不同诱导条件下的VBNC状态副溶血弧菌的PMA-qPCR定量检测及其呼吸活性分析

定量检测不同诱导条件下的活的非可培养(viable but non-culturable,VBNC)状态副溶血弧菌的变化情况,并对VBNC菌的呼吸活性进行分析。采用叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与荧光定量聚合酶链式反应(fluorescence quantitative polymerase chain reaction,q PCR)结合的技术(PMA-q PCR)定量检测副溶血弧菌活菌数。结合激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪优化传统CTC(5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride)呼吸检测法对VBNC状态的副溶血弧菌进行分析。结果表明PMA-q PCR检测技术结合平板计数的方法,可用于定量检测副溶血弧菌诱导过程中活菌数和可培养菌数的变化情况,并利用差值测定出VBNC细胞的浓度。在不同的温度、Na Cl含量和氯霉素含量的诱导条件下,副溶血弧菌在其中的7种条件下在60 d内进入了VBNC状态。VBNC细胞终浓度最低为5.75×10~2 CFU/m L,最高为1.70×10~5 CFU/m L。在细胞呼吸实验中,采用CTC与4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)双染法能在激光扫描共聚焦显微镜下清晰地观察到VBNC细胞表面的红色荧光,有效区分死活细胞。同时利用流式细胞仪能够根据荧光强度快速区分呼吸活性呈阴性和阳性的细胞。本研究为VBNC细菌的检测和生理特性的研究提供了新的思路和依据。     

PMA-qPCR方法检测陕西猕猴桃溃疡菌优势病原菌活菌的研究

将叠氮溴化丙啶(PMA)与实时荧光定量(qPCR)相结合定量检测陕西猕猴桃溃疡菌优势病原菌(Psa)活菌的数量。通过优化PMA最佳浓度、暗孵育时间、曝光时间,确定PMA-qPCR区别溃疡菌活、死菌的最佳条件。结果表明,Psa经98.3℃沸水浴处理13min可完全致死,Psa死菌浓度为1×107 CFU/mL时PMA与死菌共价交联的最佳浓度为105μg/mL,最佳暗育时间为8min,最佳曝光时间为20min,在此条件下死菌DNA无扩增,而对活菌DNA扩增无影响;Psa质粒标准品建立的线性回归方程为Y=-3.220 4x+37.73,R2=0.995 5,最低可检出6.39×102拷贝/μL的溃疡菌;建立的PMA-qPCR方法最低可检出2.38×102拷贝/μL的溃疡菌;采用人工染菌枝条样品的最低检出限为6.30×104 CFU/mL,与菌落计数检测结果相符。     

水产品中副溶血性弧菌PMA-ddPCR活菌定量检测方法的研究

本研究旨在针对水产品中活的副溶血性弧菌建立一种快速定量的PCR检测方法。基于叠氮溴化丙锭(PMA)在一定光照条件下能抑制死亡菌DNA扩增,以及微滴式数字PCR技术能将检测精度扩展至单分子目标基因,并实现绝对定量的特点,以副溶血性弧菌tlh基因为目的片段设计及筛选适合的特异性引物与探针,优化反应体系,通过对PMA浓度及曝光条件等优化,建立了一种联用PMA-dd PCR技术快速检测水产品中活的副溶血性弧菌的定量检测方法。研究结果显示:选择16μg/m L作为PMA工作浓度,曝光时间为8 min,此条件下能够完全抑制副溶血性弧菌死菌的DNA扩增并对活菌扩增无影响。通过对比PMA-dd PCR和PMA-q PCR的检测低限分别为2×10~1 cfu/mL、2×10~2 cfu/mL,PMA-dd PCR法的灵敏度比PMA-q PCR法的高。应用PMA-dd PCR定量方法检测人工污染的基围虾和小帆立贝这两种海产品,在基围虾中最低可检出1.9×10~1 cfu/g的副溶血性弧菌、在小帆立贝中最低可检出8.9 cfu/g的副溶血性弧菌。该研究为将PCR技术实际应用于水产品中低量污染、活的副溶血性弧菌的定量检测奠定了基础。     

