溶血栓新药瑞替普酶生化特性确证的研究

对溶血栓新药瑞替普酶（reteplase）的鉴别和纯度测定是该基因工程药物的科研试验与工业化生产中的重要内容。采用薄层扫描、S2251发色底物法、SDS-PAGE银染、Protein C4 RP-HPLC分析柱检测、N端15个氨基酸残基分析以及激光解析飞行时间质谱分析等实验，证明笔者克隆的瑞替普本科与标准品的生化特性一致，并对工业生产中的常规检测提出了建议。     

纤溶酶溶栓新药的研究进展

纤维蛋白溶酶(纤溶酶)与传统的纤溶酶原激活剂相比,具有更为理想的溶栓效果和安全性。本文对纤溶酶、微纤溶酶及小纤溶酶作为溶栓新药的研究进展作一综述。     

重组瑞替普酶包涵体制备及其体外复性

将携带重组瑞替普酶(reteplase, rt-PA)的质粒成功转化到大肠杆菌BL21(DE3)后,诱导表达获得包涵体,考察了诱导剂浓度、培养温度和培养时间等条件对目标蛋白表达量的影响。在此基础上,对高效表达的rt-PA包涵体体外复性过程进行了详细研究。首先利用单因素实验考察了复性液pH、GSH浓度、GSH/GSSG比例、蛋白浓度等各种复性条件对复性效果的影响;并结合正交实验设计,进一步研究了高蛋白浓度下复性后rt-PA酶活变化情况。以0.2 mmol·L^-1 IPTG诱导,在33℃下培养6 h,每升发酵液约可获得1.7 g粗制包涵体。适宜的复性条件为蛋白浓度50 mg·ml^-1,pH 10.0,GSH浓度1 mmol·L^-1,GSH/GSSG比例8,复性收率为87.2%。影响高蛋白浓度下rt-PA复性的关键因素为复性液初始pH及GSH浓度,在800 mg·ml^-1蛋白浓度下复性后rt-PA比活可达7.54×10⁴ IU·mg^-1,荧光光谱分析结果表明复性后rt-PA恢复了其天然态结构。     

重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)静脉溶栓早期治疗急性脑梗死的疗效

目的观察重组组织纤溶酶原激活剂(rt-PA)静脉溶栓早期治疗急性脑梗死的临床效果和安全性。方法入选的80例急性脑梗死患者随机分为2组,对照组40例给予低分子右旋糖酐、复方丹参注射液、脑细胞活化剂、钙通道阻滞剂、肠溶阿司匹林及甘露醇常规治疗,治疗组在对照组基础上给予rt-PA0.9mg/kg(最大剂量为90mg),先于2min内静注10%,余量60min内静滴[1]。治疗时间为2周。比较2组溶栓前、后神经功能缺损积分(NIHSS)、评价溶栓治疗有效性及安全性。结果溶栓治疗后NIHSS评分明显改善,总有效率为:97.5%,溶栓后合并非症状性脑出血1例,牙龈出血5例。对照组总有效率为82.5%,牙龈出血3例。结论急性脑梗死发病4.5h时间内给予rt-PA(0.9mg/kg)静脉溶栓治疗安全有效。     

