冻干麻疹-风疹二联活疫苗的研制

目的　制备冻干麻疹－风疹二联活疫苗,以利于 ＣＶＩ工作的开展。方法　用麻疹沪１９１疫苗株和 风疹ＢＢＤⅡ疫苗株,中量配制冻干麻疹－风疹二联活疫苗,进行全面检定及稳定性试验。结果　两种抗原经自检及 国家检定均达到单价活疫苗的质量要求,在３７℃、２２℃和４～８℃放置不同时间稳定性良好。结论　本研究结果与 国内外报道一致。     

聚乙烯吡咯烷酮稳定剂风疹减毒活疫苗的研制

目的研制安全有效的不含人血白蛋白稳定剂的风疹减毒活疫苗。方法将风疹减毒活疫苗毒种RA27/3株按适当比例接种单层人二倍体细胞MRC-5株,使用无血清、无蛋白的CDM培养基培养病毒,收获病毒液,加入聚乙烯吡咯烷酮作为病毒稳定剂,制备疫苗原液,加入冻干保护剂,制备5批冻干疫苗,进行各项检定。另取1批原液样品,分别加入聚乙烯吡咯烷酮和人血白蛋白作为病毒稳定剂,制成疫苗,进行各项检测。结果5批疫苗各项指标均符合《中国药典》三部(2005版)要求。同1批原液制备的聚乙烯吡咯烷酮与人血白蛋白稳定剂疫苗的病毒滴度和热稳定性无明显差异。37℃放置6周,两种稳定剂疫苗的病毒滴度均为3.63LgCCID50/ml。结论聚乙烯吡咯烷酮稳定剂风疹减毒活疫苗质量符合《中国药典》三部(2005版)的要求。     

水痘-带状疱疹减毒活疫苗毒种(Oka株)制备方法的改进

目的改进水痘-带状疱疹减毒活疫苗毒种(Oka株)的制备方法,提高毒种的病毒滴度及稳定性,延长保存时限。方法分别采用原法(病毒吸附感染法)和改进的方法(病毒混合感染法)制备水痘-带状疱疹病毒Oka株工作种子批,采用蚀斑法检测病毒滴度及-70℃保存0、1、6、12个月的稳定性,并各制备出3批疫苗进行全面检定。结果采用病毒混合感染法和病毒吸附感染法制备的毒种病毒滴度分别为6.6和6.5 lgPFU/ml,病毒混合感染法制备的毒种在-70℃以下保存12个月,病毒滴度无明显下降;病毒吸附感染法制备的毒种-70℃以下保存6个月,病毒滴度下降明显。两中方法制备的水痘减毒活疫苗成品的各项检定结果均符合要求,病毒滴度及37℃稳定性无明显差异。结论采用病毒混合感染法制备的毒种提高了病毒滴度和-70℃保存的稳定性。     

麻疹、流行性腮腺炎二联活疫苗中量试制

用麻疹沪191株和流腮S79株中量试制麻疹、流腮二联活疫苗,对疫苗原液的配制比例、二联疫苗与单价疫苗的病毒滴度和稳定性进行比较。结果提高流腮疫苗原液的比例可获得较好效果;9批麻腮二联疫苗全部达到现行单价疫苗规程要求;二联疫苗在4～8℃保存18个月的稳定性与单价疫苗基本一致。     

多层细胞工厂在水痘-带状疱疹减毒毒种(OKa株)传代中的应用

目的改进水痘-带状疱疹减毒活疫苗毒种(OKa株)培养方法,提高毒种的均一性及稳定性,延长保存时间。方法分别采用原培养方式(2 L方瓶培养法)和改进的培养方式(40层细胞工厂)制备水痘-带状疱疹病毒OKa株工作种子批,检测病毒滴度及-65℃以下保存1、3、6、12个月的稳定性,并用该种子批分别制备3批水痘减毒活疫苗后,进行疫苗成品的全面检定。结果 2 L方瓶培养法和40层细胞工厂制备的水痘-带状疱疹病毒工作种子批OKa-2015[1]C和OKa-2015[2]C的病毒滴度分别为6.1和6.0 lg PFU/ml;无菌试验、支原体检查、鉴别试验、外源因子检查结果均符合《中国药典》三部(2015版)相关要求;-65℃以下保存12个月,滴度均无明显下降。两种培养方式各制备的3批疫苗成品的各项检定结果均符合《中国药典》三部(2015版)相关要求,各批疫苗的病毒滴度及37℃热稳定性差别不明显。结论 40层细胞工厂制备水痘-带状疱疹病毒毒种(OKa株),-65℃以下长期保存具有稳定性,该培养方式可提高毒种的均一性,降低微生物污染风险。     

