无血清培养基培养Vero细胞制备狂犬病病毒工艺的建立

目的建立无血清培养基(virus production-serum-free medium,VP-SFM)培养Vero细胞制备狂犬病病毒CTN-1V株的工艺。方法分别采用VP-SFM和含5%牛血清DMEM于方瓶中培养Vero细胞制备狂犬病病毒CTN-1V株,比较无血清培养基培养不同代次Vero细胞间及无血清与含血清培养基培养Vero细胞间制备的狂犬病病毒滴度及效力。将2 g/L微载体cytodex-1加至250 ml spinner flask中,加入Vero细胞,37℃培养3 d,按MOI=0.02接种狂犬病病毒CTN-1V株,检测病毒收获液的病毒滴度及效力,每天显微镜下观察细胞生长情况,计算细胞比生长速率。结果无血清培养基培养不同代次Vero细胞制备狂犬病病毒的滴度和效力差异无统计学意义(P0.05);无血清和含血清培养基培养Vero细胞制备狂犬病病毒的滴度差异无统计学意义(P0.05),但无血清培养基培养Vero细胞制备狂犬病病毒效力明显高于含血清的培养基(P0.05)。搅拌瓶微载体系统培养Vero细胞制备狂犬病病毒,细胞贴壁均匀,生长良好,收获病毒液的平均病毒滴度为6.50 lg FFU/ml,平均病毒效力为6.77 IU/ml。结论初步建立了微载体系统无血清培养Vero细胞制备狂犬病病毒的工艺,为无血清规模化制备狂犬病疫苗奠定了基础。     

微载体无血清培养水痘-带状疱疹病毒的效果

目的探讨利用生物反应器微载体无血清培养水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)的效果。方法利用生物反应器,将人二倍体细胞2BS培养至在微载体上形成单层后,分别采用BD008无血清培养基及含有2%新生牛血清的MEM维持液按MOI为0. 004～0. 008感染VZV毒种;当细胞呈现70%细胞病变效应(cytopatho-genic effect,CPE)时,无血清培养的细胞沉淀经PBS洗涤1次,含血清培养基培养的细胞洗涤1～3次后收获,分别制备3批VZV原液;噬斑法检测病毒滴度,ELSIA法检测牛血清白蛋白残留量,并对制备的水痘减毒活疫苗(live attenuated varicella vaccine,VarV)进行热稳定性检测。结果洗涤1～3次获得的3批含血清培养VZV原液滴度从5. 00 lgPFU/mL降至4. 12 lgPFU/mL;牛血清白蛋白残留量分别为203. 2、120. 3和81. 2 ng/mL,前2批超出合格范围(≤100 ng/mL)。洗涤1次获得的3批无血清培养VZV原液滴度分别为4. 92、5. 00和5. 30 lgPFU/mL;牛血清白蛋白残留量分别为75. 2、82. 3和71. 9 ng/mL,均值低于洗涤1及2次含血清培养VZV原液(P <0. 05)。3批无血清培养的VarV热稳定性均符合要求。结论获得的无血清培养的VZV原液滴度及牛血清白蛋白残留量均符合《中国药典》三部(2015版)标准,本研究为提高VarV质量及生物反应器微载体工艺改进提供了参考。     

鼠神经生长因子病毒灭活效果的验证

目的对鼠神经生长因子(mouse nerve growth factor,mNGF)病毒灭活工艺进行验证。方法以伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)和Sindbis病毒为指示病毒,考察辛酸钠法对mNGF原液中病毒的灭活效果,并比较灭活后与未灭活原液的mNGF活性、纯度、等电点及其-20℃贮存0、3、6个月的稳定性。结果 mNGF原液经0.3%辛酸钠、pH(5.0±0.2)、(25±1)℃灭活90 min,PRV和Sindbis病毒滴度均下降6 lgCCID50/ml以上,灭活60、90 min样品盲传3代后,均未检测出病毒。灭活后与未灭活原液的mNGF活性无差异,比活性均在5.0×105 AU/mg以上,蛋白纯度均为100%,等电聚焦主区带均在8.65~9.30之间;-20℃贮存0、3、6个月,蛋白纯度均为100%,比活性均无明显差异,且6个月内比活性均未明显降低。结论辛酸钠法可安全、快速、高效地灭活mNGF原液中的指示病毒及其所代表的相关病毒,保证了产品的质量及其工艺的稳定性,保障了临床用药的安全性。     