二硫键异构酶DsbC介导重组瑞替普酶在E.coli中可溶表达

瑞替普酶(reteplase)是第三代溶血栓药物,其结构中含有9对二硫键,因而重组瑞替普酶在E.coli中表达时极易形成包涵体。研究引入二硫键异构酶Dsb C介导瑞替普酶折叠过程中错配二硫键的异构,从而促进其在E.coli中的可溶表达。首先分别构建了reteplase、Dsb C表达载体p BAD/His A-R及p ACYCDuet-1-Dsb C,并共转化入E.coli BL21菌株,获得了瑞替普酶的Dsb C共表达体系。在此基础上,考察了发酵过程中诱导方式及时间、培养温度、诱导剂浓度对瑞替普酶可溶表达量的影响。在37℃、200 r·min-1的条件下培养到OD600值为0.6左右时,加入0.1 mmol·L-1的IPTG诱导二硫键异构酶Dsb C的表达;在25℃、160 r·min-1的条件下培养1 h后,加入0.5 g·L-1的L-阿拉伯糖诱导目标蛋白瑞替普酶表达,继续培养10 h收获菌体,结果表明近60%的瑞替普酶实现了可溶表达,其产量约为70 mg·L-1发酵液,用平板溶圈法测得纯化后瑞替普酶的活性为2.35×105 IU·mg-1。通过共表达二硫键异构酶Dsb C实现了瑞替普酶在E.coli中的可溶表达,有助于瑞替普酶的临床及折叠机理研究,对其他富含二硫键的重组蛋白质生产具有一定的指导意义。     

30L生物反应器培养重组CHO细胞生产重组人组织型纤溶酶原激活剂

目的应用30L填充床生物反应器培养重组CHO细胞生产重组人组织型纤溶酶原激活剂(rht-PA)。方法将表达rht-PA的CHO细胞株用含10%胎牛血清的IMDM复苏并放大培养,接种至30L生物反应器中,并采用BiocommandPlus软件系统实时监控。先用含血清的培养基生长培养,再更换为无血清培养基进行表达培养。在整个培养过程中,采用灌流培养方式,每日采样测定培养上清中葡萄糖浓度,隔日测定rht-PA的表达水平及生物学活性。采用Lysine-Sepharose4B和Zn2+-Sepharose4B两步亲和层析法纯化rht-PA,并检测纯化产物的比活、产率及纯度。结果整个培养过程持续51d,包括生长培养6d,表达培养45d,平均日灌流量为46.7L,最高达60L,共收获表达培养液约2100L;rht-PA的平均表达水平为15.15mg/L,最高可达19.25mg/L,生物学活性平均约为8000IU/ml;表达培养至第13天时,葡萄糖消耗量达最高水平(15.97g/L·d);纯化的rht-PA比活达6×105IU/mg,产率为63%,纯度达99%以上。结论应用30L填充床生物反应器可实现重组CHO细胞的长时间连续培养及产物rht-PA的高效表达。     

重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体质控方法的建立

目的建立重组人组织型纤溶酶原激活剂(tissue type plasminogen activator,tPA)改构体(TNK-tPA)的质控方法。方法采用气泡法测定TNK-tPA原液的生物学活性,非还原SDS-PAGE和RP-HPLC法测定其纯度,还原型SDS-PAGE确定其相对分子质量,HPLC-SEC法测定其单链含量,胰酶裂解法分析其肽图,Edman降解法测定其N-末端氨基酸序列,毛细管等电聚焦电泳法测定其等电点,Lowrry法测定其蛋白质含量,地高辛法测定其外源DNA残留量。按《中国药典》三部(2005版)要求,对TNK-tPA成品进行鉴别试验及外观、pH值、水分含量、无菌、装量、异常毒性等检测。结果 3批TNK-tPA原液的生物学活性为(2.09～2.16)×106U/ml,比活性均大于3.5×105U/mg,因此确定TNK-tPA原液的比活性不得低于3.0×105U/mg。3批TNK-tPA原液的非还原型SDS-PAGE纯度均大于98.0%,RP-HPLC纯度均大于97.0%;经还原型SDS-PAGE分析可见两条带,相对分子质量分别为68 000和35 000;样品原液的单链含量为75.7%;3批TNK-tPA原液的肽图酶切图谱与理化参考品一致;TNK-tPA原液的N-末端氨基酸序列、等电点、蛋白质含量、外源DNA残留量及成品的鉴别试验结果、外观、pH值、水分含量、无菌、装量、异常毒性等均符合《中国药典》三部(2005版)要求。结论建立的质控方法可保证产品安全、有效、质量可控,可用于TNK-tPA产品的常规检定。     