乙脑风疹联合减毒活疫苗病毒间的相容性

目的研究乙脑风疹联合减毒活疫苗中乙脑病毒和风疹病毒的相容性。方法将乙脑病毒SA14-14-2疫苗株制备的乙脑减毒活疫苗原液与风疹病毒RA27/3疫苗株制备的风疹减毒活疫苗原液按体积比1∶1比例混合,加入保护剂,冻干制成乙脑风疹联合减毒活疫苗。采用BHK21细胞蚀斑法测定联合疫苗中的乙脑病毒滴度,细胞病变法检测风疹病毒滴度;通过鉴别试验、热稳定性试验、乙脑疫苗免疫原性试验、安全性试验、异常毒性试验、无菌试验以及基因稳定性分析观察联合疫苗病毒间的相容性。结果联合疫苗的乙脑和风疹病毒滴度与单价疫苗的病毒滴度变化在检测误差的允许范围内;联合疫苗于37℃放置7 d,与放置前相比,风疹病毒和乙脑病毒的滴度值下降分别小于1.0 LgCCID50/ml和1.0 LgPFU/ml,符合《中国药典》三部(2010版)要求;联合疫苗中的风疹疫苗对乙脑疫苗的免疫原性无明显的干扰效应;鉴别试验、安全性试验、异常毒性试验、无菌试验结果均符合《中国药典》三部(2010版)要求;联合疫苗在BHK21细胞上传代5次后,乙脑和风疹病毒基因序列均未发生变化。结论乙脑风疹联合减毒活疫苗中的乙脑和风疹病毒具有较好的相容性,本实验为乙脑风疹联合疫苗的进一步研制奠定了基础。     

甲型肝炎灭活疫苗(L-A-1减毒株)的制备及其免疫原性

目的用甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)L-A-1减毒株制备甲型肝炎灭活疫苗,并检测其免疫原性。方法用细胞工厂培养人胚肺二倍体细胞(2BS株),感染L-A-1减毒株增殖病毒,收获含病毒的细胞,经裂解、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)6000沉淀、三氯甲烷抽提、凝胶过滤层析纯化后,甲醛灭活,氢氧化铝佐剂吸附,制备3批试验疫苗。按照《中国药典》三部(2010版)中甲肝灭活疫苗标准进行各项检定,并进行小鼠效力试验,计算半数有效稀释倍数;将疫苗于37℃存放5、10、15、20、25和30 d,考察疫苗的加速稳定性。结果甲型肝炎病毒经提取纯化后,抗原回收率达80%以上,杂蛋白去除率达95%以上;制备的3批试验疫苗各项检定结果均符合《中国药典》三部(2010版)要求;小鼠效力试验结果显示,半数有效稀释倍数分别为进口疫苗和国产疫苗的1.25~1.40和2.02~2.26倍;37℃保存30 d,疫苗的体外相对效力仍在合格范围内。结论制备了纯度较高的甲型肝炎灭活疫苗,其在小鼠体内具有良好的免疫原性,为进一步规模化生产甲型肝炎灭活疫苗奠定了基础。     

复制型重组痘苗活载体疫苗生产工艺研究

目的研究复制型重组痘苗活载体疫苗的生产工艺。方法通过在病毒-细胞比(MOI)、不同培养时间、培养温度、碳酸氢钠含量的条件下培养复制型重组痘苗病毒,确定适用于重组痘苗活载体疫苗的生产工艺。以确定的生产工艺制备3批疫苗,并进行各项检定。结果以MOI为1∶750,培养液中加入7.5%碳酸氢钠的比例为1.0%,培养温度为37℃,培养时间为72 h左右,获得疫苗的病毒滴度最高。按此生产工艺生产的3批疫苗,病毒滴度均在107PFU/ml以上,经检定各项指标均合格。结论确定了复制型重组痘苗活载体疫苗的生产工艺。     

风疹减毒活疫苗病毒滴定国家参考品的制备及标定

目的制备风疹减毒活疫苗病毒滴定国家参考品,并进行标定。方法选择国内风疹减毒活疫苗生产毒株BRDⅡ制备风疹减毒活疫苗参考品,并对其进行鉴别试验、水分含量、病毒滴度及无菌检查等检定;检定合格后,组织4个实验室对候选参考品和国际参考品的病毒滴度协作标定,计算实验室内和实验室间变异系数;对候选国家参考品进行稳定性分析。结果制备的候选参考品鉴别试验、无菌检查结果均符合规定,水分含量为1.7%,病毒滴度为4.6lgCCID50/ml。经协作标定,风疹减毒活疫苗病毒滴定候选国家参考品的病毒滴度为(4.56±0.52)lgCCID50/ml,实验室内变异系数在1.25%～2.94%之间,实验室间变异系数为5.72%;国际参考品的病毒滴度为(3.96±0.08)lgCCID50/ml,实验室内变异系数在1.19%～3.21%之间,实验室间变异系数为2.04%。经考察,该参考品具有较好的稳定性。结论制备的参考品符合作为风疹减毒活疫苗病毒滴定国家参考品的要求。     

