫星ＲＮＡ”嵌合基因的工程ＮＣ８９的Ａ、Ｂ、Ｃ三个纯系以及转“ＣＭＶＣＰ＋烟草花叶病毒外壳蛋白（ＴＭＶＣＰ）”嵌合基因的工程ＮＣ８９Ｔ纯系进行了田间抗病性鉴定及农艺性状测试，结果表明：不论在人工接毒或自然发病条件下，转基因ＮＣ８９的花叶病病情指数都明显低于未转基因ＮＣ８９对照，其中Ｂ纯系的抗病性最高，在上述条件下，相对防效分别达到８０．２％、９２．９５％。在农艺性状方面，转基因ＮＣ８９较对照有所改善，但种性未变。     

快速选育抗黄瓜花叶病毒的转基因烟草纯合品系

以来源于烟草推广品种ＮＣ８９花药的单倍体苗为转化受体，同时导入了黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）的外壳蛋白（ＣＰ）基因和卫星ＲＮＡ（Ｓａｔ—ＲＮＡ）基因，在获得的共１１２株转化植株中，有３株在人工接种浓度高达２００μｇ／ｍｌ的ＣＭＶ时仍不发病。通过０．４％秋水仙素处理使之加倍并收获种子，而后连续两代在大田条件下鉴定其ＣＭＶ抗性及综合农艺性状，并与单独导入了ＣＭＶＣＰ基因或ＣＭＶＳａｔ—ＲＮＡ基因的转基因ＮＣ８９品系及未转化的对照ＮＣ８９进行了比较。结果表明，同时表达ＣＭＶ外壳蛋白和卫星ＲＮＡ的双单倍体转基因植株，在Ｒ—１代即表现出一致的可稳定遗传的ＣＭＶ抗性，抗性水平较单独表达ＣＰ或Ｓａｔ—ＲＮＡ的转基因ＮＣ８９提高１倍左右。     

快速选育抗黄瓜花叶病毒的转基因烟草纯合品系

以来源于烟草推广品种ＮＣ８９花药的单倍体苗为转化受体，同时导入了黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）的外壳蛋白（ＣＰ）基因和卫星ＲＮＡ（Ｓａｔ－ＲＮＡ）基因，在获得的共１１２株转化植株中，有３株在人工接种浓度高达２００μｇ／ｍｌ的ＣＭＶ时仍不发病。通过０．４％秋水仙素处理使之加倍并收获种子，而后连续两代在大田条件下鉴定其ＣＭＶ抗性及综合农艺性状，并与单独导入了ＣＭＶＣＰ基因或ＣＭＶＳａｔ－ＲＮＡ基因的转基因ＮＣ     

山东省烟草病毒病毒原鉴定

１９９６年鉴定出５种为害烟草的病毒，它们是马铃薯Ｙ病毒（ＰＶＹ）、黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）、烟草蚀纹病毒（ＴＥＶ）、普通花叶病毒（ＴＭＶ）、马铃薯Ｘ病毒（ＰＶＸ）。其中，烟草蚀纹病毒病（ＴＥＶ）和马铃薯Ｘ病毒病（ＰＶＸ）在山东烟区未见正式报道。烟草马铃薯Ｙ病毒病和烟草黄瓜花叶病毒病是当前生产上发病率较高、造成损失较大的两种病害；同时，黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）和马铃薯Ｙ病毒（ＰＶＹ）的复合侵染也是当前生产上亟待解决的主要问题。     

抗赤星病烟草的防卫基因的表达与基因组DNA结构的变化

用赤星病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｍａｔａ）毒性菌株产生的ＡＴ毒素诱导烟草,可使寄主获得对赤星病８０．４％的系统抗性,比病菌弱毒株ＴＢＡ１６孢子诱导的效果高约２０％。烟草品种ＮＣ８９心叶叶碟在含ＡＴ毒素６０％和７０％的ＭＳ培养基上经２轮胁迫筛选和植株再生,得到抗病品系ＮＣ８９－ＴＴ。用５种防卫基因的ｃＤＮＡ探针检测了不诱导、受ＡＴ毒素诱导、受病菌弱毒株激发子诱导的ＮＣ８９和诱导与不诱导的ＮＣ８９－ＴＴ第４代植株５种基因的转录活性,结果表明,苯丙氨酸氨裂解酶（ＰＡＬ）基因在ＮＣ８９中不能组成型表达,可被ＡＴ毒素诱导激活,但不受激发子诱导;病程相关蛋白（ＰＲ蛋白）ＰＲ－ｌａ、查尔酮合成酶（ＣＨＳ）、脂氧合酶（ＬＯＸ）基因在ＮＣ８９中表现为诱导转录或诱导后转录活性增强;这４种基因都在ＮＣ８９－ＴＴ中组成型表达     