提高CH_3SiCl_3醇解反应的收率研究

研究了CH3 SiCl3 的低温醇解反应工艺和条件 ,论述产物中的HCl对反应的影响 ,选择适当的方法除去反应生成的HCl,达到了提高产物收率的目的     

提高CH3SiCl3醇解反应的收率研究

研究了CH3SiCl3的低温醇解反应工艺和条件。论述产物中的HCl对反应的影响,选择适当的方法除去反应生成的HCl,达到提高产物收率的目的。     

FLOW OF VISCOPLASTIC FLUIDS ON AN INCLINED PLANE: EVALUATION OF YIELD STRESS

Within the general category of so called generalized Newtonian fluids, there exists a class of materials which do not deform until the applied shear stress exceeds a critical value called yield stress. Conversely, such a material behaves like a solid as long as the shear stress is less than the yield stress. This class of materials is called viscoplastic fluids. The question whether the true yield stress exists or not is indeed far from settled (1), but the notion of a yield stress has proved to be quite useful in practice in describing the steady shear rheological behaviour of a range of materials especially of particulate suspensions. Consequently, yield stress appears as a parameter in all constitutive relations (which purport to describe the steady shear behaviour of viscoplastic materials), and its evaluation is important before an engineering flow problem can be solved. Conversely, there are some simple hydrodynamic situations which allow the value of the yield stress to be extracted from macroscopic quantities such as flow rate-pressure drop data. In this paper, we examine this possibility using gravity driven flow of a viscoplastic material on an inclined plane.     

CS2—NMP混合溶剂中煤萃取率的研究

在温和条件、室温、常压下用ＣＳ２－ＮＭＰ混合溶剂对徐州、淮北、龙口、枣庄煤各种宏观煤岩组分进行抽提,探讨了煤阶、煤冉组分与萃取率的关系。     

有机合成厂苯乙烯装置DA-401塔余热回收的研究

提出了采用热泵技术对有机合成厂苯乙烯装置DA－401塔塔顶工业余热进行回收的方案，并计算了方案实施后每年将产生378.56万元的经济效益。     

双组分聚氨酯亚光清漆的工业化研制

从工业化角度论述了聚氨酯亚光木器清漆的生产过程,并对影响亚光清漆质量的主要因素做了探讨。     

提高果壳活性炭得率研究

用化学法和化学 物理法制备果壳 (杏核、松子壳、核桃壳等 )颗粒活性炭 ,并同时对诸影响因素作了研究。其中化学法杏核炭的得率为 34.2 % ,这较传统物理法活化在得率上高出近两倍 ;化学 物理法的杏核炭的得率为 4 8.1%。经过对各项指标的检测 ,化学法制备的活性炭可用作木质净水用炭和木质味精用炭 ,后者可用作提金炭。     

喷雾干燥节能技术研究

通过从喷雾干燥所涉及的操作工艺参数和喷雾干燥工艺流程调整等方面进行探索 ,深入研究了影响喷雾干燥能耗的主要因素和相应的结果 ,并提出了针对性的解决喷雾干燥能耗高的方法 ,使得采用喷雾干燥达到理想的效果     

YIELD STRESS DETERMINATION OF ASPHALT EMULSIONS

The yield stress of asphalt emulsions was investigated as a potential quality control parameter. Viscometric data were determined using concentric cylinder, parallel plate, and cone and plate geometries. The use of a novel slotted-plate technique was investigated to determine the yield stress of asphalt emulsions in a direct way, that is to say, without extrapolation. The Saybolt viscosity was determined following the AASHTO T 72-97 standard procedure. It was found that the slotted-plate technique produced reproducible and consistent results, which were far superior to those obtained by rotational rheometer techniques. The yield stress of the emulsions appears to be a more accurate measure of the performance specification for asphalt emulsions than the Saybolt data.