大肠杆菌表达的破伤风毒素C片段的免疫原性分析

目的　分析大肠杆菌表达的破伤风毒素C片段 (简称TTC)的免疫原性。方法　利用分子生物学技术在大肠杆菌中表达破伤风毒素C片段 ,用阴离子交换层析和金属离子螯合亲和层析方法进行蛋白纯化。参照2 0 0 0年版《中国生物制品规程》的方法检测表达产物的效价。用间接血凝实验检测免疫动物血清中的破伤风抗体单位。结果　重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的 15 %。纯化后蛋白纯度达到 96 5 %。免疫效价为 18 70 6IU mg ,ED50 为 2 0 μg。 1μgTTC经 4次免疫能诱导机体产生足够的抗体 ,保护动物免受破伤风毒素的攻击。 结论　重组蛋白具有良好的免疫原性 ,为开发基因工程疫苗奠定了基础     

重组破伤风毒素C片段的原核表达、纯化及其活性

目的原核表达、纯化重组破伤风毒素C片段(rTTC),并进行活性鉴定。方法采用PCR法从破伤风梭菌基因组DNA中扩增TTC基因片段,将其插入载体pThioHisA中,构建重组表达质粒rTTC-pThioHisA,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。表达的rTTC蛋白经离子交换、凝胶层析两步纯化后,采用Western blot、免疫双扩散及动物免疫试验进行活性及免疫原性鉴定。结果重组表达质粒经双酶切鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白以包涵体和可溶性形式存在;纯化的重组蛋白纯度大于95%,能与全段破伤风毒素(TT)抗体反应,rTTC抗体能与全段TT反应。rTTC能较好地诱导家兔产生免疫反应,但诱导小鼠产生的免疫反应较弱。结论已原核表达并纯化了rTTC,其有望开发为一种新型抗破伤风芽孢梭菌疫苗及细菌多糖类结合疫苗的蛋白载体。     

破伤风毒素重组质粒的构建及应用

目的构建含破伤风毒素(Tetanus toxin,TT)特异性基因片段的重组质粒,并对其进行应用。方法采用PCR方法,以破伤风灭活菌株基因组DNA为模板,扩增TT的3个特异性基因片段,连接至pMD19-TSimple载体,构建重组质粒pMD19-TTx,以其为阳性参照对模拟破伤风危险品进行PCR检测。结果 PCR及测序证明重组质粒构建正确,以其为阳性参照可快速检出破伤风模拟危险品。结论成功构建了TT重组质粒pMD19-TTx,为破伤风梭菌的检测提供了阳性参照。     

破伤风毒素C片段基因克隆及重组表达研究

破伤风毒素片段C分子不具备神经毒毒性，在动物实验中可诱导小鼠产生中和抗体，并能保护小鼠抗破伤风毒素攻击，是理想的亚单位疫苗候选者。我们用基因工程技术在大肠杆菌中重组表达破伤风毒素片段C抗原，为研制新型破伤风疫苗打下基础。从破伤风梭状芽胞杆菌中提取其总DNA，取100ngDNA，利用PCR技术从中扩增出1.4Kb的破伤风毒素片段C基因。扩增产物经限制性内切酶BurnHI、Sail在37C酶切消化后，通过低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化，随后克隆进大肠杆菌谷航甘防流基转移酶融合表达载体PGEX－4T－2相应的限制性内切酶克隆位点，组建成重…     

破伤风毒素及其片段的纯化

本文报道了破伤风毒素及其片段AB、BC、A和C的纯化方法。应用硫酸铵沉淀和Ultrogel AcA_(34)凝胶过滤制备的纯化毒素,于SDS-PAGE和PAGE中均形成单一的蛋白带,分子量为15万,pI为5.95,毒力为1～3×10~4MLD/μg。毒素经DTT还原、尿素处理、再用Ultrogel AcA_(44)凝胶过滤制备A和BC片段。A片段的分子量为54000,pI为4.8。BC片段的分子量为98 000,pI为7.2。木瓜酶处理毒素后用高压液相层析制备AB和C片段。纯化的AB片段分子量为98 000,于等电聚焦中为2条主要区带,pI为5.3和5.5,另有数条小区带;纯化的C片段分子量为51000,于PAGE中形成5条蛋白带,于等电聚焦中主要区带的等电点为7.3,另有几条小区带。     