转抗虫基因烟草NC89纯合品系的获得及大田抗虫试验

经过连续三代抗虫性鉴定，选育出了表达直豆胰蛋白酶抑制剂（ＣＰＴＩ）的广谱抗虫转基因烟草ＮＣ８９纯合品系ＮＣ８９Ｌ２７－１９和ＮＣ９８Ｌ２７－２１。在大田对两个纯合系的抗虫性状进行了研究。①人工接种烟青虫；②害虫自然发生，不施杀虫剂；③在同一虫害防治阈值时施用杀虫剂。结果表明：转基因品系可稳定表达抗虫性状。在不施用杀虫剂时，田间相对抗虫效果在６４．７％～７０．５％之间；在施用杀剂时，可减少用药量４０％左右。转基因品系仍维持原ＮＣ８９主要植物学特性及农艺性状，为ＮＣ８９品种的抗虫改良品系。     

烤烟高抗赤星病气候斑点病普通花叶病新种质CV87选育利用研究

ＣＶ８７新种质资源是中国农业科学院烟草研究所用抗花叶病、赤星病、气候斑点病主抗源ＣＶ５８作母本与美国引进抗根茎病害优质品种主亲源（Ｇ２８×ＮＣ８２）Ｆ１组合做父本多亲本复交系统育成。主要农艺性状遗传稳定。综合经济性状良好。具兼高抗赤星病（病指５．８８～６．１９）、气候斑点病（发病率０．５６％～６．３３％）、普通花叶病（发病率和病指０）突出特点,均属高抗型。但感染野火病。对赤星病其抗性略优于抗病对照品种（系）ＣＶ５８。而感病对照品种ＮＣ８９,赤星病病指达４２．３０～４８．９３,气候斑点病发病率达３０．３３％～５８．６０％,均属感病型。ＣＶ８７是目前烟草抗赤星病、气候斑点病、普通花叶病育种最优良多抗源的新种质资源,在病区应用ＣＶ８７进行大面积生产试验示范,防病效果和效益均十分显著。     

水杨酸和氨基酸对烟草黄瓜花叶病毒病防治效果的研究

研究了植物内源生理活性物质水杨酸和氨基酸对烟草黄瓜花叶病毒病（ＣＭＶ）的防治效果。叶面ＣＭＶ接种后的次日，叶面分别以水杨酸、水杨酸和氨基酸混合溶液以及水杨酸和氨基酸配合微量元素进行一次叶面处理。上述药剂处理对改善烟草营养生长、提高光合作用活性有积极作用。同时提高了叶片组织中具有抗病保护功能的过氧化物酶活性，使感染ＣＭＶ的烟草发病率和病情指数下降。其中氨基酸与水杨酸混合处理效果最好，一次叶面处理后ＣＭＶ防治效果达５０％。水杨酸对烟草病毒病（主要是ＴＭＶ）防治效果已有研究，但氨基酸的病毒病防治作用尚未见报道，值得今后进一步研究。     

转马铃薯Y病毒复制酶基因烟草的获得及抗病性分析

重组克隆ＤＮＡ用ＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ双酶切得到马铃薯Ｙ病毒ＮＩｂ基因，将其插入质粒ｐＲＯＫ２相应切点中构成植物表达载体。用重组质粒ｐＲＯＫ２转化农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａ－ｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４菌株，叶盘法将ＮＩｂ基因转入烤烟品种ＮＣ８９的染色体，获得抗卡那霉素的转化再生植株。经抗性筛选、ＰＣＲ检测、无性扩繁和大量重复抗病鉴定，结果表明，转化烟草植株ＤＮＡ中整合了外源目的基因，且表现抵抗２０μｇ／ｍｌＰＶＹＮ的侵染，ＥＬＩＳＡ分析认为抗性植株无病毒累积，初步筛选出对ＰＶＹＮ侵染具有较高抗性的转基因烟草植株。     

