我国流行的4株狂犬病街毒株G基因序列及分子流行病学研究

目的探讨我国流行的狂犬病毒(RV)基因差异,评价现有疫苗的适用性。方法通过RT-PCR并对其产物测序后获得4株RV街毒株的G基因序列以及G与M和L基因的区间序列。利用计算机分析软件比较4株RV与已经发表的毒株的核苷酸和推导的氨基酸序列。结果糖蛋白(GP)完整的编码基因序列长度为1575 bp。GP氨基酸序列同源性明显高于相应的核苷酸序列(除Mokola外),4株街毒与CTN的同源性高于aG株。GP不同区段比较显示,膜外区同源性高于膜内区。G-M区间核苷酸序列长度为5 bp;除广西4外,其余毒株100％同源。GL区间核苷酸序列长度为2,4 bp,越1与肥东同源性为100％。结论4株RV均属于基因I型。广西的毒株之间存在不同的来源。街毒与疫苗株之间基因存在差异。4株RV与SAD-B19进化途径相近,与PV株相差较远。越1与肥东株亲缘关系极近,可能是由同一毒株演化而来。     

狂犬病毒aG株糖蛋白在CHO细胞中的表达

目的克隆狂犬病毒aG株糖蛋白(Glycoprotein)基因,构建重组真核表达载体,在CHO细胞中表达aG株糖蛋白。方法采用RTPCR,从狂犬病毒aG株基因组RNA中扩增GP基因,并将该基因克隆至真核表达载体pCIdhfr上,以脂质体介导法转染CHOdhfr-细胞。用MTX筛选的抗性克隆经ELISA、免疫荧光及Westernblot检测GP蛋白的表达。结果克隆到狂犬病毒aG株糖蛋白全长基因,并在CHO细胞中进行表达。结论成功地在CHO细胞中表达了狂犬病毒aG株的糖蛋白,为进一步开发狂犬病毒基因工程疫苗打下基础。     

浙江新分离狂犬病病毒街毒株与国内外疫苗株G基因的比较分析

目的对浙江新近分离的2株狂犬病病毒街毒株的G基因进行遗传学分析,并比较其与国内外使用的狂犬病疫苗株间的差异。方法以直接免疫荧光法和双抗体夹心ELISA法检测伤人犬脑组织,乳鼠接种分离病毒,RT-PCR扩增G基因片段,直接测序后进行遗传学分析。结果在2份伤人犬脑组织(编号LH和ZJCA1)中均检出狂犬病病毒,与其他浙江街毒株相比,G基因核苷酸和氨基酸序列同源性均为98.7%～99.2%。与当前国内外使用的多种疫苗株相比,与CTN疫苗株同源性最高,G基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为79.5%～86.1%和86.8%～94.1%。结论浙江新分离的2株狂犬病病毒街毒株属于基因1型,与当前使用的多种疫苗株相比,与CTN疫苗株属于同一分支,二者的亲缘关系最近。     

中国狂犬病毒疫苗株CTN-1-V三个代次的GP基因序列分析

目的分析三个代次CTN-1-V病毒株糖蛋白(GP)基因部分序列,并与代表性街毒株进行比较。方法利用RTPCR反应,从感染了CTN-1-V病毒的小鼠脑内获得GPcDNA的部分片段,并进行序列测定。结果三个代次的CTN-1-V病毒株GPcDNA序列的690个核苷酸与代表性狂犬病毒GP核苷酸相应序列同源性为83.2%～96.8%,氨基酸序列同源性为90.0%～97.4%。CTN1V株三代之间的核苷酸序列几乎相同。结论CTN1V株在传代过程中GP基因结构基本稳定,与中国流行的代表性街毒株的同源性高于aG株和PV株。     

新分离5株狂犬病病毒街毒株N和G基因的序列分析

目的分析我国新分离的5株狂犬病病毒(RV)街毒株基因序列及分子流行病学状况。方法采用RT-PCR法从疑似狂犬的犬脑组织内获得N和G基因cDNA的全序列并进行测序,将所得结果与已发表的国内外代表性毒株相应基因进行核苷酸和推导氨基酸序列比较。结果5株均含有完整N基因序列,3株含有完整G基因序列。与国内外发表的部分毒株比较,5株街毒N基因的核苷酸同源性在98.1%～99.9%之间,推导氨基酸同源性在99.5%～100%之间。将5株街毒与人用疫苗株3aG、PV株的N基因进行比较,核苷酸同源性在86.2%～86.7%之间,氨基酸同源性在95.1%～95.5%之间;而与人用疫苗株CTN比较,核苷酸同源性在89.4%～89.6%之间,氨基酸同源性在98.2%～98.6%之间。3株街毒G基因的核苷酸同源性在98.5%～99.4%之间,推导氨基酸同源性在99.6%～100%之间。将3株街毒与人用疫苗株aG、PV和兽用疫苗株ERA的G基因进行比较,核苷酸同源性在82.8%～83.1%之间,氨基酸同源性在88.0%～90.1%之间;而与人用疫苗株CTN比较,核苷酸同源性在86.7%～87.1%之间,氨基酸同源性均为92.0%。结论新分离街毒株基因未发生较大变异,与CTN的同源性高于与aG株和PV株。     

