重庆地区儿童中人冠状病毒流行情况分析

目的了解重庆地区住院患儿所患急性呼吸道感染与人冠状病毒(Human coronavirus,HCoV)HCoV-HKU1、HCoV-NL63、HCoV-OC43和HCoV-229E的相关性,并分析这4种HCoV的流行特征。方法采集2007年4月～2009年3月于重庆医科大学附属儿童医院因急性呼吸道感染住院的996份患儿的鼻咽部分泌物,经RT-PCR检测排除呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)和人偏肺病毒(Human metapneumovirus,hMPV)阳性标本460份,采用RT-PCR法对536份RSV和hMPV阴性标本进行HCoV检测。结果 536份标本中共检出HCoV阳性10份,阳性率为1.86%,其中HCoV-HKU1 3份(0.56%),HCoV-NL63 4份(0.74%),HCoV-OC43 3份(0.56%),HCoV-229E 0份;10例患儿中男性9例,女性1例,年龄分布为0～5个月6例(60%),6～11个月2例(20%),12～23个月1例(10%),2～3岁1例(10%);3岁以上的未发现。HCoV感染呈全年散发,其中HCoV-HKU1感染集中在冬春季,HCoV-NL63和HCoV-OC43感染集中在夏秋季。HCoV感染的临床症状表现为发热、咳嗽、痰、喘息、呕吐和腹泻;临床诊断为支气管肺炎4例,间质性肺炎3例,迁延性肺炎1例,毛细支气管炎1例、急性喉气管支气管炎1例,其中有6例合并症状性腹泻。结论重庆地区因急性呼吸道感染住院的患儿中HCoV感染率较低,HCoV可引起下呼吸道感染和消化道感染。     

人偏肺病毒检测方法的比较

目的比较几种人偏肺病毒(hMPV)的检测方法,为临床选择适当的检测方法提供依据。方法不同稀释度的hMPV分别感染Vero-E6细胞,出现细胞病变(CPE)后,分别用RT-PCR、Real-time PCR和IFA进行检测,比较3种方法的灵敏度;10倍系列稀释滴度为105.2TCID50/ml的hMPV,分别用RT-PCR及Real-time PCR进行检测,定量比较两种方法的灵敏度;分别用Real-time PCR和IFA检测523份急性呼吸道感染患儿的鼻咽分泌物。结果IFA、RT-PCR和Real-time PCR分别可检出10-4、10-5、10-7稀释度孔中的病毒;RT-PCR和Real-time PCR检测的灵敏度分别为1.0×103和1TCID50/ml;在523份鼻咽分泌物标本中,IFA检测阳性率为9.18%,Real-time PCR检测阳性率为31.55%。结论Real-time PCR检测鼻咽分泌物标本中hMPV为儿科临床早期诊断的最佳方法;IFA可作为基层医院及hMPV相关严重呼吸道感染的检测方法。     

人巨细胞病毒pp65 IgG-AI快速诊断试剂的临床应用

目的评价人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)pp65 IgG-亲和力指数(Avidity index,AI)快速诊断试剂的临床应用价值。方法以自制的截短pp65重组蛋白作为诊断试剂,对本室血清库中保存的标本,采用ELISA间接法检测其特异性IgG抗体,分析该试剂的灵敏度、特异性和准确度。检测临床收集的89份患者血清标本(其中5例被明确诊断为HCMV活动性感染)的pp65 IgG抗体,并与意大利DIESSE公司IgG检测试剂盒结果进行比较。同时,对pp65 IgG阳性标本,运用尿素变性ELISA间接法检测其AI值,与意大利DIESSE公司IgM检测试剂盒结果进行比较,评价AI检测在HCMV感染诊断中的价值。结果用pp65快速诊断试剂检测阳性、阴性血清特异性IgG抗体,均与原确认结果相同,灵敏度、准确度和特异性均达100%。两种诊断试剂IgG抗体检测结果,差异无显著意义。pp65诊断试剂对pp65 IgG阳性标本的AI值进行检测,AI<60%标本共41份,阳性率为46.07%,较参比试剂IgM检测阳性率(23.59%)高;5份明确诊断HCMV活动性感染的患者血清标本中,pp65诊断试剂与参比试剂检测IgG抗体,各有4份阳性,一致率为100%,pp65诊断试剂检测AI值为阳性的标本有3份,其中,参比试剂检测IgM为阳性的仅有1份。临床明确诊断为HCMV肺炎的患者血清标本,诊断试剂检测AI值为可疑阳性,但参比试剂检测HCMV IgM抗体为阴性。结论pp65 IgG-AI快速诊断试剂可初步诊断HCMV感染,简单快速,重复性好,具有良好的临床应用前景。     

