植物乳杆菌YM-2菌株胞外多糖生物合成工艺优化

对从云南传统发酵豆豉分离得到的植物乳杆菌YM-2(Lactobacillus plantarum YM-2)菌株胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)生物合成条件进行优化。首先对培养基成分中的碳源、氮源种类进行筛选;然后利用单因素试验分析碳源含量、氮源含量、培养时间以及培养温度对EPS产量的影响;最后采用Box-Behnken法进行四因素三水平响应面分析以确定其最优工艺条件。结果表明,植物乳杆菌YM-2菌株生物合成EPS最佳条件为碳源(葡萄糖)含量30 g/L、氮源(酵母粉)含量30 g/L、培养时间30.05 h、培养温度36.36℃,在此工艺条件下,植物乳杆菌YM-2 EPS产量为257.362 mg/L。     

干酪乳杆菌胞外多糖LCP1的流变性研究

通过对干酪乳杆菌LC2W胞外多糖LCP1溶液流变性质研究发现,高浓度LCP1溶液呈剪切变稀,低浓度时,剪切速率对黏度没有影响,溶液黏度随温度升高下降明显,pH对LCP1溶液黏度影响很小,盐可以降低LCP1溶液黏度,但黏度降低与盐浓度有关,通过黏弹性研究发现LCP1水溶液不能形成胶体,乌氏黏度计测得LCP1水溶液固有黏度[η]为1.930 dL/g。     

植物乳杆菌胞外多糖的分离纯化及其乳化特性

在脱脂乳中分别培养植物乳杆菌菌株YW11和菌株SKT109,经三氯乙酸除蛋白、离心、乙醇沉淀、透析、冷冻干燥得到胞外多糖粗品,再经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱和Sepharose CL-6B凝胶柱纯化,得到两种胞外多糖纯品。利用气相色谱法分析此两种多糖的单糖组成,并采用KBr压片法观察红外光谱,利用动态光散射方法测定多糖的流体力学半径（Rh）。结果显示：YW11胞外多糖的单糖组成为葡萄糖、半乳糖,其物质的量比为3.45∶1,流体力学半径为69.20 nm;SKT109胞外多糖的单糖组成为葡萄糖、半乳糖,其物质的量比为1.43∶1,流体力学半径为41.74 nm;YW11胞外多糖的乳化能力强于SKT109胞外多糖,但前者的乳化稳定性略低;两种胞外多糖分别与其他乳化剂之间具有一定的协同作用,乳化颗粒的半径主要集中在1～2 μm之间。本研究获得的植物乳杆菌胞外多糖在食品加工中具有潜在的应用前景。     

响应曲面法优化植物乳杆菌胞外多糖的醇沉工艺

利用单因素试验和响应曲面法对植物乳杆菌胞外多糖醇沉工艺参数进行优化研究。结果表明：醇沉时间、95%乙醇添加量、发酵液浓缩倍数与植物乳杆菌胞外多糖提取量存在显著的相关性;胞外多糖醇沉的最佳条件为：醇沉时间12.56h、95%乙醇添加量与发酵液体积比为3.9、发酵液浓缩倍数3.54倍,在此条件下理论预测最大胞外多糖提取量为323.11mg/L,验证实验条件下实际测得最大胞外多糖提取量为320.17mg/L,与预测值的相对误差为0.91%。     

副干酪乳杆菌VL8胞外多糖对巨噬细胞RAW264.7免疫激活作用研究

旨在研究副干酪乳杆菌VL8胞外多糖(Lactobacillus paracasei VL8 exopolysaccharides,VL8-EPS)对巨噬细胞RAW264.7的免疫激活作用。试验采用不同浓度的VL8-EPS作用于RAW264.7细胞,设空白对照组,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理组(终浓度为10μg/mL)和VL8-EPS处理组(终浓度为50、100、200、400、800μg/mL)。迪夫快速染色法观察细胞形态;比色法测定诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)活力;WST-1法测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力;微量法检测超氧阴离子(O2-)的含量;钼酸显色法检测过氧化氢(H2O2)的分泌量。结果表明,VL8-EPS能够改变细胞形态,剂量依赖性提高RAW264.7细胞内iNOS、SOD酶活力,促进细胞分泌O2^-和H2O2。在800μg/mL时,较空白对照组分别提高了104.64%、10.30%、666.87%、81.78%。说明VL8-EPS通过提高胞内酶活性及释放活性氧激活RAW264.7细胞从而发挥免疫增强作用。     