破伤风毒素及其片段的免疫效果

本文首次报道了破伤风毒素及其片段和片段组合对小鼠的免疫效果。通过凝胶过滤和离子交换等方法提纯了破伤风毒素及其片段。各片段中残余素素的污染率为0～0.8%。将各片段给小鼠免疫均能诱导产生保护性抗体,用破伤风毒素攻击后能使部分小鼠免于死亡。当免疫小鼠的血清抗体滴度>1∶4(0.01HAU/ml)时,小鼠在毒素攻击后一般可免于死亡,当血清抗体滴度>1∶128(0.5HAU/ml)时,则小鼠经攻毒后一般不表现出任何中毒症状,当血清抗体滴度处于二者之间时,小鼠一般表现有破伤风中毒症状,但大部分可以存活。毒素的三个片段均能诱导产生保护性抗体,但存在着明显的差别。     

A群链球菌四价重组蛋白的表达、纯化及其免疫原性

目的原核表达并纯化A群链球菌M1、3、6、18型四价重组蛋白,并检测其免疫原性。方法以克隆质粒pUC18-Strep4为模板,PCR法扩增四价重组蛋白基因,克隆至表达载体pQE30中,构建重组表达质粒,转化E.coilM15,筛选阳性克隆,IPTG诱导表达。采用Ni2+-NTA凝胶亲和层析纯化重组蛋白。以该蛋白免疫家兔,ELISA法检测血清抗体滴度;间接免疫荧光法(IFA)检测A群链球菌型特异性抗体;体外杀菌试验检测杀菌抗体活性。结果四价重组蛋白表达质粒pQE30-Strep4经双酶切和测序,证明构建正确。重组蛋白相对分子质量与预期相符,表达量约占菌体总蛋白的30%,为可溶性表达。纯化后蛋白纯度可达90%以上,并可诱导家兔产生高滴度的M1、3、6型特异性杀菌抗体。结论已成功表达了A群链球菌四价重组蛋白,纯化后的蛋白可诱导家兔产生针对A群链球菌M1、3、6三个血清型菌株的特异性杀菌抗体。     

破伤风毒素及其AB片段对金鱼的毒力

作者研究了破伤风毒素及其 AB 片段对金鱼和小鼠的毒力,发现16ng 的毒素即可使金鱼麻痹和死亡;26μg 的 AB 片段即可使小鼠麻痹和死亡,而对金鱼却无作用。当抗 C 或 AB 片段的抗体与毒素结合后,可阻断毒素对金鱼的致麻痹作用。上述结果表明,破伤风毒素可作用于金鱼的外周神经系统,而 AB 片段则不能。毒素与其受体结合是毒素对金鱼作用所必需的。     

金黄色葡萄球菌α-毒素重组蛋白的免疫原性及其免疫保护性评价

目的评价金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)无毒性α-毒素(alpha toxin,AT)重组蛋白的免疫原性及其在金葡菌49521(CP5型)和49525(CP8型)菌株中的免疫保护作用。方法根据NCBI中hla基因参考序列(NC₀07795.1),人工合成无毒突变hla H35L基因(即mhla基因)序列,克隆至pET-28a(+)载体中,构建重组质粒pET-28a-mhla,转化至E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,表达产物进行Ni柱亲和层析纯化,SDS-PAGE分析目的蛋白(mAT)的可溶性。用重组蛋白mAT+氢氧化铝佐剂(试验组)和氢氧化铝佐剂(对照组)分别于0、14、28 d经腹部皮下免疫BALB/c小鼠,攻毒前1 d小鼠眼眶采血,检测血清中IgG抗体及其亚型IgG1、IgG2a、IgG2b抗体水平;末次免疫10 d后,分别用致死剂量49521(6.0×108 CFU/只)及49525(3.0×109 CFU/只)菌液经腹腔感染两组小鼠,试验重复3次,统计小鼠存活率。结果经双酶切及测序鉴定,重组质粒pET-28a-mhla构建正确。重组蛋白mA...     

