检测疫苗中小牛血清残存量ELISA试剂盒的研制

目的　建立一种简便、灵敏、特异、准确的疫苗中小牛血清残存量检测方法。方法　采用ELISA双抗体“夹心法” ,即固相载体上包被特异性抗小牛血清抗体 ,加入待测样品 ,反应后再加入酶标记抗小牛血清抗体 ,经显色后测定。结果　固相载体最适包被抗体的量为 1μg/孔 ,反应体系的pH为6 .8～ 7.2 ,两步反应的最佳时间各为 1h ,最适温度为 37℃。检测的最适抗原 (小牛血清 )范围为 2 0～ 10 0ng/ml,该试剂盒的灵敏度为 3ng/ml ,变异系数CV(n =2 8孔 /次 )平均为 5 .7%。经检测 6批疫苗的结果与放免结果相符合。结论　该法特异性强 ,灵敏度高 ,为疫苗中小牛血清残存量的检测提供了一种新方法     

人催乳素化学发光免疫分析试剂盒的制备及验证

目的制备人催乳素(hPRL)化学发光免疫分析(CLIA)试剂盒,并进行验证。方法采用2株不同结合位点的抗hPRL单克隆抗体,1株用于包被微孔板,另1株用于标记HRP,建立双抗体夹心检测系统,配合化学发光底物组装成试剂盒,并进行各项技术指标的验证。结果试剂盒最佳定量范围在5～100ng/ml,标准曲线的相关系数r=0.9999,灵敏度为0.49ng/ml,平均回收率为100.9%,试验内和试验间变异系数分别小于6.3%和10.9%。试剂盒有效期可达1年,特异性良好,出现Hook效应的样品浓度为1500ng/ml。与进口化学发光试剂盒和放射免疫分析试剂盒对比检测84份临床标本的结果呈高度相关,相关系数分别为0.9537和0.9486。结论已成功制备灵敏、特异的hPRLCLIA试剂盒,可用于人催乳素的临床检测。     

凝血因子制品中Tween-80残留量测定方法的研究

用比色法测定凝血因子类制品中Tween 80残留量。结果表明该方法重复性好。对FVIII、PCC和Fg 3种凝血因子制品中的Tween 80残留量重复测定 8次 ,结果分别为 7.3± 0 .986 μg ml(X±SD) ,CV =13.5 % ;35 .2± 2 .92 2 μg ml(X±SD) ,CV =8.3% ;2 1.6± 1.473μg ml(X±SD) ,CV % =6 .8。回收率 98%以上。     

单克隆抗体制品中残余SP2/0细胞蛋白含量ELISA检测试剂盒的验证

目的对单克隆抗体制品中残余SP2/0细胞蛋白含量ELISA检测试剂盒进行验证。方法对Cygnus Technologies公司制备的SP2/0Host Cell Protein(sHCPs)ELISA试剂盒进行灵敏度、精密性验证及基质干扰试验和样品稀释回收试验,并采用该试剂盒对本公司制备的10批单抗制品原液及冻干品进行检测。结果标准蛋白含量的对数与相应的光吸收值的对数,在2～200ng/ml范围内呈线性关系;该试剂盒检测限可达0.6ng/ml,定量限可达2ng/ml,灵敏度符合要求;检测低、中、高3个浓度的SP2/0HCPs样品试验内及试验间变异系数分别为15.4%、3.0%、2.1%及12.0%、3.3%、1.5%;样品基质对检测无明显干扰;单抗样品检测不存在Hook效应;检测本公司10批单抗制品原液和冻干品中SP2/0细胞蛋白残留率均小于0.01%。结论该试剂盒灵敏度高,精密性好,可用于单抗制品中残余SP2/0细胞蛋白含量的测定。     