植物乳杆菌胞外多糖发酵条件的优化

目的：对植物乳杆菌胞外多糖的发酵条件进行优化。方法：采用Plackett-Burman法从影响植物乳杆菌胞外多糖(EPS)产量的14个因素中筛选出3个主要影响因素,然后通过响应面法探讨最优工艺参数。结果：影响植物乳杆菌胞外多糖产量的主要因素是蔗糖质量浓度、接种量以及发酵温度,其最佳条件为蔗糖质量浓度34g/L、接种量5%、发酵温度31℃,在此条件下发酵的植物乳杆菌胞外多糖产量达425.16mg/L。结论：应用Plackett-Burman设计和响应面法进行植物乳杆菌胞外多糖发酵条件的优化是可行的。     

植物乳杆菌胞外多糖的脱色及其体外抑瘤效应

研究大孔吸附树脂对植物乳杆菌胞外多糖的脱色工艺,并采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测植物乳杆菌胞外多糖EPS及单一组分EPS-1、EPS-2对大肠癌细胞株HT-29的体外抑瘤效应。结果表明,选择S-8树脂,树脂用量为4g/100mL,调节胞外多糖溶液的pH值为6,在25℃条件下,糖液质量浓度为2mg/mL,静态吸附4h后脱色率为72.58%,糖保留率为69.15%。植物乳杆菌胞外多糖EPS、EPS-1和EPS-2对大肠癌细胞HT-29的体外增殖均具有显著的抑制作用(P＜0.01),且呈现出良好的量效关系。     

乳酸杆菌肽聚糖的分离鉴定及其免疫活性

研究了乳酸杆菌细胞壁肽聚糖的分离、鉴定及其对肽聚糖生物活性的影响.实验获得了SDS处理粗细胞壁的适宜条件为SDS质量浓度8g/dL,处理时间为沸水浴10min.SDS结合胰蛋白酶和TCA处理,可有效去除乳酸杆菌中的非共价结合蛋白质及共价结合蛋白质.经化学分析鉴定,所提取的乳酸杆菌成分为肽聚糖,肽聚糖中丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和赖氨酸浓度分别为1.181,0.943,0.770和0.456mmol/g,是肽聚糖中的组分氨基酸.SDS结合TCA处理,方能较有效地去除DNA.TCA处理是去除细胞壁磷壁酸、脂磷壁酸的有效方法.此外,小白鼠腹腔巨噬细胞的吞噬实验、C3b受体实验以及血清溶菌酶活力实验证实,所分离纯化肽聚糖的免疫学活性未受影响.     

乳酸杆菌冻干发酵剂

以乳酸杆菌为菌种，进行单因素和响应面法实验优化得到制备冻干发酵剂的复合保护剂为：脱脂乳粉9．7g／dL，半胱氨酸0．03mol／L，谷氨酸钠3．2g／dL，所得冻干发酵剂存活率为89．5%。且该冻干发酵剂于4℃保存6个月后的存活率为66．4％。     

唾液乳杆菌L3生物合成纳米氧化锌的工艺研究

为获得晶体粒径为纳米级别且对致病菌有明显抑菌效果的纳米氧化锌产品,对乳酸菌生物合成纳米氧化锌的工艺条件进行探索。从断奶7～10 d健康仔猪的粪便中筛选出一株对高浓度锌离子具有耐受性菌株,并以此菌株为模板,氯化锌溶液为原料,分别研究了作用温度、作用时间、发酵后菌液的pH值、氯化锌原液的添加量四个因素对最终产品氧化锌的粒径、转化率及其对致病菌抑菌效果的影响。研究结果表明,当0.25M ZnCl2底物浓度、体系pH值为7.0,70℃水浴温度下作用25min时得到的氧化锌晶体粒径在70 nm左右,晶体形状均匀,且对大肠杆菌、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌等致病菌的抑菌效果较好,其最小抑菌浓度分别为0.024 mg/mL、0.029 mg/mL、0.016 mg/mL。将纳米氧化锌替代普通锌源添加在动物饲养中能有效改善猪仔生长性能。     

瑞士乳杆菌MB2-1胞外多糖发酵条件优化

对1 株分离自新疆赛里木酸奶中的瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus MB2-1）胞外多糖（exopolysaccharide,EPS）的发酵条件进行优化。利用单因素试验确定发酵温度、乳糖添加量、氮源种类及添加量、无机盐种类及添加量对其EPS产量的影响。采用Box-Behnken法对其中的三因素三水平进行响应面分析以确定其最优工艺条件。结果表明：L. helveticus MB2-1 EPS提取的最佳条件为发酵温度37 ℃、Mg2+添加量为质量浓度0.2 g/100 mL、大豆蛋白胨添加量为质量浓度2 g/100 mL,在此工艺条件下,L. helveticus MB2-1 EPS的产量达到801.2 mg/L。     

