PCR-焦磷酸测序检测副溶血性弧菌研究

目的：建立用DNA碱基序列检测副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP )的方法。方法：根据副溶血性弧菌toxR基因设计扩增引物和测序引物,先用PCR特异性地扩增目的片段,再制备单链模版在测序引物引导下用焦磷酸测序法检测DNA碱基序列,检测的序列为CCAA GGATTCACAGCAGAAGCCACAGGTGCTTTT,则判断为副溶血性弧菌。结果：扩增引物和测序引物表现出良好的特异性,PCR扩增结果,20株VP均扩增出大小137bp的DNA片段,而创伤弧菌等对照菌株未扩增出DNA条带。焦磷酸测序结果,20株副溶血性弧菌均测出与预期相符的DNA碱基序列,而其他对照菌株未测出DNA 碱基序列或检测结果与测序引物后的序列不匹配。VP标准菌株ATCC 17802试验菌株发生A-T突变,密码子CCU变成CCA,而两个密码子都是脯氨酸的密码子。结论：建立的方法特异性高, 整个试验可在21h-27h完成,是快速检测VP有效手段。     

Design and validation of a novel multiplex real-time PCR assay for Vibrio pathogen detection

Three species--Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, and Vibrio vulnificus--account for the majority of vibrio infections in humans. Rapid and accurate identification of Vibrio species has been problematic because phenotypic characteristics are variable within species. Additionally, biochemical identification and confirmation require 2 or more days to complete. Rapid and sensitive molecular techniques for the detection of vibrio pathogens would be useful for the surveillance and management of outbreaks. To facilitate the identification of human-pathogenic species, we designed and validated a highly sensitive, specific, and robust multiplex real-time PCR assay to identify V. cholerae, V. parahaemolyticus, and V. vulnificus using a four-dye configuration in a convenient lyophilized format. Multiple Vibrio strains were sequenced to verify candidate target TaqMan sites. Several individual assays within the multiplex contain multiple primers or probes to ensure detection of polymorphic variants. V. cholerae, V. parahaemolyticus, and V. vulnificus were detected either individually or in mixtures at ≤30 genomic copies. V. cholerae was specifically detected in the presence or absence of Vibrio mimicus. The Vibrio multiplex assay showed 100% specificity to all targets analyzed and no detection of nearest neighbor strains. Each assay exhibited 100% ± 10% efficiency. Multiplex real-time PCR can simplify pathogen detection and reduce costs per test since three species can be analyzed in a single reaction tube. Rapid and accurate detection of pathogenic vibrios in shellfish or seawater samples will improve the microbiological safety of seafood for consumers.     

RPA等温扩增技术检测副溶血性弧菌

目的:建立副溶血性弧菌的RPA-exo荧光探针快速检测方法。方法:采用重组酶聚合酶扩增技术,以irgB为靶基因设计副溶血性弧菌的RPA-exo引物探针,对引物探针进行组合筛选,建立RPA-exo荧光探针快速检测方法,并对其特异性、灵敏度、模拟污染实验及实际应用效果进行测试。结果:建立的方法15 min可获得结果,具有高特异性,无交叉反应;灵敏度为1.0×103 CFU/mL,DNA检测限为0.35 pg/μL,质粒检测限为1×103 copies/μL;模拟污染实验中加入终浓度为1.36×103 CFU/mL时,无需增菌即可被检出;实际样品检测中,10份水产品,有3份样品被检出,检测结果与国标GB 4789.7-2013结果一致。结论:本研究成功建立了副溶血性弧菌的RPA-exo快速检测方法。     

2018年广州市水产品中创伤弧菌和河弧菌检测分析

目的 了解为期一年的监测中广州市水产品创伤弧菌和河弧菌污染水平、菌株携带毒力基因和分子分型情况。方法 对广州市水产品中创伤弧菌和河弧菌进行分离鉴定,毒力基因鉴定和肠道细菌基因间重复序列聚合酶链式反应(Eric-PCR)。结果 创伤弧菌阳性率为10.4%(31/298),河弧菌为5.0%(15/298)；用PCR法检测创伤弧菌毒力溶血素基因vvhA全部阳性,vcgC/E和16S rRNA A/B分型结果显示,共有CB型、EA型和CA型3种基因型别。河弧菌毒力相关基因vfh、toxR全部阳性,hupO携带率为60.0%(9/15)、vfp携带率为80.0%(12/15)；Eric-PCR扩增出8～14条100～2 000 bp之间的条带,将15株河弧菌在相似系数为0.8处分为5个群11个类型。结论 广州市水产品中创伤弧菌和河弧菌污染情况较严重,大部分菌株携带毒力基因,Eric-PCR结果显示15株河弧菌在亲缘关系上具有相关性,应加强防控。     