人免疫球蛋白类制品中IgA残留量ELISA检测方法的验证及应用

目的验证人免疫球蛋白类制品中IgA残留量的ELISA检测方法,并进行应用。方法用IgA国际标准品建立与ELISA检测试剂盒相匹配的标准曲线,并验证方法的准确性、专属性、精密度及线性范围。分别采用ELISA法、紫外法和免疫比浊法检测4批静注人免疫球蛋白(pH 4)成品。同时用经验证的ELISA法检测35批静注人免疫球蛋白(pH 4)成品中的IgA含量。结果加入0. 5、1、2 IU/L标准品的样品平均回收率分别为90. 33%、94. 43%、93. 37%,CV分别为4. 5%、1. 8%、3. 1%;标准品加入100、50、25 mg/L麦芽糖的回收率分别为99. 44%、99. 38%、99. 67%,CV分别为0. 16%、0. 13%、0. 11%;两个时间点6次重复测定结果的CV均10%,且两个时间点的测定结果差异无统计学意义(P 0. 05);IgA浓度在0. 5~8 IU/L范围内与A450呈良好的线性关系,回归方程为y=0. 088 7 x2-0. 111 5 x+0. 188,R~2=0. 999 9。与紫外法和免疫比浊法比较,ELISA法检测结果偏低,紫外法最高,3种方法间差异有统计学意义(P 0. 05)。35批静注人免疫球蛋白(pH 4)成品中IgA含量均值为(22. 4±2. 24)IU/mL,CV 10%。结论 ELISA检测方法具有良好的准确性、专属性及精密度,且快速、灵敏,操作简便,可用于人免疫球蛋白类制品中IgA含量的质量监测。     

医药中间体5-氨基-2,4,6-三碘异酞酸的制备

以间苯二甲酸为原料 ,经硝化、还原与碘化 ,合成非离子含碘造影剂的中间体 5 氨基 2 ,4,6 三碘异酞酸。 (1)硝化反应 ,n(硫酸 )∶n(硝酸钠 )∶n(间苯二甲酸 ) =7 9∶2 2∶1 0 ,温度 70℃下反应 3h ,产率为 86 7% ;(2 )还原反应 ,n(铁粉 )∶n(硝基物 ) =3 0∶1 0 ,回流反应 3h ,产率为78 1% ;(3)碘化反应 ,n(氯化碘 )∶n(氨基物 ) =3 3∶1 0 ,90℃下反应 3h ,碘化反应产率为76 2 %。每步均经改进 ,总收率为 5 1 6 % ,所得产品熔点、UV、IR、1HNMR、13CNMR等数据与文献报道一致     

催化动力学光度法测定痕量钒(Ⅴ)的研究

研究了在 p H=4及没食子酸存在下 ,微量钒 ( )催化溴酸钾氧化邻苯二胺的动力学条件 ,建立了催化动力学光度法测定痕量钒 ( )的新方法。方法的测定范围为 0～ 0 .0 2 5 μg· 2 5 m L- 1 ,检出限为 1.18× 10 - 6 g·L- 1 ,相对标准偏差为 4 .6 3% (n=10 ) ,线性回归方程为△ A=2 5 .6 6 c(μg· 2 5 m L- 1 ) - 0 .0 15 7(r=0 .9997) ,表观摩尔吸光系数ε4 6 0 nm=3.2 7× 10 7L· m ol- 1 · cm- 1 。该法灵敏度高 ,选择性好 ,直接应用于水样和食品样中痕量钒( )的测定 ,结果满意     

新生鼠提取液对急性血瘀模型大鼠血液流变学的影响

目的　探讨新生鼠提取液 (NRE)对急性血瘀模型大鼠血液流变学的影响。方法　大鼠皮下注射0 1%肾上腺素 0 2ml后放冰水中浸泡 5min复制急性血瘀模型 ,应用NRE进行治疗 (NRE 2 0和 4 0ml kg每天灌胃给药 1次 ,连续 7d) ,测定大鼠血液流变学各参数变化。结果　急性血瘀模型大鼠全血黏度、血浆黏度、血浆纤维蛋白原浓度、血沉、红细胞聚集指数及红细胞刚性指数均明显降低 ,红细胞电泳时间及红细胞压积则无明显影响。结论　NRE可明显改善急性血瘀模型大鼠血液流变学 ,对于防止动脉硬化的发展及并发症的发生均有益处。     