无明胶保护剂在麻疹风疹联合减毒活疫苗中的应用

目的研制一种安全有效的无明胶保护剂,并应用于麻疹风疹联合减毒活疫苗的制备。方法制备麻疹风疹联合减毒活疫苗原液,取同一批麻疹病毒原液,分别加入不同成分和配比的无明胶保护剂,制成成品,以含明胶保护剂作对照,检测成品外观、病毒滴度及水分,确定保护剂的成分,再确定保护剂的配比。将麻疹与风疹病毒原液混合,加入筛选出的无明胶保护剂,制备麻疹风疹联合减毒活疫苗(共3批),同时制备3批含明胶保护剂对照疫苗。按《中国药典》三部(2010版)要求对联合疫苗原液、半成品、成品进行检定;分别将制备的联合疫苗于2～8℃放置3和6个月,检测疫苗外观、病毒滴度及水分的变化,于37℃放置1、2、3、4周,检测病毒滴度的变化;按《中国药典》二部(2010版)要求进行过敏试验。结果含海藻糖和右旋糖酐成分的保护剂为首选保护剂。制备的无明胶保护剂联合疫苗原液、半成品及成品的各项检定指标均符合《中国药典》三部(2010版)要求;无明胶保护剂联合疫苗成品于2～8℃放置6个月的水分和病毒滴度及37℃放置4周的病毒滴度与对照组疫苗相比,差异均无统计学意义(P>0.05);注射了无明胶保护剂联合疫苗的豚鼠在试验期内均未发生过敏反应,符合《中国药典》二部(2010版)的要求。结论无明胶保护剂对麻疹和风疹病毒具有较好的保护作用。     

疫苗毒种支原体检测中去除本病毒干扰方法的探索

目的探索疫苗毒种支原体检测中去除本病毒干扰的方法。方法分别采用非敏感细胞直接接种法、特异性抗血清中和法及离心加中和法处理21株疫苗毒种样品后,评价去除本病毒干扰的效果。结果21株疫苗毒种中,13株可通过非敏感细胞法去除本病毒干扰;6株可通过特异性抗血清中和法去除干扰;2株可通过离心加中和法去除干扰。应用上述3种方法检测161批疫苗毒种,均能有效去除本病毒干扰。结论非敏感细胞直接接种法、特异性抗血清中和法及离心加中和法可针对不同毒种去除本病毒的干扰,适用于疫苗毒种的支原体检测。     

国产冻干麻疹腮腺炎风疹联合减毒活疫苗的接种反应和免疫原性观察

目的观察冻干麻疹腮腺炎风疹联合减毒活疫苗的接种反应和免疫原性。方法分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期进行,分别选择7～15岁和8～18月龄儿童接种国产MMR疫苗,同时设进口MMR疫苗、单价麻疹、腮腺炎、风疹疫苗对照,进行接种反应和免疫原性观察。结果Ⅰ期7～15岁接种国产MMR疫苗的11人中,仅3人发生局部弱反应,反应率为27.3%;8～11月龄接种国产MMR疫苗的26人中,发热率和皮疹反应率分别为11.5%、15.4%,其中高热率为3.8%。Ⅱ、Ⅲ期观察的1188名8～18月龄儿童中,接种国产MMR疫苗发热率为10.69%,皮疹反应率为3.64%,局部反应率为0.44%,其他反应率为0.22%。与对照疫苗比较,仅发热率高于腮腺炎疫苗及风疹疫苗,且差异有统计学意义,其他反应差异均无统计学意义。接种国产MMR疫苗后,麻疹、腮腺炎、风疹HI抗体阳转率和抗体GMT分别为99.5%、85.9%、100%和1∶57、1∶4.2、1∶890。与对照疫苗比较,麻疹抗体GMT国产MMR疫苗高于进口MMR疫苗和麻疹疫苗,抗体阳转率国产MMR疫苗高于进口MMR疫苗,且差异有统计学意义;腮腺炎抗体GMT国产MMR疫苗低于进口MMR疫苗,且差异有统计学意义,其他各疫苗组差异均无统计学意义。结论国产MMR疫苗具有良好的安全性和免疫原性。     