破伤风毒素全基因片段PCR扩增、克隆和序列分析

目的 对破伤风毒素全基因片段扩增、克隆和测序,以便有效利用。方法 根据A、B、C3个片段的基因序列,分别设计上游和下游引物,采用PCR扩增,并克隆3个片段,进行序列测定。结果 所克隆的基因（AF389424）与GenBank中的基因序列比较变异较小,C片段基因与国内克隆株AF154828相同。结论 为进一步研究、利用奠定基础。     

百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素基因的克隆及原核表达

目的克隆百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素(CyaA,ACT)基因,表达并纯化重组CyaA蛋白。方法从百日咳杆菌CS株的基因组DNA中PCR扩增CyaA编码基因,克隆入载体pET30a,构建重组原核表达质粒pET30a/cyaA,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经8mol/L尿素变性、透析复性、DEAE阴离子交换柱纯化后,采用Western blot法鉴定其反应原性。结果重组原核表达质粒pET30a/cyaA经PCR、双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的20%;纯化的重组蛋白纯度达90%左右,可与全细胞百日咳疫苗和无细胞百日咳疫苗免疫血清结合。结论已成功克隆了百日咳杆菌cyaA基因,并在大肠杆菌中表达了重组CyaA蛋白,为进一步开展CyaA的应用研究奠定了基础。     

血栓调节蛋白核心片段的基因克隆、表达及鉴定

目的 获得血栓调节蛋白及其核心片段,以便研制临床诊断治疗制品。方法 应用ＰＣＲ获得血栓 调节蛋白ＥＧＦ４～６的基因片段,构建克隆载体ＥＧＦ４－６／ＰＹ和表达载体ＥＧＦ４－６／ＰＢＶ２２０）,表达血栓调节蛋白ＥＧＦ４-６。结果 原核细胞表达量约占菌体可溶性蛋白的１２％,经ＫＰＴＴ试剂盘检测具有生物学活性。结论 为进一步 研究临床诊断治疗制剂创造了条件。     

破伤风毒素的提纯及形成离子通道的特性

应用硫酸铵分段沉淀和 Ultrogei AcA_(34)凝胶过滤对破伤风毒进行了提纯,并对形成的离子通道在中毒作用中的功能进行了讨论。提纯的毒素与抗粗制毒素血清形成一条沉淀线,于聚丙烯酰胺凝胶电泳中形成单一的蛋白带,分子量为15万,等电点为5.95,毒力为1～3×10~4MLD/μg 蛋白。给小鼠注射低剂量毒素引起迟发性强直性痉挛;注射高剂量毒素引起快速的类肉毒毒素的松弛性麻痹,直至死亡。应用 Patch clamp 技术,破伤风毒素于人工磷脂膜上形成离子通道。只有当膜两侧存有 pH 梯度时毒素才形成离子通道,因此是 pH 依赖的。通道的电导系数为9 PS。     

百日咳丝状血凝素分子中强免疫原性片段的筛选、克隆与表达

目的筛选百日咳丝状血凝素分子中强免疫原性的片段,并对其进行克隆及表达。方法采用生物信息学软件对丝状血凝素分子的结构进行预测,从中筛选出具有强免疫原性的片段FHAs。经PCR扩增,T-A克隆后,构建表达质粒pET-22b(+)-FHAs,酶切鉴定正确后测序。将测序正确的质粒转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白的表达,并对表达产物进行Tricine-SDS-PAGE分析及Western blot鉴定。结果从丝状血凝素分子中筛选出具有138个氨基酸的肽段FHAs,经PCR扩增,得到约400bp的目的基因片段,构建的重组质粒经双酶切和测序鉴定,证明质粒构建正确,重组工程菌pET-22b(+)-FHAs/BL21经IPTG诱导,目的蛋白的表达量在50%以上,主要以包涵体形式存在。Western blot分析证实该蛋白能与抗FHA单抗发生反应。结论筛选出的肽段FHAs具有强的免疫原性和免疫反应特异性,为百日咳基因工程疫苗的研究奠定了基础。