酶联法检测流感疫苗中卵清蛋白含量试剂盒的质量验证

目的验证酶联法检测流感疫苗中卵清蛋白含量的试剂盒的质量。方法选取卵清蛋白标准品及20批全病毒流感灭活疫苗,对北京天坛生物制品股份有限公司生产的卵清蛋白ELISA试剂盒(简称天坛试剂盒)进行验证,确定该试剂盒的最佳检测区间、精密度、准确度及稳定性,并与德国Seruzym试剂盒进行比较,确定二者之间是否有相关性。结果天坛试剂盒的最佳检测区间为2.5~20ng/ml,试验间精密度分别为0.37%~9.79%、1.25%~5.57%和0.70%~5.51%,均小于10%;试验内精密度为1.28%;配制5、10和20ng/ml3个浓度的标准品,由同一实验人员分别进行9次准确度验证,回收率分别为105.67%、108.61%和98.67%;37℃放置3d与4℃保存的试剂盒检测结果之间差异无显著意义(t=2.075,P=0.0518);与进口试剂盒检测结果之间存在正相关关系(r=0.989,t=24.56,P<0.0001)和直线回归关系(b=0.629,F=602.97,P<0.0001),直线回归方程为y=0.629x-13.77。结论天坛试剂盒具有较好的精密度、准确度及稳定性;检测结果与进口试剂盒存在正相关和直线回归关系,可以用于卵清蛋白的常规检测。     

基于独特型-抗独特型玉米赤霉烯酮间接竞争ELISA检测方法的建立

目的建立基于独特型-抗独特型玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)间接竞争ELISA检测方法,并进行验证。方法采用Protein G亲和层析法纯化ZEN的β型抗独特型单抗1D5(Ab2β-1D5)腹水;以ZEN单抗Fab片段包被酶标板,Ab2β-1D5为一抗,建立ZEN的竞争ELISA检测方法,绘制标准抑制曲线,根据回归方程计算半数抑制浓度(IC50),并确定检出限(IC10)及线性范围。以ZEN类似物呕吐毒素、伏马毒素、赭曲霉素A代替ZEN作为竞争抗原,用建立的方法进行检测,验证方法的特异性;配制6个浓度的ZEN溶液(20、30、40、50、60和75 ng/ml),用建立的方法进行检测,计算试验内及试验间回收率和变异系数(CV),验证方法的准确性和精密性。结果 Ab2β-1D5单抗的纯化效果较好,浓度为4 mg/ml,效价为1∶6×104;ZEN单抗Fab片段的最佳包被浓度为1μg/ml。建立的ZEN竞争ELISA检测方法的线性回归方程为:y=-34.099 x+81.857,R2=0.994 4,IC50为8.60 ng/ml,IC10为0.58 ng/ml,线性范围为0.58~128.03 ng/ml;该方法检测ZEN类似物伏马毒素、赭曲霉素A和呕吐毒素的交叉反应率均小于0.01%;检测不同浓度ZEN的试验内平均回收率在98.65%~113.45%之间,试验间平均回收率在82.96%~98.00%之间;试验内CV值在0.48%~6.40%之间,试验间CV值在0.94%~8.27%之间。结论应用ZEN单抗的Fab片段和ZEN的β型抗独特型单抗建立了ZEN的间接竞争ELISA检测方法,该方法特异性较强,准确性和精密性良好,且成本较低,快速简便,易于标准化,适用于样品的大量筛选。     

玉米赤霉烯酮BSA-ELISA检测试剂盒的制备

目的制备玉米赤霉烯酮(ZEN)生物素-链霉抗生物素ELISA(BSA-ELISA)检测试剂盒。方法应用BSA-ELISA法制备ZEN检测试剂盒,并对试剂盒进行特异性、灵敏度、精密性、准确性及稳定性检测。结果该试剂盒对玉米赤霉烯酮特异性较好;检出范围为0.0125～192.0000ng/ml;灵敏度达0.0125ng/ml;试验内变异系数为1.8%～3.1%,试验间变异系数为4.5%～8.8%;检测人工污染的香肠样品中ZEN的平均回收率为(92.00±2.71)%,检测人工污染的生理盐水样品中ZEN的平均回收率为(85.02±4.33)%;试剂盒在4℃可保存4个月,-20℃可保存6个月。结论已成功制备了特异性强、灵敏度高、精密性好、准确性高的ZENBSA-ELISA检测试剂盒。     