传统培养法与荧光PCR法检测弧菌的方法评价

目的 比较标准检测方法与杜邦BAX System Q7快速检测方法检测副溶血性弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌.方法 采用GB 4789.7—2013《食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》、SN/T 1022—2010《进出口食品中弧菌霍乱弧菌检验方法》、DBS 13/004—2016《食品安全地方标准创伤弧菌检验》标准和杜邦B...     

双通道荧光PCR快速检测水产品中主要致病性弧菌的研究

目的:建立水产品中副溶血弧菌和霍乱弧菌快速、敏感、特异的双通道荧光PCR同步鉴别体系.方法:针对副溶血弧菌TDH基因和霍乱弧菌ctxA基因设计合成2对特异性引物和2条Taqman探针,优化体系,建立双通道荧光PCR体系.结果:建立的双通道荧光PCR体系特异性强,引物和探针之间无干扰.对副溶血孤菌和霍乱孤菌的检测灵敏度高,下限均能达到5× 104 CFU/mL.体系稳定,重复性好,可操作性强,两种不同浓度基因组DNA无相互抑制现象,适用于不同条件、多种样品的检测.采用该方法对140份采自舟山、象山和杭州的各类水产品进行检测,副溶血弧菌和霍乱孤菌检出率分别为25.7％和3.6％,未见霍乱弧菌和副溶血弧菌混合污染的样品,表明建立的双重荧光PCR是一种可用于水产品等样品中副溶血弧菌和霍乱弧菌的快速、灵敏、特异的鉴别方法.     

智舌快速检测水产品中的麦氏弧菌

探索仿生传感器--智舌在麦氏弧菌快速检测中的可行性,以期构建一种新型的水产品中致病性弧菌的快速检测技术。用智舌结合主成分分析法对11种致病性弧菌的液体培养物进行区分,以确定该法能否将11种致病性弧菌区分开及其所需的最短培养时间,并确定针对被测物的适宜电极和频率段组合;然后用智舌结合簇类独立软模式识别法构建麦氏弧菌的判别模型,并对判别模型进行回判及验证,根据判别准确率确定最佳判别模型,从而探索智舌结合簇类独立软模式识别法能否用来建立快速检测麦氏弧菌的数据库。结果显示：当弧菌在其特异性培养基中培养7h后,智舌能很好地将11种致病性弧菌区分开;6种电极与其频率段组合下的判别模型对所有样本的判别准确率均达到了100%。说明所建模型可用于麦氏弧菌的快速筛检。     

食品中副溶血性弧菌PCR快速检测方法的研究

为建立食品中副溶血性弧菌 (VP)的PCR检测方法 ,选取tl基因作为靶序列设计一对引物 ,用该引物对 14株从国内食品中分离的副溶血性弧菌 (经传统方法验证 )和 30株非副溶血性弧菌进行PCR扩增 ,并用此方法对人工污染食品进行检测。扩增片段表现出极好的特异性 ,对人工污染的冷冻虾仁、沙丁鱼的检出限为 10CFU g ,且与传统方法结果吻合。该方法适宜于食品中副溶血性弧菌的检测。     