无血清培养Vero细胞及其传代稳定性分析

目的建立无血清无动物源性培养基(virus production-serum-free medium,VP-SFM)培养Vero细胞的工艺,并分析其传代稳定性。方法采用VP-SFM适应培养Vero细胞,建立无血清无动物源性Vero细胞库,对细胞库进行常规检定;绘制VP-SFM培养Vero细胞的生长曲线;比较140、150、160代Vero细胞在VP-SFM中培养的比生长速率(μ)和分裂次数(Cd);比较142、147、153代Vero细胞在VP-SFM中培养的狂犬病病毒滴度;比较无血清与含血清培养140、150、160代Vero细胞的μ和Cd值;分别在250 ml spinner flask中加入2 g/L cytodexⅠ、在3 L生物反应器中加入3 g/L cytodexⅠ培养Vero细胞,观察细胞贴壁和生长情况。结果建立的无血清无动物源性Vero细胞库,细胞密度为4×10~6个/ml,冻存前细胞活率为100%,复苏后细胞平均活率为(94.20±3.95)%,无菌检查和支原体检查合格;细胞在VP-SFM中复苏传代后生长良好,经过24 h潜伏期后,进入对数生长期,第8天进入平台期,第12天达最大细胞密度20.5×10~5个/ml,并维持至第14天,活细胞数开始下降,最大μ值为0.025 4 h~(-1)。Vero细胞在无血清培养基中传代稳定性较好,140、150、160代Vero细胞在VP-SFM培养的μ和Cd值差异无统计学意义(P0.05);142、147、153代Vero细胞在VP-SFM培养的狂犬病病毒滴度差异无统计学意义(P0.05);140、150、160代Vero细胞在无血清和含血清培养基培养的μ和Cd值差异无统计学意义(P0.05)。在生物反应器微载体系统中,采用无血清培养基培养Vero细胞,细胞贴壁及生长状态良好。结论初步建立无血清、无动物源性物质的Vero细胞库,采用方瓶静置培养或微载体搅拌培养,细胞生长状态均良好,传代稳定性也较好。     

水貂肠炎细小病毒及犬瘟热病毒灭活后的联合免疫效果

目的探讨水貂肠炎细小病毒(mink enteritis virus,MEV)和犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)灭活后的联合免疫效果。方法用甲醛灭活MEV-L和CDV-L弱毒株,固定MEV-L的血凝效价为2~6,与CDV-L病毒液(CDV-L TCID_(50)10~(-5.29)/mL)分别按1∶1(Ⅰ组)、1∶2(Ⅱ组)、1∶3(Ⅲ组)的量混合,加入10%氢氧化铝胶,充分混匀后免疫大鼠,均为1 m L/只。分别于免疫前及免疫后第7、14、30、60、90天采血,分离血清,采用血凝抑制(hemagglutination inhibition,HI)试验和间接ELISA检测血清MEV抗体效价,血清中和试验和间接ELISA检测血清CDV抗体效价。结果大鼠在免疫后7 d时产生MEV和CDV抗体,30 d时抗体效价最高,随后下降,90 d时抗体效价仍较高;Ⅰ组CDV抗体效价较其他两组高。结论3组不同比例的CDV和MEV联合免疫大鼠均可产生较高的抗体水平,其中以1∶1比例的免疫效果最佳。     

在无血清无蛋白培养基中培养Vero细胞

目的开发在无血清无蛋白培养基(PF)中培养Vero细胞的技术。方法在DMEM/F12培养基中添加酵母提取物和大豆水解物,配制成无血清无蛋白培养基。使用配制好的无血清无蛋白培养基,分别在玻璃、聚乙烯醇缩丁醛(PVB)和聚苯乙烯(PS-TC)培养面上培养Vero细胞,观察细胞生长情况,并绘制细胞生长曲线,以含血清培养基BM为对照。结果与BM培养基比较,在玻璃培养面上,PF培养基不支持Vero细胞生长和分裂;在PVB培养面上,PF培养基支持Vero细胞生长,但不支持分裂;在PS-TC培养面上,PF培养基支持Vero细胞的生长和分裂。结论在PS-TC培养面上,PF培养基适合培养Vero细胞。     