乳酸杆菌半连续式高密度培养的研究

研究了乳酸杆菌的半连续高密度培养,探讨更换新鲜培养基对菌体浓度、解除代谢产物抑制等的影响,结果表明,经3次培养后菌体浓度达到9.3×1012cfu/mL。并对3次培养过程进行动力学分析,设计了培养-分离耦合生物反应器,用于恒浊连续高密度培养。     

鼠李糖乳杆菌JAAS8胞外多糖生物合成基因的克隆和序列分析

根据已报道乳杆菌胞外多糖生物合成基因的同源性,利用其保守区设计引物,扩增出鼠李糖乳杆菌JAAS8RmlA基因部分序列,并通过染色体步移法扩增出Rml(ACB)的序列。获得了鼠李糖乳杆菌JAAS8胞外多糖生物合成基因4.1 kb序列片段,编码4个可读框。利用BLAST和ClustalX程序对获得序列进行生物信息学分析,预测其结构和功能。结果表明:该序列与已知鼠李糖乳杆菌胞外多糖生物合成基因具有高度同源性,RmlA、RmlC和RmlB基因与dTDP-L-鼠李糖前体的生物合成密切相关。     

鼠李糖乳杆菌JAAS8胞外多糖生物合成基因的克隆及生物信息学分析

根据已知乳杆菌胞外多糖生物合成基因的同源性,利用其保守区设计引物,扩增出鼠李糖乳杆菌JAAS8磷蛋白磷酸酶基因(wzb)序列,并通过染色体步移法克隆了鼠李糖乳杆菌 JAAS8 参与胞外多糖生物合成基因簇全部序列 (19.7kb),利用生物信息学方法预测了基因簇 16个阅读框的结构和功能。结果表明,该序列与已报道的乳杆菌胞外多糖生物合成基因具有高度同源性。welF、welG、welH、welI、welJ和welE为合成寡糖重复单元的糖基转移酶基因。rmlA、rmlB和rmlC基因与dTDP-L-鼠李糖前体的生物合成密切相关。wzd、wze、wzy、wzx、wzr和wzb基因预测蛋白主要参与胞外多糖合成过程中多糖链长检测、聚合和输出。     

副干酪乳杆菌及其胞外多糖的抗氧化性研究

以具有抗氧化性的嗜酸乳杆菌ATCC4356为对照,研究了1株副干酪乳杆菌H9的抗氧化性。分析了2株菌不同浓度下菌悬液和无细胞提取液的DPPH自由基清除能力、金属离子螯合能力和抑制脂质过氧化能力。并对H9菌株菌悬液煮沸灭活前后的抗氧化能力进行了比较。同时,对H9菌株自产的胞外多糖的抗氧化性进行了研究,测定了其在不同浓度下DPPH自由基清除能力、超氧自由基清除能力、羟自由基清除能力。结果表明:H9菌株的菌悬液和无细胞提取液抗氧化能力均随着浓度的升高呈上升趋势,浓度达到109cfu/mL时抗氧化能力最强,此时DPPH的清除能力分别达到(55.0±1.7)%和(47.5±1.8)%,螯合金属离子的能力分别为(15.2±1.2)%和(15.1±1.3)%,抑制脂质过氧化的能力分别为(76.2±1.1)%和(70.0±0.4)%。煮沸后菌悬液抗氧化能力趋势与未煮沸前一致,但同等浓度下煮沸处理会降低其抗氧化能力。H9菌株自产胞外多糖也具有较强的抗氧化能力,并随着多糖浓度的升高抗氧化能力增强。结果表明H9菌株的抗氧化性可能与活细胞和菌体代谢产物密切相关。     

苍白杆菌产生物表面活性剂的提取研究

该实验研究了苍白杆菌（Ochrobactrum sp.）所产生物表面活性剂的提取方法。对比了调pH法、溶剂萃取法和溶剂沉淀法的提取效果,并将调pH法与乙醇沉淀法相结合用来提取生物表面活性剂。结果表明,调pH法、溶剂萃取法不能将该生物表面化活性剂提取出来,而乙醇沉淀法可得到高乳化活性的产物。将发酵液的pH调至13除去沉淀后加入3倍体积冷乙醇进行提取,生物表面活性剂产量（6.69 g/L）是直接向原始发酵液加入3倍体积冷乙醇进行提取的1.45倍,该法可提取得到分子质量较大的含有少量糖、蛋白、脂及较多磷酸盐的生物表面活性剂。     