冰鲜金鲳鱼样品中一株副溶血性弧菌的分离与鉴定

目的对一株分离于冰鲜金鲳鱼样品中的菌株进行分析鉴定。方法利用TCBS培养基和弧菌选择性培养基从冰鲜金鲳鱼样品中分离到1株菌株sznj V083,并对该菌株的菌落形态、生理生化特征及其分子生物学特性进行分析。同时进行副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)标准菌株ATCC33847,创伤弧菌(Vibrio vulnificus)标准菌株ATCC27562的质控检验。结果该菌株在TCBS平板上呈现蓝绿色菌落,而在弧菌显色平板上呈现深蓝色菌落,其全自动生化鉴定结果显示其为创伤弧菌。PCR试验和16S rDNA序列分析表明,该菌株为副溶血性弧菌并与参考菌株Vibrio parahaemolyticus BB22OP(登陆号CP003973.1)的同源性最高。且该菌株的毒力基因tdh、trh检测为阴性。结论分离于冰鲜金鲳鱼样品中的菌株sznj V083为副溶血性弧菌。在副溶血性弧菌的检测中,除了常规的生理生化等方法外,还应该结合16S rDNA基因序列分析或PCR方法提高检测结果的特异性和灵敏度,以保证检测结果的真实性和准确性。     

海产品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌和单增李斯特菌三重荧光定量PCR检测方法的建立

目的:建立一种同时定量检测霍乱弧菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌的三重PCR方法。方法:依据霍乱弧菌CTX遗传单元中zot毒力基因;副溶血性弧菌TDH中tl基因;单增李斯特菌hly基因,设计特异性引物探针,建立和评价了检测试剂盒性能。结果:霍乱弧菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌浓度在10~2~10~5cfu/m L标准曲线线性相关系数分别为0.9998、0.999、0.9963。三种致病菌10~5cfu/m L与10~3cfu/m L两种检测浓度对数值,批内变异系数分别为0.40%、0.83%、0.49%与0.75%、0.81%、0.64%;0.76%、1.03%、0.62%与1.06%、0.72%、1.26%;0.62%、0.51%、0.81%和1.38%、0.76%、2.34%;批间变异系数分别为0.58%与0.76%;0.83%与1.01%;0.66%与1.58%。检测灵敏度分别为:23、16、35 cfu/m L。结论:本文所建立的检测试剂盒适合于海产品等产品中三种致病菌的快速筛检。      

重组酶介导扩增技术快速检测水产品中副溶血性弧菌

目的 建立重组酶介导扩增技术（RAA）快速检测副溶血性弧菌的方法。方法 本研究根据副溶血性弧菌（vibrio parahaemolyticus）tlh 基因序列设计特异性引物,经引物筛选,建立副溶血性弧菌的重组酶等温扩增（recombinase aidamplification, RAA）的快速检测方法。结果 该方法在25 ℃-43 ℃条件下,30 min即可观察到检测结果。特异性试验结果表明RAA方法检测副溶血性弧菌与其他弧菌属菌种不存在交叉反应,灵敏度试验分析结果表明RAA方法检测副溶血性弧菌检出限为5.3×101 CFU/mL。用100份样品验证RAA方法的可靠性,结果显示RAA方法和传统划线方法结果符合率为100%,表现出高度一致性。结论 本研究建立的RAA检测方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便、快速等优点,为水产品中副溶血性弧菌的检测提供了新的发展方向。     

抑制剂对副溶血性弧菌运动性的影响

通过添加不同抑制剂(EDTA、亚硝酸钠及氯化镁)观察副溶血性弧菌在泳动、群集和蹭行平板上迁移形成的可见圈大小来研究这些抑制剂对其运动性的影响。结果表明:EDTA、亚硝酸钠、氯化镁和茶多酚均可抑制副溶血性弧菌的泳动、群集及蹭行,培养基中分别含0.20 mmol/L的EDTA、50 mg/L亚硝酸钠、15.0 g/L氯化镁时,能明显抑制副溶血性弧菌的三种运动行为。因此,三种抑制剂对副溶血性弧菌的运动性有明显的影响,可作为控制副溶血弧菌污染的有效手段。     

Prevalence of potentially pathogenic Vibrio species in the seafood marketed in Malaysia