人纤维蛋白原干热病毒灭活效果及灭活前后的质量变化

目的 评价人纤维蛋白原干热病毒灭活效果及灭活前后的质量变化。方法 取3批人纤维蛋白原样品,按样品与病毒9∶1的体积比分别加入Sindbis病毒和脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus,EMCV）,冻干后,于（99.5±0.5）℃下干热灭活30 min。96孔微量细胞病变法测定病毒滴度降低量,考察人纤维蛋白原干热灭活效果;并对干热前/后样品进行可见异物、稳定性、纯度、凝固活力、SDS-PAGE、高效液相分子排阻色谱（high performance liquid chromatography-size exclusion chromatography,HPLC-SEC）、圆二色光谱、荧光光谱、差示扫描荧光（differential scanning fluorimetry,DSF）分析,以评价其质量变化。结果 3批人纤维蛋白原样品干热30 min,Sindbis病毒滴度降低量分别为6.13、5.88、6.00 LgTCID50/0.1 mL,EMCV滴度降低量分别为≥4.94、≥4.68、≥5.00 LgTCID50/0.1 mL。3批人纤维蛋白原样品干热前/...     

无血清培养基分离肿瘤干细胞的研究进展

肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)被认为是肿瘤形成、生长、转移以及复发的根本原因。CSCs的分离、鉴定为CSCs的研究及靶向CSCs疗法的开发奠定了基础。目前,无血清培养法已经是分离培养CSCs的常用方法。本文对无血清培养基(serum free medium,SFM)分离CSCs的研究进展作一综述。     

常用血液制品病毒灭活的研究进展

血液制品的安全性一直是人们关注的热点。本文介绍了白蛋白、免疫球蛋白和凝血因子等常用血液制品病毒灭活的研究进展。     

验证低pH法灭活人白细胞干扰素α病毒的效果

目的 以HIV-1、VSV和Sindbis为模型病毒,验证低pH法(pH2.0)灭活人白细胞干扰素α病毒效果。方法 将模型病毒按1:9(V/V)加入干扰素中,混匀后调pH至2.0。4℃放7d后,测病毒滴度。未发现细胞病变(CPE)的样品须盲传3代并观察7d,若仍无CPE,则判定无病毒存在。结果 4 log的HIV-1、6.63 log的VSV和6.38 log的Sindbis病毒被灭活,干扰素活性未受影响。结论 低pH法(pH2.0)灭活病毒经济有效,可提高人白细胞干扰素的安全性。     

无血清培养MDCK细胞生产狂犬病病毒条件的初步优化

目的开发一种适应于MDCK细胞生长和狂犬病病毒生产的无血清培养基MDCK-SFM,并对MDCK细胞生产狂犬病病毒的条件进行初步优化。方法方瓶培养MDCK细胞,考察混合脂类、微量元素、氢化可的松、酵母抽提物和鱼胨水解物对MDCK细胞生长的影响。转瓶微载体批培养MDCK细胞,以获得细胞在不同培养基中的生长动力学。以不同的感染量(MOI)和感染时间(TOI)接种狂犬病病毒,确定MDCK细胞感染狂犬病病毒的最佳MOI与TOI。比较含10%NCS的DMEM、VP-SFM和MDCK-SFM培养基培养MDCK细胞生产狂犬病病毒的效果。结果混合脂类有利于细胞贴壁,酵母抽提物和鱼胨水解物可不同程度地促进MDCK细胞生长。以MDCK-SFM培养基培养的MDCK细胞最高密度可达14.3×105个/ml。在MOI=0.5、TOI=72h的条件下,可得到最高的病毒滴度。MDCK-SFM培养基培养MDCK细胞生产狂犬病病毒,可获得较高的病毒滴度(5.13lgFFU/ml)。结论MDCK-SFM培养基适于MDCK细胞生长和培养狂犬病病毒,且成本低,成分比较明确,在MDCK细胞高密度培养生产狂犬病疫苗方面具有较高的应用价值。     

Vero细胞和流感病毒在无血清条件下的微载体培养

目的探索Vero细胞和流感病毒在无血清条件下的微载体培养条件。方法在搅拌瓶中,选择合适的微载体,在无血清条件下培养Vero细胞和流感病毒。观察Vero细胞的生长状况,并检测流感病毒的血凝滴度。结果Vero细胞在Cytodex 3上生长最好,每个微载体上接种10个细胞为最佳接种浓度,以MOI=0.005和0.010 CCID50/细胞接种H1N1流感病毒后,在72h时,培养上清病毒血凝滴度达到最高。结论无血清条件下,Vero细胞在Cytodex 3上生长良好,流感病毒能在Vero细胞上成功培养。     

Characterization and Involvement of Exosomes Originating from Chikungunya Virus-Infected Epithelial Cells in the Transmission of Infectious Viral Elements