基于DNA染料EMA的RT-PCR技术定量检测海产品中病原性副溶血弧菌活细胞

将一种DNA染料叠氮溴化乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)与实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)技术相结合,建立一种能选择性定量检测牡蛎中trh阳性副溶血弧菌活细胞的新方法。结果表明：使EMA成功插入死细胞DNA并且光解溶液中游离EMA的最佳曝光时间为20min;不抑制副溶血弧菌活细胞DNA扩增的最大EMA质量浓度为2.0μg/mL;完全抑制热致死细胞DNA扩增的最小EMA质量浓度为1.0μg/mL;人工污染牡蛎样品,不经过富集,在2.0×103～2.0×107CFU范围内细胞数的常用对数值与Ct值之间呈严格的负相关性,并且纯培养与人工污染牡蛎样品的RT-PCR检测限均为2×103CFU,即人工污染牡蛎样品的RT-PCR检测灵敏度为每克牡蛎样品400个活细胞;冻融实验表明,在温度低于55℃的水浴中对冷冻海产品进行解冻时,冻融过程对副溶血弧菌活细胞几乎没有影响。该方法是一种快速、灵敏且能有效鉴别并定量检测病原活细胞的新方法。     

PMA-qPCR方法快速检测活性E.coli O157:H7

建立将叠氮溴化丙锭(PMA)与定量PCR(qPCR)技术结合,用于检测热灭活菌背景条件下的大肠杆菌活菌的方法。结果表明:5min以上的强烈光照可以使PMA与DNA共价交联,同时完全钝化游离的PMA以避免"假阴性"结果;抑制死菌DNA扩增的最低PMA质量浓度为10μg/mL,不抑制活菌DNA扩增的最高PMA质量浓度为20μg/mL。当活菌/总菌大于1%时,经PMA预处理,可以消除热灭活菌DNA的干扰,实现对活菌的定量检测。     

金黄色葡萄球菌活的非可培养状态复苏及PMA-qPCR检测

为研究金黄色葡萄球菌活的非可培养（VBNC）状态的复苏问题,采取温度、盐度和酸度3个因素复合诱导制备VBNC菌,尝试四种复苏方法,并以荧光定量PCR和PMA-qPCR技术结合的方法进行检测。结果证明：8%无菌Tween80可以使VBNC状态金黄色葡萄球菌48 h后复苏,同时PMA-qPCR能够有效检出VBNC状态金黄色葡萄球菌,克服传统平板计数法对于VBNC菌的漏检。     

三重real-time PCR检测副溶血弧菌主要毒力基因

针对编码副溶血弧菌的特异性基因和主要毒力基因tlh、tdh、ureR进行引物及探针设计,通过优化反应条件,建立基于Taqman探针快速检测副溶血弧菌毒力基因的三重实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction,real-time PCR）方法。利用10 株副溶血弧菌和22 株非副溶血弧菌对设计的引物及探针进行特异性验证,结果表明设计的引物及探针具有很高的特异性;优化后的引物浓度分别为tdh 0.15 μmol/L、tlh 0.15 μmol/L、ureR 0.80 μmol/L,探针浓度分别为HEX 0.50 μmol/L、FAM 0.50 μmol/L;该方法即使在高浓度的背景细菌存在下,DNA浓度与Ct值均呈良好的线性关系,检出限为1.8×102 拷贝/mL;以完整菌细胞的悬液为模板时,预变性时间为30 min,扩增检测效果与以基因组DNA（gDNA）为模板相当（ΔCt＜1）。本研究建立的三重real-time PCR方法能实现快速定量检测副溶血弧菌,并能有效区分致病性及非致病性副溶血弧菌,为副溶血弧菌的快速定量检测和风险评估提供快速、灵敏、准确的方法。     