狂犬病病毒糖蛋白富集表位基因克隆及其在原核系统中的表达

目的构建狂犬病病毒标准强毒株(CVS-24)糖蛋白富集表位基因原核表达系统。方法通过RT-PCR扩增CVS-24株糖蛋白两段表位富集区基因,并将其克隆至载体pET-28a(+),构建重组表达质粒pET-G1和pET-G2,转化大肠杆菌Rosetta,IPTG诱导表达。表达产物分别经12%SDS-PAGE和Western blot检测。结果大肠杆菌可高效表达目的基因,所表达的蛋白可被狂犬病病毒标准阳性血清所识别。经薄层扫描分析,目的蛋白表达量可占菌体总蛋白的42%(G1)和34%(G2)。结论已成功构建了狂犬病病毒标准强毒株(CVS-24)糖蛋白富集表位基因原核表达系统,所表达的目的蛋白具有良好的免疫反应性,有可能作为检测狂犬病病毒血清抗体的候选基因。     

狂犬病病毒CVS-11株全基因序列测定及分析

目的对狂犬病病毒标准攻击毒株CVS-11株进行全基因序列测定,并就主要抗原位点与我国现用狂犬病疫苗生产毒株进行比较,评价CVS-11株作为抗狂犬病病毒中和抗体检测毒株的适用性。方法将CVS-11全基因组RNA分成8段进行RT-PCR扩增,分别将产物克隆入pGEM-TEasy载体中,测定全序列;用DNAStar软件包中的相应软件对基因全序列进行分析,并与5株生产用狂犬病病毒(CTN-1、aG、FluryLEP、PM和PV)进行基因比对分析和主要抗原位点比较。结果 CVS-11株基因组全长11927bp,其结构基因排列与已知其他狂犬病病毒相同,但G和M基因的非编码区偏长。CVS-11株与我国现用疫苗株的序列同源性在84.3%～99.5%之间。以相对保守的N基因作进化树分析,CVS-11株与PM株同源性最高,与CTN-1和aG株的亲缘关系较其他疫苗株远。各毒株G蛋白抗原位点存在一定的氨基酸差异。结论 CVS-11株与我国现用疫苗株具有较高的同源性;CVS-11株与不同疫苗株G蛋白抗原位点的差异可能对不同疫苗免疫效果评价产生不同程度的影响。     

柯萨奇病毒A组16型免疫原性及毒株间交叉保护能力的比较分析

目的对柯萨奇病毒A组16型(Coxsackie virus groups A type 16,CoxA16)4个毒株进行免疫原性及毒株间交叉保护能力的比较分析。方法提取CoxA16 G20、KM/M08、MY08和KM208病毒RNA,PCR扩增VP1基因,并进行测序;利用MEGA4.0软件中Bootstrap Test of phylogeny→Neighbor-joining方法对13株CoxA16基于VP1基因全序列构建CoxA16种系进化树并进行基因分型,使用DNAMAN软件对4个毒株VP1核苷酸序列的同源性及其蛋白质氨基酸序列差异位点进行分析。分别用纯化灭活后的4株CoxA16免疫BALB/c小鼠,于初次免疫和二次免疫后的第14、28天采血,分离血清,Western blot法检测G20毒株免疫的小鼠血清中抗体的的特异性;微量中和试验法检测血清中和抗体效价并进行交叉中和试验。结果 G20、MY08和KM208毒株属于B2b基因型,而KM/M08毒株属于B2a基因型;4个毒株间VP1基因核苷酸序列的同源性为91.8%～99.0%;MY08与其他3个毒株相比,在VP1的第102位(N→D)、241位(E→K)和248位(T→A)上存在3个差异氨基酸位点。G20毒株的抗血清可特异识别CoxA16的VP1和VP2蛋白,具有良好的免疫原性;各实验组二次免疫后第28天中和抗体效价均高于其他检测时期,其中MY08组中和抗体效价明显低于其他3组,差异有统计学意义(P﹤0.01);G20、KM/M08、和KM208毒株间的交叉保护能力优于MY08毒株对G20、KM/M08和KM208毒株的交叉保护能力,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论 4株CoxA16灭活后均能诱导机体产生相应的中和抗体和交叉保护能力,其中G20、KM/M08和KM208毒株在灭活后,显示了更好的免疫原性和毒株间交叉保护能力。     