某些因素对烤烟病毒病(PVY、CMV、TMV)发病程度的影响调查

１９９６年在河南省宝丰县、襄城县和叶县，花叶病普遍较常年严重，故此对２０种类型烤烟大田的病毒病（ＰＶＹ、ＣＭＶ、ＴＭＶ）发病率和病情指数进行了调查。每种因素两种类型烟田的病毒病发病率差异和病情指数差异用新复全距法（ＳＳＲ）进行检验。结果表明，麦烟套种、地膜覆盖、距公路较远种烟和轮作显著减轻病毒病；ＮＣ８９烟田和砂质土烟田分别比Ｇ８０、Ｋ３２６烟田和粘质土烟田病毒病显著减轻；幼苗剪叶、土施微肥（Ｚｎ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｂ）、移栽相对早晚和浇水相对早晚对烤烟病毒病发病程度无显著影响。     

利用花药培养系统选育烟草抗赤星病品系

在接种有烟草赤星病菌的双层培养基上及含赤星病菌毒素的选择培养基上，获得了烟草推广品种ＮＣ８９的花药培养苗。温室内采用离体叶片法对这些花培苗进行了赤星病抗性鉴定，结果约１８％－４２．９％的植株抗性较对照ＮＣ８９有所提高。选其中４株抗性较高且农艺性状与对照ＮＣ８９相近的单株经秋水仙素加倍后收获了种子，然后于１９９２、１９９３年分别在赤星病病圃及大田条件下对其Ｒ—１代、Ｒ—２代植株进行了赤星病抗性及农艺性状测试。两年试验结果一致表明：在染色体加倍以后，所选植株的后代在基因型上已完全纯合，赤星病抗性较对照ＮＣ８９有较大提高，农艺性状也有所改善，而且均稳定遗传，是不同于原ＮＣ８９的烟草新品系。其中两个品系对赤星病的田间相对防效分别达５７．８％和５３．４％，且农艺性状优异，在生产上具有广泛应用前景。     

烤烟新品种龙烟101的选育及特征特性

龙烟101是以优质、抗烟草普通花叶病毒病（tobaccomosaicvirus,TMV）、适应性强为育种目标,采用烤烟品种龙江925为母本,抗TMV品种CV91为父本,杂交后经系谱法选育而成的免疫TMV烤烟新品种。多年试验结果表明,龙烟101遗传性状稳定,植株结构及田间群体结构合理,田间生长势强、耐连作;免疫TMV,中抗黑胫病,靶斑病较轻,感青枯病、CMV和PVY,综合抗性与对照NC89相当;主要经济性状和原烟外观质量优于对照NC89,化学成分较适宜,感官质量与对照NC89相当。综合评价,龙烟101在品质、产量和抗病、抗逆性等方面均较好,适宜东北烟区和黄淮部分烟区种植。     

沉默2b基因获得抗黄瓜花叶病毒(CMV)的转基因烟草

  目的  本研究利用dsRNA技术沉默2b基因,获得烟草品种云烟85的T₁代转基因抗CMV株系。  方法  构建含有CMV 2b部分序列反向重复的植物表达载体pBIN-2b（r）-In-2b（i）,以农杆菌介导的叶盘法转化普通烟草（Nicotiana tabacum）品种云烟85。  结果  抗性筛选获得112株T₀代转基因阳性植株,接种CMV进行抗病性鉴定,发现有46株T₀代转基因植株表现为抗病,其他66株表现为感病。Tas-ELISA检测表明,T₀代抗病烟株的病毒积累量显著低于感病烟株。选取10个T₀代抗病株系繁殖,接种CMV鉴定T₁代抗病性,发现部分T₁代烟株发生一定比例的抗感分离,T₁代抗性株率为46.7%~100%。Real-time PCR检测T₁代烟株,发现T₁代抗病烟株CMV 2b基因RNA积累水平显著低于感病烟株。  结论  基于以上策略及实验,获得抗CMV转基因烟草株系。      

过氧化物酶活性与烟草对马铃薯Y病毒抗性关系的研究

本文测定了接种马铃薯Y病毒脉坏死株系后烟草抗病转基因品系9608(转PVY-NIb的NC89)和非转基因NC89叶片组织透性和过氧化物酶活性,并对过氧化物酶同工酶带谱进行了分析。结果表明,抗病转基因9608和感病NC89叶片的组织透性与叶片内过氧化物酶活性的变化趋势一致,两者在接种后均呈增高趋势,但感病NC89的增高幅度明显高于抗病转基因9608;接种后,转基因9608和非转基因NC89的过氧化物同工酶均出现了一条新酶带,9608的新酶带在接种后第2d开始出现,而NC89的新酶带则在接种后第6d开始出现,且明显强于9608。      

