表面活性剂辅助溶菌酶复性:表面活性剂-蛋白质复合物结构分析

研究了十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）辅助天然溶菌酶的复性过程及其影响因素.发现向复性液中单独添加低浓度CTAB即可导致溶菌酶复性,且当变性溶菌酶浓度在0.2 mg•ml^-1以上、CTAB与溶菌酶的摩尔比为10时复性效果最佳.采用表面张力、离子交换色谱、非还原性SDS-PAGE及荧光发射光谱法对复性体系进行物性和结构分析,显示CTAB可与变性溶菌酶形成不同结构的表面活性剂-蛋白质复合物,且复合物的组成和结构可随时间发生变化.最后,对于表面活性剂-蛋白质复合物形成过程机理进行了探讨.     

L-精氨酸助溶菌酶复性过程动力学研究

通过测定复性后酶活性和计算蛋白复性收率,研究了L-精氨酸助溶菌酶的最佳复性条件,利用蛋白质的复性和聚集反应竞争三态动力学模型描述了L-精氨酸助溶菌酶复性动力学,在溶菌酶浓度为100~500μg.mL-1、L-精氨酸浓度为0~1.0 mol.L-1的条件下,分析了溶菌酶浓度及L-精氨酸浓度对复性动力学常数的影响。结果表明,L-精氨酸助溶菌酶复性符合三级聚集反应动力学,L-精氨酸的主要作用是抑制蛋白聚集体的生成速率,从而达到抑制蛋白沉淀、提高复性收率的效果。     

分子伴侣GroEL促进溶菌酶复性动力学

建立了溶菌酶复性的表观动力学模型 ,研究了分子伴侣GroEL促进变性溶菌酶复性的动力学行为 ,包括酶浓度、三磷酸腺苷 (ATP)浓度、GroEL与酶的摩尔比对复性率和复性速率常数的影响 .酶浓度对复性速率常数的影响比对复性率的影响显著 ;酶的复性率和复性速率常数随ATP浓度的增大而提高 ;在蛋白质浓度一定的情况下 ,存在适宜的GroEL和ATP浓度 ,使复性率和复性速率常数最大     

人工伴侣促进溶菌酶复性动力学

利用复性和聚集竞争反应动力学模型描述自发复性和人工伴侣系统(十六烷基三甲基溴化铵与b -环糊精)促进溶菌酶复性动力学。在酶浓度为0.5~2.0 mgmL-1、盐酸胍浓度为0.5~2.2molL-1范围内,系统分析了盐酸胍浓度和人工伴侣浓度对复性动力学的影响。与自发复性相似,人工伴侣促进溶菌酶复性亦符合3级聚集反应动力学。人工伴侣系统的主要作用是抑制聚集体的生成速率,从而达到提高复性收率的效果。在盐酸胍浓度小于1.2mol稬-1时,人工伴侣系统和盐酸胍对促进变性溶菌酶复性具有协同作用,两者共同作用对促进蛋白质复性具有显著效果。     

人工伴侣和盐酸胍促进溶菌酶复性的协同效应

研究了表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)加 β -环糊精 (β -CD) (人工伴侣系统 )和盐酸胍对高浓度变性 -还原溶菌酶氧化复性的影响 ,利用基于二态复性模型的表观动力学模型分析了溶菌酶的复性过程 .结果表明 ,存在最佳盐酸胍浓度 ,使酶的复性率最大 ;当盐酸胍浓度一定时 ,提高人工伴侣系统的浓度使复性反应速率常数增大、逆反应速率常数降低 ,从而提高复性收率 ,证明人工伴侣和盐酸胍对促进变性溶菌酶复性具有协同效应 .在最佳盐酸胍浓度和较高浓度的人工伴侣存在下 ,6 0min内可使浓度为 1.0 5mg·ml^-1的变性酶复性收率达到81% ,而相同条件下的自发复性收率仅为 49% .     