麻疹乙脑二联活疫苗的试制

应用麻疹沪191株制备的疫苗原液与乙脑SA14-14-2株制备的疫苗原液混合制成二联疫苗，经试验其病毒滴度与其同批单价苗差异无显著意义（P＞0．2），联合苗与相应的标准抗血清均有高度的特异性，免疫小鼠后以乙脑JEP3株强毒攻击的保护效价与其单价乙脑苗差异亦无显著意义（P＞0．5）。表明两株病毒无干扰现象。试制3批二联苗，经全面检定，结果完全符合现行规程要求。其中病毒滴度麻疹苗为4．5LogCCID50／ml，乙脑苗为6．11～6．18LogPFU／ml，安全试验表明，二联合苗的弱毒力特性稳定。     

北京株(VZV84-7)水痘病毒在麻疹-腮腺炎-风疹-水痘联合减毒活疫苗中的稳定性

目的观察北京株(VZV84-7)水痘病毒在麻疹-腮腺炎-风疹-水痘(measles-mumps-rubella-varicella,MMRV)联合减毒活疫苗中的稳定性。方法将4批MMRV联合减毒活疫苗成品分别置37℃保存4周、2~8及-15~-20℃保存24个月,采用蚀斑形成单位(plaque forming unit,PFU)试验检测不同时间点疫苗中水痘病毒滴度。将水痘病毒原液于-80℃反复冻融1、2、3次后,分别与麻疹、腮腺炎、风疹各单价疫苗原液按一定比例配制成MMRV联合减毒活疫苗,进行冻干,采用PFU试验分别测定冻干前、冻干后基础水痘病毒滴度及冻干后于37℃热稳定1周的水痘病毒滴度。结果 4批MMRV联合减毒活疫苗成品于37℃保存4周后,水痘病毒滴度下降范围为0.5~0.7 lg PFU/ml;于2~8℃保存24个月,水痘病毒滴定最高达4.6 lg PFU/ml,最低为4.4 lg PFU/ml;于-15~-20℃放置24个月,水痘病毒滴度基本保持不变,均达合格标准(不低于3.6 lg PFU/ml)。水痘病毒原液经1、2、3次冻融后制备的MMRV,通过37℃热稳定1周,水痘病毒滴度分别为4.9~4.6、4.6~4.4、4.5~4.3 lg PFU/ml,均达到合格标准(不低于3.6 lg PFU/ml)。结论北京株(VZV84-7)水痘病毒在MMRV联合减毒活疫苗中稳定性良好。     

冻干水痘减毒活疫苗的生产工艺

目的以MRC-5人二倍体细胞为基质,建立制备Oka株水痘减毒活疫苗的生产工艺。方法Oka株水痘病毒在MRC-5细胞上培养,收获细胞,经冻融,超声波,纯化,澄清,冻干等工序,生产8批疫苗,按规程要求进行检定。结果 各项指标全部合格,制品质量稳定,37℃ 7d热稳定性良好,儿童免疫后抗体阳转率为92.7％。结论 工艺流程合理,制品质量符合WHO规程要求,免疫后副反应甚微,免疫原性良好。     

Ⅰ型Ⅲ型脊髓灰质炎减毒活疫苗（人二倍体细胞）实际储运中的稳定性

目的考察口服Ⅰ型Ⅲ型脊髓灰质炎减毒活疫苗(bOPV液体疫苗)和Ⅰ型Ⅲ型脊髓灰质炎减毒活疫苗糖丸(bOPV糖丸)的运输、冻融及不同温度下的稳定性。方法将3批bOPV液体疫苗分别按陆路运输(途中模拟10次开门卸货入库)和航空运输要求进行运输稳定性试验和反复冻融5次稳定性试验,3批bOPV糖丸按陆路运输要求(途中模拟10次开门卸货入库)进行运输稳定性试验后,均于-20℃入库储存,分别于入库后第6、12、18个月取样检测病毒滴度,第24个月进行全检。同时将6批bOPV液体疫苗和6批bOPV糖丸分别于-20℃保存36个月、2～8℃保存12个月、25℃放置4周、37℃放置8 d,于不同时间点取样检测病毒滴度。采用细胞培养半数感染量(cell culture infective does 50%,CCID50)法检测上述样品病毒综合滴度及Ⅰ型、Ⅲ型分型滴度,按企业注册制造及检定规程评价疫苗效价稳定性。结果 bOPV液体疫苗及bOPV糖丸2～8℃运输及bOPV液体疫苗反复冻融5次后,于-20℃保存24个月,疫苗各项质量指标检测结果均符合质量标准要求;-20℃保存36个月、2～8℃保存9个月、25℃放置1周、37℃放置2 d后,病毒滴度均符合企业注册制造及检定规程。结论 bOPV在常规储运条件下具有良好的稳定性,反复冻融对bOPV液体疫苗稳定性影响有限,但储存温度和时间会对bOPV的稳定性产生不同程度的影响,在实际储运过程中应避免将其长期暴露于温度偏移情况下。     