利用纸层析-分光光度法检测甲基营养菌5222产L-丝氨酸

该研究旨在建立一种准确、简便的检测L-丝氨酸含量的方法。当纸层析-分光光度法展开剂为丙酮∶正丁醇∶二乙胺∶水（10∶10∶2∶5,V/V）,pH值为12.7,波长为510 nm,洗脱时间为30 min时,能很好的对L-丝氨酸进行定性、定量检测。当L-丝氨酸标准溶液质量浓度在1～6 μg/mL时,L-丝氨酸的含量（x）与吸光度值（y）之间有良好的线性相关关系（回归方程y=0.008 8x+0.008 9,R2=0.996 2）;精密度实验结果显示相对标准偏差（RSD）为2.3%;回收率实验结果显示平均加标回收率95.3%,RSD为2.6%。说明该方法具有较高的精密度和准确度。以甲基营养型菌（Methylobacterium sp.）5222为出发菌株,以甘氨酸为前体物质发酵生产L-丝氨酸,应用该研究建立的纸层析-分光光度法,检测到发酵液中L-丝氨酸含量为0.90 g/L,说明菌株5222具有产L-丝氨酸的能力。     

藏灵菇源干酪乳杆菌KL1胞外多糖抑制人结肠癌细胞增殖的研究

分离纯化藏灵菇源干酪乳杆菌KL1胞外多糖(EPS),研究EPS纯品对HCT-8人结肠癌细胞的增殖抑制和诱导细胞凋亡作用。利用Sepharose CL-6B凝胶柱探讨干酪乳杆菌KL1菌株EPS粗品的纯化条件,应用紫外全波长扫描及苯酚-硫酸法鉴定EPS纯度;采用CCK-8法和Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒研究EPS对HCT-8人结肠癌细胞的增殖抑制和凋亡作用。结果表明:在0.02～0.12mol/L磷酸盐缓冲液梯度洗脱、流速3mL/min、样品上样质量浓度15.0mg/mL、样品上样量2.0mL的纯化条件下获得EPSa和EPSb两个单一组分的胞外多糖,其纯度分别为91.67%和82.86%。EPSa处理HCT-8人结肠癌细胞体外实验发现,EPSa对HCT-8细胞的增殖有抑制作用,以及诱导细胞凋亡的发生,且细胞生长抑制率呈时间-剂量依赖性。提示藏灵菇源干酪乳杆菌KL1菌株的EPSa有抑制结肠癌细胞增殖的生物活性。     

一株高产胞外多糖米酒乳杆菌的诱变筛选

通过对一株高产胞外多糖的米酒乳杆菌BXR-5-3在不同紫外线照射距离和时间、不同浓度亚硝基胍以及紫外线、亚硝基胍复合诱变等条件下分别诱变筛选和多糖含量测定,获得的胞外多糖产量最高诱变菌株的条件为紫外线照射距离为20cm,亚硝基胍的浓度为300μg/mL,处理时间为20min,其多糖的产量为339.0mg/L。      

Calcium (Ca2+)-regulated exopolysaccharide biosynthesis in probiotic Lactobacillus plantarum K25 as analyzed by an omics approach

Exopolysaccharide (EPS)-producing lactic acid bacteria have been widely used in dairy products, but how calcium, the main metal ion component in milk, regulates the EPS biosynthesis in lactic acid bacteria is not clear. In this study, the effect of Ca²⁺ on the biosynthesis of EPS in the probiotic Lactobacillus plantarum K25 was studied. The results showed that addition of CaCl₂ at 20 mg/L in a semi-defined medium did not affect the growth of strain K25, but it increased the EPS yield and changed the microstructure of the polymer. The presence of Ca²⁺ also changed the monosaccharide composition of the EPS with decreased high molecular weight components and more content of rhamnose, though the functional groups of the polymer were not altered as revealed by Fourier transform infrared spectral analysis. These were further confirmed by analysis of the mRNA expression of cps genes, 9 of which were upregulated by Ca²⁺, including cps4F and rfbD associated with EPS biosynthesis with rhamnose. Proteomics analysis showed that Ca²⁺ upregulated most of the proteins related to carbon transport and metabolism, fatty acid synthesis, amino acid synthesis, ion transport, UMP synthesis. Specially, the increased expression of MelB, PtlIIBC, EIIABC, PtlIIC, PtlIID, Bgl, GH1, MalFGK, DhaK, and FBPase provided substrates for the EPS synthesis. Meanwhile, metabolomics analysis revealed significant change of the small molecular metabolites in tricarboxylic acid cycle, glucose metabolism and propionic acid metabolism. Among them the content of active small molecules such as polygalitol, lyxose, and 5-phosphate ribose increased, facilitating the EPS biosynthesis. Furthermore, Ca²⁺ activated HipB signaling pathway to inhibit the expression of manipulator repressor such as ArsR, LytR/AlgR, IscR, and RafR, and activated the expression of GntR to regulate the EPS synthesis genes. This study provides a basis for understanding the overall change of metabolic pathways related to the EPS biosynthesis in L. plantarum K25 in response to Ca²⁺, facilitating exploitation of its EPS-producing potential for application in probiotic dairy products.