Seafood samples obtained in seafood markets and supermarkets at 11 sites selected from four states in Malaysia were examined for the presence of nine potentially pathogenic species from the genus Vibrio between July 1998 and June 1999. We examined 768 sample sets that included shrimp, squid, crab, cockles, and mussels. We extensively examined shrimp samples from Selangor State to determine seasonal variation of Vibrio populations. Eight potentially pathogenic Vibrio species were detected, with overall incidence in the samples at 4.6% for V. cholerae, 4.7% for V. parahaemolyticus, 6.0% for V. vulnificus, 11% for V. alginolyticus, 9.9% for V. metschnikovii, 1.3% for V. mimicus, 13% for V. damsela, 7.6% for V. fluvialis, and 52% for a combined population of all of the above. As many as eight Vibrio species were detected in shrimp and only four in squid and peel mussels. The overall percent incidence of any of the eight vibrios was highest (82%) in cockles (Anadara granosa) among the seafoods examined and was highest (100%) in Kuching, Sarawak State, and lowest (25%) in Penang, Pulau Penang State, among the sampling sites. Of 97 strains of V. cholerae isolated, one strain belonged to the O1 serotype and 14 to the O139 serotype. The results indicate that the various seafood markets in Malaysia are contaminated with potentially pathogenic Vibrio species regardless of the season and suggest that there is a need for adequate consumer protection measures.     

Sensitivity of Vibrio species in phosphate-buffered saline and in oysters to high-pressure processing

Multiple strains of Vibrio vulnificus, Vibrio parahaemolyticus, and Vibrio cholerae non-O1 were tested in phosphate-buffered saline for their sensitivity to high-pressure processing (HPP). Variability in sensitivity among strains was observed for all species; this variability decreased at higher pressures. V. vulnificus was the species that was most sensitive to treatment at 200 MPa (decimal reduction time [D] = 26 s), and V. cholerae was the species that was most resistant to treatment at 200 MPa (D = 149 s). The O3:K6 serotype of V. parahaemolyticus was more resistant to pressure than other serotypes of V. parahaemolyticus were. The results of studies involving V. vulnificus naturally occurring in oysters revealed that a pressure treatment of 250 MPa for 120 s achieved a > 5-log reduction in the levels of this bacterium. V. parahaemolyticus serotype O3:K6 in oysters required a pressure of 300 MPa for 180 s for a comparable 5-log reduction. When properly applied, HPP can be effective in improving the safety of shellfish with respect to Vibrio spp.     

恒温实时荧光法检测副溶血性弧菌

为了更加准确、快速地检测进出口食品中的副溶血性弧菌,针对副溶血性弧菌的tlh基因设计环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)引物,结合ESEQuant tube scanner来对扩增结果进行实时检测。结果显示:该引物扩增效率高、特异性强、灵敏度高(1-10 CFU/反应,约为荧光PCR的100倍)。126株副溶血性弧菌,恒温荧光法检测出126株,荧光PCR的方法检测出121株。恒温实时荧光检测仪与荧光PCR仪类似,均可以对检测结果进行实时监测和熔解曲线分析,表明该恒温实时荧光检测仪可广泛应用于基础实验室的科学研究或经济发展相对落后区域的临床初步诊断。     

巢式PCR快速检测海产品中的副溶血弧菌

副溶血弧菌是一种世界范围性的食源性致病菌,食用了该菌污染的海产品可导致胃肠炎等疾病。为了建立一种可快速、特异地检测海产品中副溶血弧菌的方法,通过把副溶血弧菌基因组序列和其它不同种类弧菌的基因组序列进行比较分析,筛选出了一个副溶血弧菌特异性的标记基因-VP1331,根据该基因建立了副溶血弧菌的巢式PCR快速检测方法,并评估了其特异性、敏感性和稳定性。实验结果表明,该方法只有在以副溶血弧菌基因组DNA为模板时才能扩增出目的片段,而其它11种弧菌和非弧菌均不能扩增出目的片段。该方法的最低检测限为副溶血弧菌基因组DNA 10 fg、纯培养物6.6 CFU。人工污染实验表明,初始菌液浓度为25.7 CFU/100 mL时只需经过2 h的增菌培养即可检出。上述结果表明,VP1331基因可以作为副溶血弧菌种特异性标记,本方法可以用于污染海产品中该菌的检测与鉴定。     

