包埋法固定化色氨酸合成酶基因工程菌合成L-色氨酸的研究

以海藻酸钠作为包埋剂、戊二醛作为交联剂和氯化钙作为填充剂对色氨酸合成酶基因工程菌进行固定化,同时探究3种物质和菌体负载量对固定化菌影响,响应面法优化色氨酸合成酶基因工程菌合成L-色氨酸。固定化色氨酸合成酶基因工程菌最优制备条件为:海藻酸钠28.92 g/L、戊二醛0.95 g/L、氯化钙19.82 g/L、菌体负载量25 g/L,底物L-丝氨酸质量浓度为10 g/L、固定化菌8 g,L-色氨酸产率为28.16%,固定化菌可连续使用15批次。     

基于改性玉米秸秆纤维固定色氨酸合成酶基因工程菌合成L-2-甲基-色氨酸

摘要：利用固定化色氨酸合成酶细胞合成L-2-甲基-色氨酸。采用戊二醛作为交联剂、海藻酸钠作为包埋剂和改性玉米秸秆纤维作为填充剂固定色氨酸合成酶基因工程菌,探究并建立最优固定因素水平条件,提高该固定化菌的酶活力以及其稳定性,响应面法优化固定化色氨酸合成酶基因工程菌合成L-2-甲基-色氨酸。研究结果表明,底物L-丝氨酸浓度为10 g/L,温度为35℃,pH为8.0,L-2-甲基-色氨酸合成量达到5.3 g/L,底物L-丝氨酸转化率为41.6%,产物L-2-甲基-色氨酸收率为25.3%,固定化色氨酸合成酶基因工程菌可连续使用12批次。     

固定化色氨酸合成酶细胞合成L-2-甲基色氨酸

利用固定化色氨酸合成酶细胞合成了L-2-甲基色氨酸,采用戊二醛作为交联剂、海藻酸钠作为包埋剂和改性玉米秸秆纤维作为填充剂固定色氨酸合成酶基因工程菌,并利用响应面法建立了最优固定因素水平条件,并考察了最佳条件下该固定化菌的酶活力以及其稳定性。实验结果表明:底物L-丝氨酸质量浓度为30 g/L、温度为35℃、pH=8.0时,L-2-甲基色氨酸质量浓度达到5.3 g/L,底物L-丝氨酸转化率为41.6%,产物L-2-甲基色氨酸收率为25.3%,固定化色氨酸合成酶基因工程菌可连续使用12批次。     

苯酚降解菌的固定化及其降解特性的研究

以海藻酸钠为载体,对苯酚降解菌进行细胞固定化,并对其降解特性进行了研究。通过单因素实验确定较佳的固定化条件为:海藻酸钠质量浓度3.0%、CaCl2质量浓度4.0%、湿菌体量0.4 g/10 mL海藻酸钠溶液;固定化细胞降解苯酚的最适条件为:温度30℃、pH值7.0、NaCl质量浓度低于2.5%,该菌株固定化细胞的降解苯酚能力和耐受苯酚能力均大于游离细胞,800 mg.L-1苯酚降解48 h,降解率可达99%以上。     

海藻酸钠-明胶协同固定化S-腺苷甲硫氨酸合成酶的研究

以海藻酸钠和明胶为载体,对S-腺苷甲硫氨酸合成酶进行固定化。再用戊二醛对其进一步交联,增强固定化酶的稳定性。考察了海藻酸钠和明胶质量分数、CaCl2质量分数、酶和载体比例以及交联剂戊二醛体积分数等因素对固定化酶的影响。结果表明,最佳固定化条件为:海藻酸钠质量分数2.0%、明胶质量分数1.0%、CaCl2质量分数4.0%、固定化酶量为2.5 g/L凝胶、戊二醛体积分数0.6%。交联固定化酶热稳定性得到大幅度提高,在50℃下保温5 h仍保留72%的活力,而游离酶则完全失活。交联固定化酶在碱性溶液中的稳定性较高,在pH=8.0～9.0的缓冲液中4℃保温10 h酶活性仍保留87%以上。将交联固定化酶用于S-腺苷甲硫氨酸的合成,连续反应8批次后酶活性仍保留65%。     

天冬氨酸酶基因工程菌固定化细胞制备L-天冬氨酸合成条件优化

以反丁烯二酸和氨水为原料,采用天冬氨酸酶基因工程菌固定化细胞生物催化法合成L-天冬氨酸。通过响应面法考察反丁烯二酸浓度、温度、p H对合成L-天冬氨酸的影响。结果表明,固定化天冬氨酸酶基因工程菌合成L-天冬氨酸最佳条件为:底物反丁烯二酸的质量浓度为300 g/L,反应温度为37℃,底物p H为7.5,L-天冬氨酸的产率为96.7%。固定化细胞可连续使用10批次。通过电镜观察发现天冬氨酸酶基因工程菌均匀分布于载体,天冬氨酸酶基因工程菌固定化细胞具有良好的稳定性。     