The Chikungunya virus (CHIKV) is a mosquito-borne alphavirus that affects the world’s popula-tion with chikungunya disease. Adaptation of the viral life cycle to their host cells’ environment is a key step for establishing their infection and pathogenesis. Recently, the accumulating evidence advocates a principal role of extracellular vesicles (EVs), including exosomes, in both the infection and pathogenesis of infectious diseases. However, the participation of exosomes in CHIKV infec-tion and transmission is not well clarified. Here, we demonstrated that the CHIKV RNA and pro-teins were captured in exosomes, which were released by viral-infected epithelial cells. A viral genomic element in the isolated exosomes was infectious to naïve mammalian epithelial cells. The assay of particle size distribution and transmission electron microscopy (TEM) revealed CHIKV-derived exosomes with a size range from 50 to 250 nm. Treatments with RNase A, Triton X-100, and immunoglobulin G antibodies from CHIKV-positive patient plasma indicated that in-fectious viral elements are encompassed inside the exosomes. Interestingly, our viral plaque for-mation also exhibited that infectious viral elements might be securely transmitted to neighboring cells by a secreted exosomal pathway. Taken together, our recent findings emphasize the evidence for a complementary means of CHIKV infection and suggest the role of exosome-mediated CHIKV transmission.     

改良维持液培养aG株狂犬病病毒制备病毒原液

目的通过改良维持液的缓冲体系,改进aG株狂犬病病毒的培养条件,制备高滴度的病毒原液。方法在传统病毒维持液的基础上,补加缓冲盐和碳酸氢钠,在相同的条件下,分别用传统维持液和改良维持液培养病毒,收获2次病毒液,混合,经300 KD膜包超滤、Sepharose 4FF纯化后,制成病毒原液,采用ELISA法检测抗原含量,按《中国药典》三部(2010版)方法检测病毒滴度、效力、宿主DNA和宿主细胞蛋白残留量,用便携式pH计检测pH值。结果改良维持液制备的病毒原液的抗原含量、病毒滴度及效力均高于对照维持液;两种维持液制备的病毒原液的宿主蛋白和宿主细胞DNA残留量均符合《中国药典》三部(2010版)要求;改良维持液的缓冲能力明显增强,对病毒培养过程中pH值的控制明显优于对照维持液。结论改良维持液培养狂犬病病毒制备的病毒原液滴度较高,可改进传统aG株狂犬病病毒生产的病毒原液滴度较低的现状。     

神经生长因子对乙型脑炎病毒感染BHK-21细胞的抑制作用

目的观察神经生长因子(nerve growth factor,NGF)对乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染地鼠肾细胞BHK-21的抑制作用。方法将不同浓度的NGF(100、50、25、12.5、6.3、3.1、1.6和0.8μg/L)加入BHK-21细胞中,采用MTT法检测NGF对BHK-21细胞的毒性作用;将不同稀释度的JEV(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7)JEV感染BHK-21细胞,蚀斑计数法测定病毒滴度;在JEV感染的BHK-21细胞中加入不同浓度的NGF,观察细胞的CPE情况,并通过蚀斑减少率分析NGF对JEV的抑制作用。结果 NGF浓度在100μg/L以内对BHK-21细胞无毒性;JEV的滴度为Lg 8.70 pfu/ml;NGF(12.5μg/L)+JEV组BHK-21细胞病变程度明显减轻;随着NGF浓度的提高,蚀斑减少率也呈升高趋势(r=0.929,P<0.05),NGF浓度为3.1μg/L以上时,蚀斑减少率达10%以上,具有明显的抗JEV效果。结论 NGF在浓度为0.8～100μg/L的范围内,对JEV具有明显的抑制作用,为今后研究NGF抗病毒的作用机制奠定了实验基础。     

狂犬病病毒减毒株CTN-181的免疫原性

目的评价狂犬病病毒减毒株CTN-181的免疫原性。方法用不同病毒滴度的CTN-181株病毒对小鼠分别进行口腔或肌肉免疫,14 d后,分别用狂犬病病毒CVS株进行脑内或肌内攻毒,14 d后,计算小鼠的免疫保护力;同时于免疫后14、21和30 d,采用RFFIT法检测小鼠血清抗狂犬病病毒中和抗体水平。结果两种途径免疫的小鼠均产生了较强的保护作用和较高的中和抗体水平。口腔免疫后脑内和肌内攻毒的50%保护剂量分别为1.4×105和1.4×104PFU/ml;肌肉免疫后脑内和肌内攻毒的50%保护剂量分别为1.4×106和1.4×105PFU/ml。小鼠口腔免疫CTN-181病毒量≥1.4×105PFU/ml 14 d后,即可产生有效的保护,至30 d时,1.4×106和1.4×107PFU/ml剂量组中和抗体水平达20 IU/ml以上;肌内免疫产生的中和抗体水平较低。结论 CTN-181减毒株具有良好的免疫原性,以较低病毒量免疫小鼠即可产生高水平的中和抗体和保护作用。     