中国内陆6省(自治区)淡水鱼养殖、销售和餐饮环节常见嗜盐性弧菌污染调查

目的了解内陆6省(自治区)淡水鱼养殖、销售、餐饮环节鱼、水体、水底沉积物等样品中副溶血性弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌的污染状况,明确淡水鱼养殖、销售、餐饮各环节中3种嗜盐性弧菌的分布。方法在广西、河南、湖北、山东、四川、浙江6个省(自治区)的内陆地市设置采样点,采集养殖场、销售场所、餐馆的鱼样及存养鱼的对应水样。采用传统的分离培养技术检测3种嗜盐性弧菌,并进行生化鉴定。结果养殖环节水体和淡水鱼中副溶血性弧菌的检出率分别为1.89%(5/264)、5.81%(14/241),溶藻弧菌检出率分别为1.89%(5/264)、4.98%(12/241),创伤弧菌检出率分别为1.14%(3/264)、0.83%(2/241);3种嗜盐性弧菌的污染率在流通环节增高,存养水体和淡水鱼的检出率分别为副溶血性弧菌18.47%(29/157)、14.93%(40/268),溶藻弧菌10.83%(17/157)、9.70%(26/268),创伤弧菌3.18%(5/157)、3.36%(9/268);餐饮环节淡水鱼中嗜盐性弧菌的检出率与流通环节基本一致。结论传统意义上海水中常见的副溶血性弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌3种嗜盐性弧菌已经在内陆地区的淡水养殖、流通和餐饮各个环节中检出,尤其是淡水养殖环境中嗜盐性弧菌的出现可能对整个食物链产生的影响值得关注。     

两种致病性弧菌二重LAMP-熔解曲线检测方法的建立

应用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立了食品中产毒素性霍乱弧菌和副溶血性弧菌二重LAMP-熔解曲线快速检测方法。本方法针对产毒素性霍乱弧菌ctx A基因和副溶血性弧菌gyr B基因分别设计引物组进行二重LAMP扩增,并利用熔解曲线法分析扩增产物,从而判断DNA模板中所含目标菌。应用本方法对9株目标菌和17株非目标菌的检测结果与预期一致,并可通过熔解曲线的特征峰准确分析DNA模板中所含目标菌。对二重LAMP扩增产物的测序分析表明,扩增所得序列与目的基因序列吻合,从而进一步验证了该方法的特异性。经测试,本方法对两种目标菌的检测灵敏度均可达100 fg DNA/反应管。实验证明所建立的方法具有良好的特异性,并可为食品中两种致病性弧菌的快速检测提供一种重要技术手段。     

几种天然食用成分对副溶血性弧菌抑菌作用研究

副溶血性弧菌是引起我国特别是沿海地区细菌性食物中毒危害的首要食源性致病菌。本实验通过单因素试验和正交试验研究醋酸、酒精与茶多酚3 种天然食用成分对菌悬液中副溶血性弧菌存活率的影响。单因素试验结果表明：经体积分数高于50%酒精或质量浓度为0.5mg/mL的茶多酚处理5min能完全杀灭菌悬液中的副溶血性弧菌;经pH2 的醋酸溶液处理也能使菌悬液中副溶血性弧菌降低4.79lg(CFU/mL)。正交试验结果表明：酒精体积分数、茶多酚质量浓度和酸度对副溶血性弧菌的抑制效果具有明显的协同作用;pH2.8、酒精体积分数20% 及茶多酚质量浓度0.125mg/mL 或pH2.4、酒精体积分数12% 及茶多酚质量浓度0.125mg/mL 的混合体系均能有效抑制副溶血性弧菌的生长。这些研究结果说明食用酒精、醋酸和茶叶提取物的适当配合将有可能作为复合杀菌剂用于水产食品中,从而降低副溶血性弧菌感染的风险。     

广州地区海产品中创伤弧菌病原学特征分型

目的研究广州地区海产品中分离的创伤弧菌的毒力相关基因与脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型状况,初步建立区域PFGE溯源数据库,为该菌的分子流行病学研究和食源性疾病溯源提供支持。方法对68株创伤弧菌进行毒力相关基因鉴定和PFGE分型,采用Bio Numerics软件分析聚类关系。结果海产品中分离的创伤弧菌均为溶血素A基因(vvh A)核酸阳性,vcg C/E和16S rRNA A/B分型结果显示,共有5种基因型别,分别有CB型、EA型、CAB型、CA型和EB型。共检测出42株为BT1型。PFGE分型结果显示68株创伤弧菌有52种PFGE型别。结论广州地区海产品中分离的创伤弧菌PFGE型别多,且相互之间关系分散;毒力相关基因型以CB型为主。