DNase处理法结合数字PCR与qPCR对活的非可培养状态副溶血性弧菌检测比较研究

目的探讨DNase处理法结合微滴化数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)在检测冷冻食品中活的非可培养状态(viable but non-culturable state, VBNC)副溶血性弧菌的适用性,并与实时荧光定量PCR(qPCR)进行比较。方法用无菌磷酸盐缓冲液对解冻的大西洋鲑鱼样品进行10倍梯度稀释,再加入副溶血性弧菌,终浓度为6.6×10~5 CFU/mL。-20℃分别诱导10、20和30 d。将DNase试剂与叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)染料分别作用于不同时期的冷冻基质,结合qPCR和ddPCR进行比较检测,对比其作用效果。结果DNase-qPCR和PMA-qPCR检测3个冷冻阶段活性副溶血性弧菌的Cq值分别为31.41±0.06、32.40±0.04、34.59±0.15和31.24±0.06、32.32±0.03、34.25±0.12, 2种方法Cq值均呈现上升的趋势且数值接近。采用DNase-ddPCR和PMA-ddPCR检测各阶段活性副溶血性弧菌,可直接读出绝对拷贝数,分别为233±6.43、108±5.57、28±3.21和256±6.56、126±3.06、35±2.52。2种方法检测的拷贝数差异不大,重复性好。相对标准偏差均在可接受范围内,符合欧盟定量检测要求。结论DNase处理试剂与PMA对有活性的副溶血性弧菌检测效果相当,与PMA相比,DNase处理法无需强光照射,操作简便快捷,无试剂毒性。ddPCR不需要标准品即能实现对基质中微量活性副溶血弧菌精准定量检测。     

乳品中的酵母活菌数PMA-qPCR检测方法的建立及初步应用

本实验旨在对乳品中酵母菌活菌总数进行准确的定量检测,深入研究PMA处理乳品中酵母热损伤菌的最佳工作条件,去除热损伤死菌DNA的影响。针对从乳品中分离的三株酵母菌26S rDNA D1/D2区域序列设计引物Y3和Y4,运用实时荧定定量PCR进行序列扩增,以重组质粒pMD-18T-26S拷贝数对数与扩增循环数(Ct)值为坐标轴建立标准曲线,建立PMA-qPCR检测方法,并对实际样品中的酵母菌活菌富集后进行数量检测。PMA-qPCR法可达到国标规定的食品中酵母菌最高限量值1×102 CFU/mL的检测标准,对应Ct值为36.67±0.43,重复性良好,总耗时6~7 h,可对酵母菌数量进行准确和快速的定量分析,为乳品中腐败微生物的鉴定与监控提供有价值的借鉴。     

活的非可培养状态副溶血性弧菌实时荧光逆转录PCR检测方法的建立及其毒力研究

目的 建立检测活的非可培养(VBNC)状态副溶血性弧菌的荧光逆转录PCR方法并研究其毒力基因表达.方法 将副溶血性弧菌AS079菌株添加到陈化海水中,4℃冰箱内培养,使其进入VBNC状态,针对其管家基因、鉴定基因和毒力基因分别设计实时荧光逆转录PCR引物,通过不同的PCR反应程序和引物浓度组合试验,摸索最佳反应体系条件,用于VBNC状态副溶血性弧菌的检测和毒力研究.结果 用所建立的检测VBNC状态副溶血性弧菌的实时荧光逆转录PCR方法,对接种于陈化海水培养的不同时期的AS079副溶血性弧菌进行荧光定量逆转录PCR扩增,结果显示,随着培养时间的延长,毒力基因tdh2和鉴定基因toxR表达水平持续下降,但即使细菌进入VBNC状态,这两个基因也能够得到很好的扩增,说明以toxR基因和tdh2基因对进入VBNC状态的副溶血性弧菌进行检测和毒力研究方法可行.灵敏度试验表明,鉴定基因toxR的最低检测限可达到48 cfu/ml,研究毒力基因tdh2的表达需要细菌浓度至少为4.8×102cfu/ml,同时试验证明此方法与其他相近食源性致病菌无交叉反应.结论 该实时荧光逆转录PCR方法检测快速、特异性强、敏感度高,适用于VBNC状态副溶血性弧菌的检测和毒力分析.     