呼吸道合胞病毒TaqMan~实时定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)的TaqMan~实时定量RT-PCR检测方法。方法根据GenBank中RSV相关序列,以A、B亚型毒株基因组保守区域设计并合成RSV特异性引物和探针,采用体外转录RNA标准品,建立TaqMan~实时定量RT-PCR方法,同时验证方法特异性、检测范围、灵敏度和精密度。采用建立的方法检测50份下呼吸道感染患儿的痰样品。结果 RNA标准品建立的标准曲线R2 0. 99,扩增效率在90%～110%之间。建立的方法可特异性扩增RSV Long株和RSV A2株核酸样本,IFA和HPIV-3核酸样本均无扩增;最高可检测到1. 3×10~9 copies/μL的RNA标准品,最低可检测到单拷贝的RNA标准品;4名实验员检测同一样品Ct值的试验内CV小于1. 72%,试验间的CV在2. 44%～3. 39%之间。50份下呼吸道感染患儿痰样品中,24份为RSV阳性,阳性率为48%。结论成功建立了RSV的TaqMan~实时定量RT-PCR方法,且该方法快速、特异、灵敏,可用于临床样本中RSV的有效检测。     

2013—2022年吉林省部分麻疹确诊病例中其他病毒共感染情况分析

目的 分析2013—2022年吉林省部分麻疹确诊病例中发热伴出疹及其他呼吸道病毒的共感染情况,为麻疹合并感染多病原诊断提供科学依据。方法 收集2013—2022年吉林省106份麻疹确诊病例咽拭子标本,针对水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)、登革病毒(Dengue virus,DENV)、人类细小病毒B19(human parvovirus B19,HPV-B19)、EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)、人疱疹病毒6型(human herpesvirus6,HHV6)、人鼻病毒(human rhinovirus,HRV)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)、人腺病毒(human adenovirus,HAdV)、巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)9种发热伴出疹相关病毒及呼吸道病毒进行荧光定量PCR检测,并应用SPSS 23.0软件进行统计学分析。结果 106份标本中,未检出VZV及DENV,其他7种病毒均有检出。30.18%的麻疹病例存在与其他病毒共感...     

金樱子丙酮、甲醇、乙醇超声提取物抗EV71和RSV病毒分析

分析药用植物金樱子的三种溶剂超声取物的抗病毒生物活性。采用细胞病变法及Cell Counting Kit-8试剂盒,以治疗指数TI为研究指标,研究药用植物金樱子丙酮、甲醇、乙醇三种超声提取物对呼吸道合胞病毒(RSV)和手足口病毒(EV71)的抑制作用。60%乙醇超声提取物抗病毒效果较其他两种相对效果好,对呼吸道合胞病毒和手足口病毒的TI值分别为6.10和6.19。药用植物金樱子超声提取物具有体外抗呼吸道合胞病毒、手足口病毒的活性。     

呼吸道合胞病毒空斑检测方法的建立及应用

目的建立呼吸道合胞病毒(RSV)空斑检测方法,并用于病毒滴度的定量。方法将不同稀释度的RSVA2株病毒液分别接种于Hep-2细胞单层,加0.6%营养琼脂糖覆盖,培养6d后用10%甲醛固定。去除覆盖层,0.05%中性红染色,按文献报道的方法进行空斑计数。建立空斑法测定RSV滴度的标准曲线,并验证空斑法的准确性及精密性,应用建立的空斑法检测RSV感染BALB/c小鼠肺组织中的RSV滴度。结果RSVA2株感染的Hep-2细胞出现典型的空斑,直径约1～3mm,形态呈圆形或类圆形。空斑法的最低检测限为3.4×101PFU/ml,线性关系良好,相关系数r=0.999996,准确性及精密性均良好。RSV感染的BALB/c小鼠肺组织标本均出现数量不等的空斑。结论所建立的RSV空斑测定方法敏感、准确,能稳定地对病毒滴度进行定量测定,为进一步研究RSV的感染性和免疫原性奠定了基础。     