海藻糖对变性溶菌酶的促进复性作用及动力学

研究了海藻糖促进变性还原溶菌酶的复性作用,考察了不同盐酸胍浓度下海藻糖浓度对复性收率的影响,并利用表观竞争反应动力学模型分析了海藻糖辅助溶菌酶的复性动力学特性.结果表明,在海藻糖存在下,聚集体生成速率常数k_A明显减小,但复性速率常数k_N变化不大;随海藻糖浓度的增大,k_A先降低后升高,在合适浓度时k_A出现最小值,由于此时k_N/k_A出现最大值,因此复性收率最大.说明海藻糖的主要作用是有效抑制蛋白质分子间聚集,因此在一定范围内提高其浓度可促进蛋白质复性,从而提高复性收率.     

β-环糊精促进变性-还原溶菌酶复性

研究了 β -环糊精 (β -CD)和表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)作为复性液添加剂对促进变性 -还原溶菌酶的氧化复性 .β -CD自身具有抑制肽链分子间聚集 ,提高复性率的作用 ,但其相对于变性酶的浓度需达到 30 0 0～ 5 0 0 0倍以上 ,否则作用效果不明显 .与其相比 ,利用CTAB和 β -CD联合作用系统具有更佳的促进复性效果 ,在适宜的盐酸胍浓度存在下可使较高浓度的变性 -还原酶实现完全复性 .确定了CTAB +β -CD系统促进变性酶复性的最佳操作 pH值和温度     

人工伴侣辅助溶菌酶复性的研究

研究了去污剂十门烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）和β－环糊精（β－ＣＤ）联合作用（人工伴侣系统）,对变性－还原溶菌酶的复性作用。考察了操作条件对溶菌酶复性收率的影响。结果表明,在人工伴侣系统辅助下,６０ｍｉｎ可使变性溶菌酶的复性收率达８９％,自发复性仅为２７％;并且其最佳复性温度为３７℃,最佳ｐＨ值为７￣９;同时发现,单独使用环糊精也可在一定程度上辅助溶菌酶复性,复性收率为４６％。     

甜菜碱对溶菌酶去折叠热力学和复性动力学的影响

应用荧光分析技术考察了甜菜碱对溶菌酶在盐酸胍溶液中稳定性的影响;并提出将甜菜碱作为添加剂应用于彻底变性还原溶菌酶的复性;同时应用表观竞争反应动力学模型分析了不同浓度甜菜碱对溶菌酶复性动力学的影响特性。结果表明,甜菜碱对溶菌酶具有稳定作用,可以作为添加剂促进变性还原溶菌酶的复性。甜菜碱可以抑制复性过程溶菌酶分子间的聚集,同时提高溶菌酶的复性速率,从而提高溶菌酶的复性收率。     

表面活性剂辅助重组蛋白质复性

以重组人溶菌酶（rhLys）与重组β-甘露聚糖酶（rMan）为体系,综合采用活性测定、非还原性SDS-PAGE以及荧光发射光谱分析等方法研究了十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、CTAB与β-环糊精（β-CD）组成的人工分子伴侣以及其他种类复性助剂对重组蛋白质复性过程的影响.结果表明CTAB及人工分子伴侣均可有效地辅助rhLys复性,且rhLys与鸡卵清溶菌酶（Lys）呈现出类似的复性过程特性;人工分子伴侣可显著地提高rMan在高浓度下的复性率;表面活性剂带电性质、表面活性剂与蛋白质的摩尔比以及变性蛋白质的浓度等是影响复性率及复性产品分布的主要因素.这些结果对于此类复性技术应用于重组蛋白体系时的工艺选择和优化提供了重要的依据和参考.     

高浓度变性-还原溶菌酶的流加复性动力学特性

研究了高浓度变性-还原溶菌酶的流加复性过程动力学特性,重点考察了影响复性速率和复性收率的主要因素,包括盐酸胍浓度、酶浓度和氧化还原剂浓度.结果表明,与直接稀释复性相比,流加操作可有效降低肽链分子间聚集,提高蛋白质的复性收率;在流加复性条件下,随着酶浓度的提高,复性速率和复性收率均有所下降,但适当提高复性液中盐酸胍浓度仍可获得高浓度蛋白质的高复性收率.另外,随着变性酶浓度的提高,需要适当提高复性液中氧化型谷胱甘肽浓度,以加快溶菌酶分子内二硫键的形成,提高复性反应速度.     