病毒类疫苗Vero细胞宿主蛋白残留量检测试剂盒的适用性验证

目的对病毒类疫苗Vero细胞宿主蛋白残留量检测试剂盒进行适用性验证。方法将不同细胞基质制备的乙型脑炎灭活疫苗、人用狂犬病病毒疫苗共16批编盲后,每批疫苗均质等量分为44份,分别分发给3个实验室,用同批ELISA-Vero细胞宿主蛋白检测试剂盒进行检测,对试剂盒进行适用性验证,考核试剂盒的专属性、精密性、线性和范围等指标。结果3个实验室检测每批样品44次,原代地鼠肾细胞和鸡胚细胞为基质的疫苗检测结果均为阴性,以Vero细胞为基质的疫苗检测结果均为阳性。16份样本44次检测结果的变异系数在7.34%～14.77%之间,均低于15%;相对线性范围在12.5～400 ng/ml之间。16份疫苗中6批Vero细胞乙脑疫苗和5批人用狂犬病病毒疫苗检出的细胞宿主蛋白残留量分别在153.3～5 850.9 ng/ml和1 895.7~40 625.1 ng/ml之间。结论疫苗中Vero细胞宿主蛋白残留量检测试剂盒具有较好的专属性、精密性和线性,可用于Vero细胞为基质的病毒类疫苗宿主蛋白残留量的检测。     

化学发光免疫分析法检测人血清孕酮

目的研究用化学发光免疫分析法(CLIA)检测人血清孕酮(PROG)。方法采用竞争抑制法,用高亲和力的多克隆抗体包被,碱性磷酸酶标记孕酮,金刚烷增敏化学发光体系作为酶底物来检测PROG。并考察试剂的灵敏度、精密性、准确性、特异性和测定范围。将试剂盒置4℃存放14个月,检测质控血清的PROG含量,考察试剂的稳定性。并与进口试剂进行比较。结果CLIA法检测PROG灵敏度达0.1ng/ml;特异度99.5%;测定范围在0.1～200ng/ml之间;用PROG浓度分别为高、中、低的质控血清测定精密性,批内和批间变异系数均小于10%,回收率在91.7%～108.4%之间;与雌二醇、雌三醇和雌酮的交叉反应率低于0.1%,与睾酮和可的松无交叉反应;试剂在4℃存放14个月,质控血清的测定值均在规定范围内;与进口全自动化学发光试剂BeckmanAccessTM相比有较好的相关性。二者测定结果的符合率为99.2%。结论化学发光法灵敏度高,特异性好,稳定性强,检测范围宽,有很好的准确性和精密性,是现有放射免疫法的理想替代方法。     

流感嗜血杆菌感染反向血凝诊断试剂盒的研制

应用自制的流感嗜血杆菌（Hi）血清提取的免疫球蛋白致敏醛化血球制备的反向血凝诊断试剂盒，与美国Difco血清制备的试剂盒相比，其灵敏度无差异，均可达2～4ng／25μl，而特异性较好。应用该试剂盒检测了152份正常人血清，29份肺炎病人血清，311份尿标本（其中55份为正常儿童尿，256份为肺炎病人尿），60份肺炎病人痰标本。正常人标本检测结果均为（一），病人血清、尿、痰标本阳性率分别为13％、7％和10％。     

α1-酸性糖蛋白单克隆抗体的制备及检测方法的建立

目的制备α1-酸性糖蛋白(α1-Acid glycoprotein,α1-AGP)单克隆抗体(McAb),建立α1-AGP的ELISA检测方法,用于检测人体血液、尿液及各种组织液中α1-AGP的水平。方法用高氯酸沉淀人血清中α1-AGP,经离子交换层析和高压液相层析纯化后,免疫BALB/c小鼠,建立特异性抗α1-AGP单克隆抗体杂交瘤细胞株,制备并鉴定McAbs,分析各株分泌抗体的效价、特异性、位阻群、类及亚类。制备针对α1-AGP的双抗体夹心ELISA检测试剂盒,分析其稳定性、灵敏度和特异性,并进行临床评价。结果建立了9株特异性抗α1-AGP单克隆抗体杂交瘤细胞株,均分泌IgG抗体,所有抗体的轻链均为κ链。根据位阻分析结果,将9个细胞株分泌的抗体分为5个位阻群,腹水效价在1×10-4~1×10-7之间,且均有较好特异性。制备的α1-AGP双抗体夹心ELISA试剂盒灵敏度达2ng/ml,且检测结果与α1-AGP含量呈现良好的线性关系(r=0.9916),并与其他血清蛋白无交叉反应,试剂盒置37℃放置3d及4℃放置2个月,稳定性良好。用该试剂盒检测96份正常人血样,其α1-AGP平均值为0.43~1.32mg/ml;105份Ⅱ型糖尿病患者血样,其平均值为0.88~2.35mg/ml,经统计学分析,两者差异有显著意义。结论已成功制备出α1-AGP McAb,并建立了针对α1-AGP的双抗体夹心ELISA,制备的试剂盒可用于临床检测。     