腮腺炎病毒临床口漱液样本的一步法实时荧光定量PCR检测

目的建立腮腺炎病毒(mumps virus,MuV)临床口漱液样本一步法荧光定量PCR检测方法,为腮腺炎的临床诊断及免疫防控提供依据。方法对101份采集自中国南部3个省、自治区(云南、四川、广西)的临床疑似腮腺炎患者口漱液样本,分别采用细胞培养-MuV特异的巢式PCR法及TaqMan探针Real-time PCR法进行检测,比较两种方法检测MuV的灵敏性。结果细胞培养-MuV特异的巢式PCR法共检出31份MuV阳性样本,系统进化分析表明,该31株MuV均属于F基因亚型;TaqMan探针Real-time PCR法共检出41份MuV阳性样本,其中包含了细胞培养-MuV特异的巢式PCR法检出的31份阳性样本,TaqMan探针Real-time RT-PCR法对MuV的检出率(40.59%)高于传统细胞培养-巢式PCR法的检出率(30.69%)。结论 TaqMan探针Real-time PCR法的灵敏性、特异性和简便性均优于传统的细胞培养-MuV特异的巢式PCR法,可应用于腮腺炎的临床诊断及免疫防控。     

呼吸道合胞病毒合胞体形成机制的研究进展

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)属于副黏病毒科肺炎病毒亚科病毒,是一种引起人严重呼吸道疾病的病原体,主要感染婴幼儿、老年人及免疫缺陷的成年人。病毒合胞体的形成是RSV感染细胞导致细胞病变的最主要特征。有研究表明,RSV的受体黏合和促融合活力主要依赖2个不同的刺突结构,分别是吸附(G)糖蛋白和融合(F)糖蛋白,G糖蛋白的主要作用是促进RSV与靶细胞的吸附,而F糖蛋白的主要作用是促进病毒与细胞、细胞与细胞之间的融合。本文就近几年RSV合胞体形成机制的研究进展作一综述。     

呼吸道合胞病毒抗体效价3种检测方法的建立及比较

目的建立呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)抗体效价的3种检测方法,并进行比较。方法棋盘滴定法优化ELISA法的包被抗原及酶标二抗的浓度,并检测该方法的线性范围及重复性;同时建立微量细胞中和试验法和蚀斑减少中和试验法,检测两种方法的重复性。用建立的3种方法及市售RSV抗体ELISA检测试剂盒同时检测55份健康人血清样本,并将两种ELISA法与两种中和抗体效价检测方法间的相关性进行两两比较。结果 ELISA法中包被抗原为10μg/ml及HRP标记的山羊抗人Ig G稀释度为1∶30 000时是最佳组合;在38.00~2.375 U/ml范围内,抗体浓度与A_(450/630)值呈良好线性关系,R~2=0.981 4;高、中、低3个浓度样本的变异系数(CV)均10%。微量细胞中和试验7 d后,细胞病变明显,细胞成片脱落;连续6次检测抗RSV多克隆抗体中和效价的CV值为4.2%。RSV感染Vero细胞7 d后出现明显的蚀斑形态,结晶紫染色后蚀斑边缘清晰;连续6次检测兔抗RSV抗血清效价的CV值为6.81%。本实验建立的ELISA法与市售ELISA试剂盒的相关系数(R)为0.787,微量细胞中和试验与蚀斑减少中和试验的R为0.937。结论成功建立了3种RSV抗体效价检测方法,本实验建立的ELISA法与市售ELISA试剂盒间及两种中和抗体检测方法间具有良好的相关性。     