烟草黄瓜花叶病毒抗性位点发掘

烟草黄瓜花叶病毒（CMV）是烟草生产中主要病害之一,发掘其抗性位点,培育抗病品种是最有效的策略之一。本研究利用高抗CMV烤烟品种台烟8号为轮回亲本,优质感病烤烟品种NC82为供体亲本,配置BC1F1群体。在此基础上,利用组织快繁技术对200份BC1F1群体进行快繁,苗期人工接种CMV,获得稳定、可靠的表型数据。利用SSR标记构建遗传图谱,进而利用单向方差分析和完备复合区间作图法发掘CMV抗性位点。结果表明,单向方差分析法分别检测到5个与发病率性状和病情指数性状相关的标记;完备复合区间法共定位到5个QTL,其中2个与发病率性状相关,3个与病情指数性状相关。相关定位结果对开展分子育种辅助改良烟草CMV抗性具有一定意义。     

烟草与黄瓜花叶病毒互作中过氧化氢酶活性的变化

研究了12个不同抗性水平的烟草品种接种黄瓜花叶病毒前后过氧化氢酶活性的动态变化及其与烟草抗病性的关系。结果表明,接种病毒后抗、感品种的过氧化氢酶活性总体水平比对照降低,但酶活性的动态变化规律与烟草抗病性之间的相关性并不显著。利用DPS数据处理系统分析表明:酶活性变化差值及其平均值与病情指数之间均不存在显著相关性,说明以接种前后植物体内酶活性的变化值作为抗病性鉴定的指标在烟草-黄瓜花叶病毒体系中是不可行的。     

转TMV-cp基因烟草对环境影响的安全性研究

以转TMV-cp烟草品种NC89为试验材料,在温室和隔离圃中进行了转基因烟草对环境的安全性评价。试验结果未发现来自转基因材料中的外源基因飘移或整合到杂草、细菌、真菌和病毒上。      

烤烟新品种龙江925的选育及其特征特性

龙江925是以高抗TMV的6603为母本、K326为父本杂交后经系谱法选育而成的常规纯系品种。该品种田间生长势强,较耐低温和干旱,高抗或免疫TMV,中感黑胫病、赤星病、黄瓜花叶病（CMV）、根结线虫和马铃薯Y病毒（PVY）,感青枯病。较易烘烤,烤后烟叶柠檬黄到橘黄,9～13叶位还原糖含量21.00%,总糖24.74%,植物碱1.79%,总氮1.74%,K₂O含量1.55%,Cl含量0.40%,淀粉含量5.51%,内在化学成分在适宜范围内。主要经济指标、外观质量和感官质量优于对照NC89。该品种抗逆性较强,烤后烟叶质量较好,适合北方干旱地区或重茬地块种植,注意适时早栽烟,预防马铃薯Y病毒病。     

烤烟新品种龙江986的选育及其特征特性

为选育抗烟草普通花叶病毒病（Tobacco mosaic virus,TMV）的烤烟新品种,以优质烤烟品种NC89为母本,高抗TMV的品种吉烟7号为父本,经系谱法定向选育出烤烟新品种龙江986。经多年试验结果表明,龙江986田间生长势强,遗传性状稳定,对TMV免疫,中抗根结线虫,综合抗病性与对照NC89相当。烟叶主要经济性状和外观质量优于NC89,物理特性与感官质量与对照NC89相当,烟叶质量符合中式卷烟的需要。龙江986是一个抗TMV、品质和经济效益兼顾较好的优良烤烟新品种,适宜在东北烟区和黄淮部分烟区推广种植。      

病毒抑制剂防治烟草花叶病田间试验

为了筛选防效较好的病毒抑制剂 ,对目前市售的防治烟草花叶病 (TMV和CMV)的 8种主要化学药剂和 4种植物提取物进行了防治烟草花叶病的田间试验。试验结果表明 ,2 %“菌克毒克”AS和4 0 %“病毒灵”WP具有明显的预防效果 ;3.95 %“病毒必克”WP、4 0 %“病毒灵”WP、商陆 (Phytolaccaaci nosa)的乙醇提取物和香菇 (Lentinusedodes)的水提取物具有一定的治疗效果。