保加利亚乳杆菌冻干菌种的研究

对酸奶发酵菌种之一--保加利亚乳杆菌的增菌培养基进行了筛选,得到了高活菌数的保加利亚乳杆菌增菌培养基,并进行冷冻升华干燥得到保加利亚乳杆菌的冻干菌种。结果表明:在添加有10%麦芽汁、10%番茄汁、0.05%CaCO3、1.0%乳糖的MRS基础培养基中培养保加利亚乳杆菌18h后活菌数可达到3.96×1011cfu/g。其冻干菌种的活菌数为2.53×1011cfu/g。     

乳酸菌对活菌型发酵大豆复合蛋白饮料中脲酶的影响

本文研究了四种常见乳酸菌对活菌型发酵大豆复合蛋白饮料中脲酶的影响。将罗伊氏乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌以不同配比分别接种到不含脲酶的豆乳基中,在37℃条件下培养8 h,并分别在4℃、25℃下贮藏3周,检测不同菌种发酵的样品在发酵和贮藏过程中的活菌数和脲酶(定性和定量)。研究表明,无论是单菌还是组合菌发酵,均可产生脲酶,脲酶定性为弱阳性,脲酶活性最高不超过0.020 U/g。其中,单菌发酵样品中的脲酶活性与活菌数呈正相关,但其脲酶活性差异不显著(p0.05);组合菌发酵样品中的初始脲酶活性有显著性差异,而随着发酵时间的延长,其脲酶活性逐渐由差异性显著(p0.05)转变为差异性不显著(p0.05)。在4℃、25℃贮藏过程中,样品中的脲酶活性伴随活菌数的降低而逐渐减弱或消失。     

Rapid identification and quantitation of the viable cells of Lactobacillus casei in fermented dairy products using an aptamer-based strategy powered by a novel cell-SELEX protocol

An aptamer-based strategy was developed for qualitative and quantitative analysis of viable Lactobacillus casei in dairy products. Three highly specific aptamers for L. casei were obtained using systematic evolution of ligands by exponential enrichment protocol using the whole bacterium cell as the target (cell-SELEX) facilitated by polyethyleneglycol and chitosan modified graphene oxide and complementary ring-mediated rolling circle amplification. Two aptamers, one for separating and enriching the L. casei cells and the other for generating fluorescence signals, were employed to develop an aptamer-based strategy, which was demonstrated for the selective detection of L. casei in commercial dairy drinks, with a dynamic range of 10⁵ to 10⁹ cfu/mL. Viable and nonviable L. casei cells could be discriminated based on the significant difference in fluorescence intensity. This established strategy is of high selectivity and sensitivity, and can be used for rapid analysis of viable L. casei in quality control and food surveillance areas.     

益生菌粉剂产品的稳定性研究

检测不同贮存条件下益生菌粉剂产品中的活菌数.结果发现:经过3个月的恒温加速试验,样品活菌数急剧下降5个数量级;在24个月的室温摆放试验中,样品活菌数的下降幅度不超过2个数量级;低温存放试验中产品的活菌数含量基本保持稳定.可见,室温摆放试验能客观体现活菌产品的实际贮存及货架销售情况,对评价益生菌粉剂产品的稳定性和和预测其保质期具有指导意义.     

An improved direct viable count for the enumeration of bacteria in milk

The direct viable count (DVC), a microscopic method for the enumeration of viable bacteria, was modified by replacing nalidixic acid with ciprofloxacin. This modification made it possible to apply this method to a variety of Gram-negative and Gram-positive bacteria which was not previously possible. Of the four antibiotics tested (nalidixic acid, novobiocin, ciprofloxacin and mitomycin C), ciproofloxacin and mitomycin C were the only ones effective for use in the DVC with all of the bacteria tested. In addition, ciprofloxacin could be used at a single concenration (1 μg/ml) while adjustments were necessary with the other antibiotics when examining bacteria from different genera and, in some instances, from different species. The use of ciprofloxacin in the DVC resulted in viable cells that had elongated by 5–11 times their original length. We conclude that the modified DVC will be useful in growth and survival studies of bacterial pathogens and spoilage organisms in milk and other foods     