人呼吸道合胞病毒荧光PCR检测方法的建立和评价

目的建立人呼吸道合胞病毒(hRSV)荧光PCR(FQ-PCR)检测方法,并确定其最低检出限。方法针对hRSVN基因相对高度保守的序列,采用引物和探针设计软件PrimerExpressv2.0,设计1对特异性引物和1条TaqMan荧光探针,组装成荧光PCR检测试剂。以此试剂检测345份咽拭子样品,与ELISA法检测hRSVIgM抗体比较,确定最低检出限。结果该方法的最低检出限是传统的病毒滴度测定的104.79倍。与IgM抗体检测法相比,对于感染早期患者具有更高的检出率。结论建立的hRSVFQ-PCR检测方法具有简便、快捷的特点,适用于hRSV感染的早期诊断。     

表达呼吸道合胞病毒F蛋白的新城疫重组病毒的构建及其免疫原性

目的利用新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)反向遗传系统构建表达呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)F蛋白的重组病毒,并以BALB/c小鼠为动物模型,评价其免疫原性。方法在已建立的NDV反向遗传系统的基础上,将RSV F基因插入NDV全长cDNA克隆中,构建并拯救获得表达RSV F蛋白的重组病毒rLS/RSV-F。采用间接免疫荧光(indirect immunoinfluscent assay,IFA)法鉴定RSV F蛋白的表达;以HA、病毒半数鸡胚感染量(50%infective dose,EID50)、半数组织感染量(50%tissue infectious dose,TCID50)及生长曲线等生物学指标对其生物学特性进行鉴定;将rLS/RSV-F滴鼻免疫BALB/c小鼠,于免疫后第49天经眼眶后静脉丛采血,分离血清,ELISA法检测IgG抗体效价,中和试验检测中和抗体效价。结果成功拯救表达RSV F蛋白的NDV重组病毒rLS/RSV-F,具有与亲本病毒相似的感染能力及生长动力学特性;rLS/RSV-F可刺激小鼠机体产生较高水平的针对RSV F蛋白的特异抗体及RSV中和抗体,与亲本病毒对照组相比,差异均有统计学意义(P <0. 05)。结论成功拯救了表达RSV F蛋白的NDV重组病毒,并通过动物实验证明重组病毒rLS/RSV-F具有较好的免疫原性,为RSV疫苗的研发提供了新思路。     

狂犬病疫苗细胞培养灭活验证实验方法的建立

目的建立狂犬病疫苗细胞培养灭活验证实验方法。方法将9批狂犬病疫苗样品及含有不同病毒量的CTN病毒悬液在Vero细胞上培养21d,丙酮固定细胞后,采用免疫荧光法检测,同时与小鼠法进行比较;并验证细胞培养法的重复性和灵敏度。结果细胞培养免疫荧光法检测的9批狂犬病疫苗样品结果均为阴性,CTN病毒液均为阳性,与小鼠法检测结果一致。细胞培养法的检测灵敏度可达3.3FFU/ml,重复性良好。结论已建立了狂犬病疫苗细胞培养灭活验证实验方法 ,该法具有良好的灵敏度和重复性,可用于狂犬病疫苗的灭活验证。     

人乳腺癌相关成纤维细胞的原代培养及其生物学特性

目的原代培养人乳腺癌相关成纤维细胞(Cancer-associated fibroblast,CAF),并检测其生物学特性。方法采用胶原酶消化培养法对26份乳腺癌患者标本进行原代细胞分离培养,倒置显微镜下观察人乳腺癌CAF的形态学特性,免疫荧光染色法鉴定所分离培养的人乳腺癌CAF纤维连结蛋白(Fibronectin,FN)和成纤维细胞活化蛋白(Fibroblast activated protein,FAP)的表达,并通过MTT法和细胞计数法绘制细胞生长曲线。结果胶原酶消化法的最适酶浓度为0.12%,最适消化时间为10 h。原代培养23份成功,3份失败。培养成功的细胞贴壁生长,形态完整,生长状态良好,背景清晰,有明显的对数生长期,并可传代培养。培养的细胞FN和FAP表达阳性,表明原代培养的CAF为乳腺癌CAF。结论胶原酶消化培养法适合人乳腺癌CAF的原代培养,通过该方法可建立理想的人乳腺癌CAF体外实验模型。     