二乙烯亚胺灭活流感病毒的效果观察

目的观察二乙烯亚胺(BEI)对流感病毒的灭活效果。方法分别使用甲醛和BEI对流感病毒进行灭活试验,通过血凝试验检测二者灭活效果,并确定各自最佳灭活时间。用灭活的病毒液免疫小鼠,检测其抗原性,并用RT-PCR方法分析灭活病毒基因组的完整性。以裂解剂TritonX-100裂解病毒后,分别加入甲醛和BEI灭活,采用单向免疫扩散法检测灭活不同时间病毒液的HA含量。结果BEI灭活36h可将病毒完全灭活;BEI灭活的病毒免疫小鼠较甲醛灭活病毒产生较高的血凝抑制抗体;BEI灭活病毒液经RT-PCR,不能扩增出病毒基因;BEI灭活病毒的HA平均含量比甲醛灭活病毒的HA平均含量略高。结论BEI在灭活流感病毒感染性的同时,能够灭活病毒基因,并较好地保持病毒的抗原性。     

表达呼吸道合胞病毒F蛋白的新城疫重组病毒的构建及其免疫原性

目的利用新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)反向遗传系统构建表达呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)F蛋白的重组病毒,并以BALB/c小鼠为动物模型,评价其免疫原性。方法在已建立的NDV反向遗传系统的基础上,将RSV F基因插入NDV全长cDNA克隆中,构建并拯救获得表达RSV F蛋白的重组病毒r LS/RSV-F。采用间接免疫荧光(indirect immunoinfluscent assay,IFA)法鉴定RSV F蛋白的表达;以HA、病毒半数鸡胚感染量(50%infective dose,EID50)、半数组织感染量(50%tissue infectious dose,TCID50)及生长曲线等生物学指标对其生物学特性进行鉴定;将r LS/RSV-F滴鼻免疫BALB/c小鼠,于免疫后第49天经眼眶后静脉丛采血,分离血清,ELISA法检测IgG抗体效价,中和试验检测中和抗体效价。结果成功拯救表达RSV F蛋白的NDV重组病毒r LS/RSV-F,具有与亲本病毒相似的感染能力及生长动力学特性;r LS/RSV...     

猪瘟和猪蓝耳病病毒多重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)和猪蓝耳病病毒(Porcine respiratory and reproductivesyndrome virus,PRRSV)多重RT-PCR检测方法,并进行验证及初步应用。方法根据GenBank中登录的CSFV和PRRSV疫苗株基因组序列,分别设计针对CSFV和PRRSV的两对引物,建立多重RT-PCR检测方法,并进行敏感性及特异性验证。用建立的多重RT-PCR法检测20份疑似猪瘟、猪蓝耳病或混合感染病料,并与市售RT-PCR试剂盒的检测结果进行比较;检测病料的部分PCR产物测序后,与9株具有代表性的CSFV毒株和10株具有代表性的PRRSV毒株进行核苷酸序列同源性比对。结果以CSFV和PRRSV混合引物扩增,分别可扩增出286和664 bp的特异性条带。建立的多重RT-PCR检测方法可检出100倍稀释的病毒RNA;该方法可检出CSFV、PRRSV及CSFV与PRRSV混合病毒,而猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Trans-missible gastro-enteritis virus,TGEV)、猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)和猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)的检测结果均为阴性;该方法检测20份疑似猪瘟、猪蓝耳病或混合感染病料的结果与市售RT-PCR试剂盒比较,灵敏度达100%;选取的两份CSFV扩增片段与9株具有代表性的CSFV毒株的核苷酸序列同源性在92.3%⁹8.2%之间,扩增的PRRSV与10株具有代表性的PRRSV毒株的核苷酸序列同源性在94.1%98.2%之间,扩增的PRRSV与10株具有代表性的PRRSV毒株的核苷酸序列同源性在94.1%⁹7.9%之间。结论成功建立了CSFV和PRRSV多重RT-PCR检测方法,为猪瘟和猪蓝耳病的早期诊断及流行病学调查奠定了基础。