疫苗制品中Vero细胞残余蛋白含量检测方法的建立

目的建立疫苗制品中Vero细胞残余蛋白含量检测方法。方法制备Vero细胞蛋白抗原参考品,免疫家兔,提纯抗体作为包被抗体并以酶标记,建立酶联免疫检测系统。用Vero细胞蛋白抗原参考品绘制定量标准曲线,并对各项指标进行验证。结果提纯后抗体纯度达90%以上,抗体效价为1∶64,Westernblot分析显示,提纯抗体与Vero细胞蛋白抗原参考品中绝大部分蛋白成分均能特异性结合。确定最佳抗体包被浓度为10μg/ml,酶标抗体的工作浓度为1∶1000。Vero细胞蛋白抗原参考品定量范围为12.5～800.0ng/ml时,线性关系良好,r=0.997,该方法特异性、精密度及准确度良好。将试剂于4、25和37℃分别放置3周,检测同一定量参考品和样品中Vero细胞蛋白抗原含量,差异无显著意义。结论已建立了用ELISA检测疫苗制品中Vero细胞残余蛋白含量的方法。     

巨细胞病毒感染PCR检测方法的建立

目的建立检测巨细胞病毒污染的PCR检测方法,并制备检测试剂盒。方法采用TaqMan探针,选择保守序列CMV-pp65设计引物,荧光定量病毒载量;对试剂盒进行敏感性、重复性和特异性等测试;对31份临床阳性血清标本和106份正常献血者血浆标本进行检测,并与国内同类试剂盒进行比较。结果该试剂盒检测线性定量范围可达202~3.6×109copies/ml,敏感性为360copies/ml,CV值在1%左右,特异性高,临床标本检测的符合率为100%。本试剂盒与国内已上市试剂盒比较,具有较好的相关性、更高的敏感性和更宽的定量检测范围。结论制备的试剂盒特异性和敏感性均较高,适用于临床上的病毒检测。     

神经生长因子对乙型脑炎病毒感染BHK-21细胞的抑制作用

目的观察神经生长因子(nerve growth factor,NGF)对乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染地鼠肾细胞BHK-21的抑制作用。方法将不同浓度的NGF(100、50、25、12.5、6.3、3.1、1.6和0.8μg/L)加入BHK-21细胞中,采用MTT法检测NGF对BHK-21细胞的毒性作用;将不同稀释度的JEV(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7)JEV感染BHK-21细胞,蚀斑计数法测定病毒滴度;在JEV感染的BHK-21细胞中加入不同浓度的NGF,观察细胞的CPE情况,并通过蚀斑减少率分析NGF对JEV的抑制作用。结果 NGF浓度在100μg/L以内对BHK-21细胞无毒性;JEV的滴度为Lg 8.70 pfu/ml;NGF(12.5μg/L)+JEV组BHK-21细胞病变程度明显减轻;随着NGF浓度的提高,蚀斑减少率也呈升高趋势(r=0.929,P<0.05),NGF浓度为3.1μg/L以上时,蚀斑减少率达10%以上,具有明显的抗JEV效果。结论 NGF在浓度为0.8～100μg/L的范围内,对JEV具有明显的抑制作用,为今后研究NGF抗病毒的作用机制奠定了实验基础。     

神经生长因子对大鼠视网膜缺血-再灌注损伤的保护作用

用眼内高压法造成大鼠视网膜缺血45min,然后回复常压,造成缺血-再灌注损伤。采用符合临床给药途径的眼球分注射法,小鼠颌下腺神经生长因子（NGF）250、500、1000BU／眼,于缺血损伤前及其后球旁注射,每天1次,连续4天,第10天取材病检。观察到NGF500、1000BU／眼可减轻视网膜缺血-再灌注损伤,使神经节细胞存活率增加,视网膜全层及内核层萎缩减轻。提示NGF球旁注射可扩散到视网膜,对视网膜缺血-再灌注损伤产生保护作用。