流加操作与稀释添加耦合辅助高浓度变性蛋白质复性动力学

研究了流加操作与稀释添加耦合辅助高浓度变性还原溶菌酶的复性,建立了相关的过程动力学模型.利用三态复性的过程模型对实验数据进行了拟合,获得了较好的拟合效果.利用模型分析了复性过程的动力学特性,结果表明,两者耦合可在较低的盐酸胍浓度(1 mol•L^-1)存在下使较高浓度的（5 mg•ml^-1）变性溶菌酶获得80%以上的复性收率;并且发现添加剂乙酰胺的辅助复性作用与盐酸胍相同,降低盐酸胍浓度,适当提高乙酰胺浓度即可使聚集体生成速率常数最小,酶的复性收率最大;但甘油与盐酸胍具有协同作用,只有在适当的盐酸胍浓度下添加甘油才可获得理想的复性效果.     

利用体积排阻色谱法进行蛋白质折叠

以溶菌酶为模拟体系对体积排阻色谱法进行蛋白质折叠过程实验研究 .圆二色性光谱法分析结果证实了复性溶菌酶与天然溶菌酶的二级结构一致性 ;复性溶菌酶与天然溶菌酶色谱保留体积的差异揭示出折叠过程中无活性蛋白质聚集体的存在及其向复性蛋白质转化的机制 ;不同初始浓度的复性实验证实了蛋白质聚集体的存在及其与变性蛋白质初始浓度的关系 ;采用短色谱柱的折叠分离实验结果表明蛋白质折叠是一个快速过程 ;不同尿素浓度下的折叠分离实验结果表明尿素在SEC法中具有非常重要的作用 .与稀释复性法的对比实验表明 :体积排阻色谱法具有稀释倍数小、复性产品活性收率高、复性蛋白质浓度高等优点 .     

蛋白质在层析过程中的失活与复性

在层析分离过程中,层析的固相介质和溶液环境会引起蛋白质的结构变化：天然的蛋白质可能会降低活性甚至完全失去活性,而结构变化了的蛋白质也可能重新折叠恢复活性.此类现象已经引起研究者特别是生化工程学家的关注,层析介质的种类和操作手段是影响此两个过程的关键因素.利用不同的层析方法,对不同的蛋白质采取相应的措施有利于提高活性蛋白质的回收率,具有重要的理论和应用价值.     

Effect of the SA content of a novel thermo‐sensitive P(NIPAM‐co‐SA) copolymer on denatured lysozyme refolding in vitro

A novel hydrogel of P(NIPAM‐co‐SA) copolymer was synthesized by inverse suspension polymerization by adding sodium acrylate (SA) to improve the phase transition properties of poly(N‐isopropylacrylamide) (PNIPAM). The morphologies, size distribution and thermosensitive characteristics of gel particles were studied and the maximal swelling ratio and LCST (Lower Critical Solution Temperature) of gel particles increased obviously with the addition of SA comonomer. When the protein concentration was 250 μg/mL, the optimized refolding conditions of denatured lysozyme with P(NIPAM‐co‐SA) hydrogel were that operating at the temperature of 35°C and a urea concentration of 2M, in which the mass ratio of P(NIPAM‐co‐SA) hydrogel with 4% SA copolymerized to lysozyme was 10 : 1. Under the optimized conditions, the activity recovery of lysozyme increased to 76.5% assisted by P(NIPAM‐co‐SA) gel particles compared with 55.6% by simple dilution. When refolding finished, the gel particles could be removed and recovered easily and the activity recovery of lysozyme was still as high as 61.5% after reused for 5 batches. With the addition of different amounts of SA comonomer, the hydrophobicity of the copolymer could be varied. Then the copolymerized hydrogel inhibits protein molecules aggregation more effectively through the moderate hydrophobic interactions between copolymers and protein molecules in the course of lysozyme refolding compared with the presence of PNIPAM polymer. All results above demonstrate that the P(NIPAM‐co‐SA) is a cost effective additive with tunable hydrophobicity for application in the refolding of recombinant proteins expressed as inclusion bodies in vitro. © 2011 Wiley Periodicals, Inc. J Appl Polym Sci, 2011