狂犬病病毒糖蛋白基因重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因重组慢病毒表达载体,并进行鉴定。方法将狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因克隆至慢病毒载体pLVX-ZsGreen-IRES上,筛选阳性重组克隆。将质粒pLVX-ZsGreen-IRES-SRV9G、包膜质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2共转染293T包装细胞系,通过荧光显微镜观察报告基因表达情况。收集上清,经浓缩后接种293T细胞,进行重组慢病毒感染细胞的鉴定;用限制性内切酶切除质粒pLVX-ZsGreen-IRES-SRV9G绿色荧光蛋白基因,采用直接免疫荧光试验检测狂犬病病毒糖蛋白的表达情况。结果重组慢病毒表达载体经酶切和测序证明构建正确。荧光显微镜下可见重组慢病毒感染的293T细胞有大量绿色荧光出现,病毒滴度为3×107 IU/ml;直接免疫荧光检测表明,糖蛋白基因在293T细胞内获得有效表达。结论成功构建了狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因重组慢病毒载体,为狂犬病基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

Identification of a βCD-Based Hyper-Branched Negatively Charged Polymer as HSV-2 and RSV Inhibitor

Cyclodextrins and cyclodextrin derivatives were demonstrated to improve the antiviral potency of numerous drugs, but also to be endowed with intrinsic antiviral action. They are suitable building blocks for the synthesis of functionalized polymer structures with potential antiviral activity. Accordingly, four water-soluble hyper-branched beta cyclodextrin (βCD)-based anionic polymers were screened against herpes simplex virus (HSV-2), respiratory syncytial virus (RSV), rotavirus (HRoV), and influenza virus (FluVA). They were characterized by FTIR-ATR, TGA, elemental analyses, zeta-potential measurements, and potentiometric titrations, while the antiviral activity was investigated with specific in vitro assays. The polymer with the highest negative charge, pyromellitic dianhydride-linked polymer (P_PMDA), showed significant antiviral action against RSV and HSV-2, by inactivating RSV free particles and by altering HSV-2 binding to the cell. The polymer fraction with the highest molecular weight showed the strongest antiviral activity and both P_PMDA and its active fractions were not toxic for cells. Our results suggest that the polymer virucidal activity against RSV can be exploited to produce new antiviral materials to counteract the virus dissemination through the air or direct contact. Additionally, the strong HSV-2 binding inhibition along with the water solubility of P_PMDA and the acyclovir complexation potential of βCD are attractive features for developing new therapeutic topical options against genital HSV-2 infection.     

越南边境贸易进口水果有机磷农残检验监管

采用快速检验方法对水果样品进行初筛,对出现阳性结果的样品再用气相色谱法进一步定性和定量,用酶抑制率法快速检测产生阳性样品中,经气相色谱法验证阳性结果的符合率80%以上,气相色谱法检测22种有机磷农药残留的检出限为0.010～0.050mg/kg。加标回收率在87.7%～99.1%之间。建立了一种适合越南边贸进口水果有机磷农残检验监管的方法,能有效地对边贸进口水果进行有机磷农药残留的检验监管。     

猪流感复合多表位核酸疫苗的构建及其表达研究

目的构建猪流感病毒复合多表位核酸疫苗,并研究其表达产物的抗原性。方法以H3、H9亚型流感的HA抗原表位及流感病毒的其它主要抗原(NP、NA、M)表位基因为基础,再附以Kozak序列和适当的酶切位点,设计并合成一段长765bp的复合多表位基因(Epi),其中各表位基本独立,将其克隆入真核表达载体pIRES1neo,构建重组质粒pIRE-Epi。将多表位抗原基因Epi插入到融合表达基因H57中,构建重组质粒pIRE-H57-Epi。将构建的重组质粒在Hela细胞中表达,并用免疫荧光方法初步检测所表达蛋白的抗原性。结果所构建的融合表达载体pIRE-Epi和pIRE-H57-Epi,在Hela细胞中表达出流感病毒多表位抗原蛋白,并具有抗原性。结论已成功构建猪流感病毒多表位基因,有可能成为较理想的猪流感候选疫苗。