Short communication: Viable Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in retail artisanal Coalho cheese from Northeastern Brazil

Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) is the etiologic agent of paratuberculosis and it potentially plays a role in Crohn’s disease. In humans, the main route of transmission of MAP might be the intake of contaminated milk and dairy products. Considering that MAP has already been detected in many types of cheese in different counties, and that Coalho cheese is an important dairy product in northeastern Brazil, the aim of this study was to report the first detection of MAP in retail Coalho cheese in Brazil by PCR and culture. Of 30 retail Coalho cheese samples, 3 (10%) amplified fragments of a similar size to that expected (626 bp) were obtained and viable MAP was recovered by culture from 1 (3.3%) sample. The DNA from the positive culture sample was sequenced and showed 99% identity with the insertion sequence IS900 deposited in GenBank. It was possible to identify the presence of MAP-specific DNA in the analyzed samples for the first time in Brazil, and to recover viable cells from retail Coalho cheese.     

凝乳工艺对功能性低脂干酪中活菌数的影响

活菌数是功能性低脂干酪的重要指标,本文就凝乳工艺过程对功能性低脂干酪活菌数的影响进行了研究,旨在通过控制凝乳工艺过程参数而使干酪最终活菌数达到功能性食品的标准。通过对单因素实验和正交实验研究与分析,结果表明:凝乳酶添加量0.01%,凝乳温度35℃,凝乳pH值为6.2,CaCl2添加量0.03%,干酪活菌数均能达到107mL-1,符合功能性低脂干酪的活菌数要求,能够获得较为理想的实验效果。     

饲用微生物添加剂地衣芽孢杆菌活菌计数不确定度评定方法的建立

目的探讨检测实验室饲用微生物添加剂地衣芽孢杆菌活菌计数的不确定度评价方法。方法实验依据JJF1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》、RB/T151-2016《食品微生物定量检测的测量不确定度评估指南》和NY/T 1461-2007《饲料微生物添加剂地衣芽孢杆菌》,对地衣芽孢杆菌活菌计数的不确定度分量进行分析。结果本研究建立了地衣芽孢杆菌活菌计数不确定度评定方法,当包含因子k=2时,扩展不确定度U=4.05%,样品的误差允许范围在0.95×1010～1.15×1010 CFU/g之间。结论建立的地衣芽孢杆菌活菌计数不确定度评定方法简单、易行,符合实际检测要求。     

Bacterial dormancy in Campylobacter: abstract theory or cause for concern?

For the past 100 years, since the birth of modern microbiology, this discipline has predominantly relied on the ability to culture micro-organisms in vitro on artificial synthetic culture media under controlled conditions in the laboratory. However, sometimes it is not possible to detect foodborne pathogens using such conventional techniques. Employment of these techniques can also lead to a delay in detection of pathogens. The 'viable but non-culturable' (VNC) cellular form has been demonstrated in Campylobacter jejuni , representing a resting or dormant stage, which is induced through cell stress including starvation. This form is extremely difficult to detect and generally requires complex and sophisticated technology which is usually not available in most routine food microbiology laboratories. This review aims at examining the role of this cell form in Campylobacter , including their historical evolution, formation, physiology, detection and to discuss the challenges that this form presents to food safety.     

影响益生菌奶片压制中活菌数因素的研究

为了提高压制益生菌奶片过程中益生菌的活菌数目,研究了菌液的添加形式、配方中主料比例及药食同源物等因素对奶片中活菌数的影响。结果表明,采用离心法获得的菌液和奶粉以1︰4比例混合效果最佳,压制的益生菌奶片初始活菌数能达到1011 g-1,菊芋粉作为药食同源保护剂能有效的延长产品货架期,在产品储藏1年以后能保证益生菌存活数在107 g-1以上,为进一步发展益生菌奶片提供了科学依据。