重组色氨酸合成酶催化合成5-羟基色氨酸

利用重组色氨酸合成酶催化合成5-羟基色氨酸,考察了pH、反应温度、底物摩尔比和底物浓度对色氨酸合成酶酶活的影响。最佳转化条件为：反应温度为35 篊,pH为9,5-羟基吲哚与工业角蛋白水解氨基酸液中L-丝氨酸的适宜底物摩尔比为1.1: 1,底物工业角蛋白水解氨基酸液中L-丝氨酸最适合浓度为200 mmol/L,反应达到平衡时间为18 h,底物L-丝氨酸摩尔转化率达到86%。     

L-色氨酸中试生产研究

为提高L-色氨酸发酵水平,在100L发酵罐上考察了不同操作条件对大肠杆菌发酵生产L-色氨酸的影响。结果表明不同操作条件对L-色氨酸发酵有显著影响。残糖浓度、补料方式、柠檬酸钠添加质量分数、接种量及溶氧量分别控制在5 g/L、溶氧控制脉冲补料、2 g/L、5%及10%～15%时,发酵效果最好,在1 m3罐上进行验证实验,L-色氨酸产量稳定在40 g/L左右。     

重组色氨酸合成酶催化合成L-5-羟基色氨酸

利用重组色氨酸合成酶催化合成L-5-羟基色氨酸,采用单因素以及响应面分析方法考察了p H、反应温度、底物浓度和底物摩尔比对L-5-羟基色氨酸合成的影响。最佳转化条件为:反应温度为32℃,p H=8.6,5-羟基吲哚与工业角蛋白水解氨基酸液中L-丝氨酸的适宜底物摩尔比为1.1∶1,底物工业角蛋白水解氨基酸液中L-丝氨酸最适合浓度为180 mmol/L,反应平衡时间为18 h,工业角蛋白水解氨基酸液中L-丝氨酸摩尔转化率达到86.5%。     

色氨酸合成酶酶法合成S-苯基-L-半胱氨酸

利用重组色氨酸合成酶催化合成S-苯基-L-半胱氨酸,考察了反应温度、pH、底物摩尔比和底物浓度对色氨酸合成酶酶活的影响。最佳转化条件为:反应温度为37℃,pH=8,苯硫酚与L-丝氨酸的适宜底物摩尔比为1.2∶1,底物最适合浓度为400 mmol/L,反应达到平衡时间为16 h,底物L-丝氨酸摩尔转化率达到91%,苯硫酚与色氨酸合成酶活性位点Ser 235和Gly 233形成稳定的氢键。     

色氨酸合成酶酶法合成S-苯基-L-半胱氨酸的研究

利用重组色氨酸合成酶催化合成S-苯基-L-半胱氨酸,考察了反应温度、pH、底物摩尔比和底物浓度对色氨酸合成酶酶活影响。最佳转化条件为：反应温度为37 篊,pH为8,L-丝氨酸与苯硫酚的适宜底物摩尔比为1:1.2,底物最适合浓度为400 mmol/L,反应达到平衡时间为16 h,底物L-丝氨酸摩尔转化率达到91%,苯硫酚与色氨酸合成酶活性位点Ser 235和Gly 233形成稳定的氢键。     

大肠杆菌色氨酸操纵子基因突变株的构建与表达

目的构建大肠杆菌色氨酸操纵子基因突变株,提高邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的产量。方法利用依赖于DpnⅠ酶的PCR方法突变表达载体pET-22b(+)-Trp Operon上的关键位点,PCR扩增Trp OperonM基因,构建pET-22b(+)-Trp OperonM重组表达质粒,经酶切及测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。制备粗酶液,经比色法测定邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性。结果 PCR扩增产物可见约7000bp的Trp OperonM条带;所构建的重组表达质粒经酶切及测序鉴定正确;邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性比大肠杆菌BL21(DE3)空菌分别提高了4.5倍和5.2倍。结论已成功构建了大肠杆菌色氨酸操纵子基因突变株BL21(DE3)/pET-22b(+)-Trp OperonM,邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性均有提高,为高产色氨酸基因工程菌的构建奠定了基础。     

固定化啤酒酵母对锶离子的吸附

用2%海藻酸钠(SA),4%氯化钙(CaCl2)包埋法制备了固定啤酒废酵母。考察了菌体含量对固定化菌体强度的影响,研究了pH值、温度、Sr2+初始浓度、吸附时间等外界因素对固定化啤酒酵母吸附溶液中Sr2+的影响。结果表明:菌体含量为10%时,制备的固定化菌体具有较好的机械强度。固定化啤酒废酵母对Sr2+最佳吸附条件为:pH=4.5,温度30℃,Sr2+起始浓度50 mg/L,吸附时间4 h。Sr2+浓度在10～150 mg/L范围内,固定化啤酒废酵母对Sr2+的吸附符合Langmuir模型和Freundlich模型,但符合Freundlich模型的程度更优。     