重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)冻干参考品的研制

目的制备重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)冻干参考品,用于重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)的效力评价。方法选取检定合格的重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)原液,经协作标定表面抗原蛋白含量后,加入氢氧化铝佐剂和冻干保护剂,冷冻干燥制备重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)冻干参考品,并按《中国药典》三部(2010版)要求进行各项检定。经10次独立试验测定冻干参考品小鼠效力,采用Reed-Münch计算ED50值;将冻干参考品置4℃(8周)、37℃(4和8周)后分别检测疫苗效力,分析其稳定性,依据Q10法进行效期推测;并对2个生产企业10批疫苗进行效力测定,分析其适用性。结果制备的冻干参考品各项指标均符合规定,小鼠ED50均值为0.183μg,CV为50.5%;该CHO细胞效力冻干参考品蛋白含量定为20μg/ml,规格为10μg/0.5 ml;冻干保护剂、冻干工艺对乙型肝炎疫苗(CHO细胞)的效力影响较小,冻干参考品在37℃放置不同时间,效力变化不明显,表明冻干参考品稳定性较好,有效期约为7年;10批疫苗中,不合格率为10%,表明该参考品可用于乙型肝炎疫苗(CHO细胞)效力质控。结论制备的冻干参考品可作为重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)效力检定的质控参考品。     

吸附无细胞百白破-重组乙型肝炎(CHO细胞)联合疫苗的中试工艺

目的探讨吸附无细胞百白破-重组乙型肝炎(CHO细胞)联合疫苗(DTaP-HBV)的中试工艺。方法通过不同的配比条件,探索DTaP-HBV联合疫苗的最佳中试工艺。以此工艺制备3批DTaP-HBV,进行各项指标的检定及稳定性试验。结果配方以无细胞百日咳疫苗原液18μgPN/ml,精制白喉类毒素25Lf/ml,精制破伤风类毒素7Lf/ml,重组乙肝疫苗原液20μg/ml为宜;DTaP-HBV的稀释液选用0.85%NaCl溶液吸附效果较好,各抗原间无干扰作用;不同配合方式对四联疫苗的效力影响不大。3批DTaP-HBV的各项检定指标均符合《中国药典》三部(2005版)要求,且稳定性良好。结论已筛选出DTaP-HBV联合疫苗的最佳中试工艺,以此工艺制备的疫苗安全、稳定、有效。     

重组戊型肝炎疫苗菌种库的建立及其稳定性

目的建立重组戊型肝炎疫苗工程菌三级种子库,并分析其稳定性。方法将工程菌株HEV179/BL21(DE3)复苏活化,经全面检测合格后冻干保存即为原始种子库;原始种子库传代扩增,经全面检定合格后,冻干保存即为主种子库;主种子库经传代扩增和全面检定合格后,甘油冻存即为工作种子库。对三级种子库进行全面检定,并对工程菌进行冻干及甘油冻存稳定性、甘油冻存时间稳定性及质粒稳定性检测。结果建立的三级种子库经全面检定合格;菌种冻干稳定性、甘油冻存稳定性、甘油冻存时间稳定性及质粒稳定性指标均合格,菌种生长特性、遗传和表达稳定性均未发生变化。结论成功建立了HEV179/BL21(DE3)工程菌三级种子库,菌种稳定性良好,适用于重组戊型肝炎疫苗的工业化生产。     

冻干甲型肝炎腮腺炎联合疫苗的研制

目的　制备冻干甲型肝炎 腮腺炎联合疫苗。方法　采用L A 1株和S79株减毒株制备的甲型肝炎减毒活疫苗和腮腺炎活疫苗原液 ,按一定比例配比 ,加入适宜保护剂制备成冻干制剂 ,参照 2 0 0 0年版《中国生物制品规程》进行全面检定及稳定性试验。结果　两种抗原检定结果符合规程单价疫苗质量标准 ,37℃和 2～ 8℃放置不同时间稳定性良好 ,联合疫苗中两种抗原无干扰。结论　成功制备了冻干甲型肝炎 腮腺炎联合疫苗