大肠杆菌色氨酸操纵子基因的克隆与表达

目的克隆并表达大肠杆菌色氨酸操纵子基因,提高其酶活性。方法利用PCR方法,从大肠杆菌31884基因组中直接克隆出色氨酸操纵子,并将其连接到原核表达载体pET-22b(+)中,构建重组质粒pET-22b(+)-Trpoperon,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导重组蛋白表达,表达产物经SDS-PAGE分析,并测定酶活性。结果凝胶电泳可见PCR扩增产物大小约为7000bp,SDS-PAGE鉴定目的蛋白分别得到了表达,邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性分别比对照提高了2.7和3.2倍。结论已成功构建了重组表达质粒pET-22b(+)-Trpoperon,邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性在大肠杆菌中得到了提高,为高产色氨酸基因工程菌的构建奠定了基础。     

氨基树脂固定化S-腺苷甲硫氨酸合成酶的研究

以氨基树脂为载体对S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶进行固定化,优化了酶的固定化条件并对固定化酶的性质进行了研究。优化的固定化条件为:戊二醛体积分数5%、SAM合成酶添加量20mg·g-1、固定化时间5h。所制备的固定化SAM合成酶的酶活力为476.8U·g-1,酶活力回收率为74.5%。与游离SAM合成酶相比,固定化SAM合成酶的稳定性大幅提高,在50℃孵育5h酶活力仍保留61.2%,而游离SAM合成酶则完全失活;在pH值为6.0~6.5、8.0~9.5的缓冲溶液中,固定化SAM合成酶也更加稳定;固定化SAM合成酶连续催化反应10批次,酶活力保留86.3%;固定化SAM合成酶在4℃储存30d,酶活力保留81.4%。固定化SAM合成酶米氏常数KATPm=0.14mmol·L-1,KLm-Met=0.28mmol·L-1。     

海藻酸钠明胶协同固定化黑曲霉脂肪酶

以海藻酸钠明胶为复合载体,采用包埋法制备固定化黑曲霉脂肪酶,考察了海藻酸钠、明胶浓度等因子对固定化效果的影响,比较固定化酶和游离酶对温度、pH等条件的稳定性。结果表明,制备固定化黑曲霉脂肪酶的最优条件为:海藻酸钠、明胶浓度分别为1.25%和0.5%,CaC l2浓度为10%,给酶量为450 IU/g;固定化酶最适温度为35℃,最适pH为9.0,常见有机溶剂和金属离子对固定化酶的活力影响较小。     

壳聚糖-海藻酸钠微球固定化木瓜蛋白酶的工艺研究

以壳聚糖和海藻酸钠为原材料,采用乳化交联法制备空白微球,通过戊二醛固定木瓜蛋白酶,以固定化木瓜蛋白酶的活性回收率作为最终测定指标,并以星点设计-效应面法优化实验条件。通过一系列的实验,结果表明最优条件为:固定化时间是4 h,壳聚糖与海藻酸钠的质量配比(m/m)为5∶5、加酶量为700 U/mL、戊二醛浓度为1. 0%、固定化温度为40℃。木瓜蛋白酶的固定化效果良好,木瓜蛋白酶活性回收率为68. 9%。     

响应面法优化海藻酸钠固定α-淀粉酶的研究

利用海藻酸钠为载体包埋制备固定化α-淀粉酶,在海藻酸钠浓度,氯化钙浓度和游离酶添加量的单因素实验基础上,采用响应曲面设计对三因素进行优化确定固定化的最优条件。得到的最佳条件为:海藻酸钠浓度为2.48%、氯化钙浓度为2.04%、游离酶浓度为0.23%,在该条件下进行验证实验得到固定化酶的回收率为74%,达到了较高的固定化酶的回收率。     

固定化米曲霉氨基酰化酶反应动力学及其连续拆分DL–蛋氨酸实验

探讨了用明胶-戊二醛固定化米曲霉菌球氨基酰化酶反应动力学,对固定化菌体连续光学拆分DL-蛋氨酸进行了研究. 当底物浓度小于200 mmol/L时,没有底物抑制现象,此时拆分反应速率符合Michaelis-Menten方程. 在37℃时, 米氏常数和最大反应速率分别为11.9 mmol/L和1.3 mmol/L. 在连续拆分反应中反应物体积流量为7.5 ml/h,底物浓度为200和400 mmol/L时,L-蛋氨酸的转化率分别为93%和78%. 随体积流量的增加,L-蛋氨酸转化率降低. 固定化菌体的操作半衰期为82 d.     

固定化胃蛋白酶的工艺优化

利用海藻酸钠-壳聚糖对胃蛋白酶进行固定化,以酶活回收率为指标,探讨不同的氯化钙浓度、固定化时间、游离胃蛋白酶稀释倍数、海藻酸钠浓度对固定化胃蛋白酶效果的影响。采用响应面分析法进行固定化工艺优化。结果表明:海藻酸钠浓度最佳固定化浓度为0.9%,游离酶稀释倍数为10倍,氯化钙浓度为3.6%,固定化时间为1.5 h,该条件下固定化酶的酶活回收率为73.42%,连续反应5次,相对酶活力仍为61.20%。