进口轮状病毒疫苗RotaTeq的热稳定性

目的分析进口轮状病毒(rotavirus,RV)疫苗RotaTeq(RV5)的热稳定性。方法采用荧光定量PCR法分别测定22～25和37℃条件下放置不同时间的RV5疫苗滴度,以参考疫苗株滴度为标准,计算RV5疫苗5个型别毒株(G1、G2、G3、G4、P1)滴度和总滴度。同时扩增RV5疫苗G3型毒株的VP7序列,并与GenBank中登录的原型病毒株r G3的VP7序列进行比较。结果 22～25℃条件下,G1、G2、G3、G4、P1型毒株滴度和总滴度每天下降速度分别为3. 51%、2. 26%、3. 19%、5. 22%、3. 18%和3. 61%,各型别毒株间差异无统计学意义(P 0. 05);37℃条件下,G3型毒株滴度的下降速度(31. 20%/h)明显高于其他型别毒株(G1、G2、G4、P1下降速度分别为每小时0. 75%、0. 31%、1. 08%和2. 07%),差异有统计学意义(P 0. 05)。G3型毒株滴度于37℃的半衰期仅为0. 07 d,其原型株rG3的半衰期可达2. 10 d。RV5疫苗G3型疫苗株与其原型株的差异包括散在的氨基酸差异(F32L、T69A、L83F、I118T、D151G、P275L)及位于5′UTR(T25C)和3′UTR(G1041A、A1045G、G1046A、G1047A、C1048T、A1053T)较聚集的核苷酸差异。结论 RV5疫苗中各型别毒株在22～25℃时热稳定性良好,但在37℃时G3型疫苗株是影响RV5疫苗热稳定性的关键,位于VP7 UTR的核苷酸突变可能是导致其热稳定性降低的主要原因。     

狂犬病病毒4aG株G蛋白基因的克隆及其生物信息学分析

目的克隆狂犬病病毒(Rabies virus,RV)4aG株G蛋白基因,并与其他疫苗毒株G蛋白基因序列进行比较,为我国狂犬病疫苗的研制提供理论依据。方法从RV 4aG株中扩增G蛋白基因,并进行序列测定,利用生物信息学软件绘制系统进化树,预测G蛋白功能位点、二级结构和B细胞抗原表位,并与其他疫苗毒株进行比较。结果克隆的4aG株G蛋白基因序列与GenBank中登录的序列一致。进化树分析显示,4aG株与CVS株的进化关系较远;4aG、4aGV18、CVS、PV及RC-HL毒株跨膜区域在第460～479氨基酸之间,其他毒株在459～478氨基酸之间;PV株有5个糖基化位点,RV-97株有3个糖基化位点,其他毒株均有4个糖基化位点;G蛋白抗原表位位于氨基酸100～300及480～520之间;不同毒株G蛋白抗原位点区域有所不同,与CVS株比较,PV株抗原表位与其最为接近,4aG、4aGV18、CTN-1-31及Flury-HEP株与其抗原表位较为接近。结论4aG株G蛋白功能位点和抗原表位与CVS株相差较大,但其在Vero细胞上传代稳定,可用于制备Vero细胞纯化疫苗。     

狂犬病病毒糖蛋白基因重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因重组慢病毒表达载体,并进行鉴定。方法将狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因克隆至慢病毒载体pLVX-ZsGreen-IRES上,筛选阳性重组克隆。将质粒pLVX-ZsGreen-IRES-SRV9G、包膜质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2共转染293T包装细胞系,通过荧光显微镜观察报告基因表达情况。收集上清,经浓缩后接种293T细胞,进行重组慢病毒感染细胞的鉴定;用限制性内切酶切除质粒pLVX-ZsGreen-IRES-SRV9G绿色荧光蛋白基因,采用直接免疫荧光试验检测狂犬病病毒糖蛋白的表达情况。结果重组慢病毒表达载体经酶切和测序证明构建正确。荧光显微镜下可见重组慢病毒感染的293T细胞有大量绿色荧光出现,病毒滴度为3×107 IU/ml;直接免疫荧光检测表明,糖蛋白基因在293T细胞内获得有效表达。结论成功构建了狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因重组慢病毒载体,为狂犬病基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

人源抗狂犬病毒G蛋白单链抗体的表达和鉴定

目的对人源抗狂犬病毒G蛋白单链抗体A12进行可溶性表达及特异性和中和活性检测。方法表达人源单链抗体A12的菌株,经诱导后进行SDS-PAGE及Western blot检测,用流式细胞仪(FACS)检测表达狂犬病毒G蛋白的重组痘苗病毒感染Vero细胞的能力,用快速荧光灶抑制实验(RFFIT)检测表达产物的中和活性。结果Western blot显示表达产物与抗C-myc抗体在相对分子质量约30 000处出现强阳性表达带。FACS表明A12与表达狂犬病毒G蛋白的重组痘苗病毒感染的Vero细胞出现特异性反应。RFFIT表明,A12 ScFv在1∶27倍稀释时能完全中和病毒。结论已获得了A12可溶性表达,表达产物能与狂犬病毒G蛋白特异性结合,并对狂犬病毒具有一定的中和活性。     

狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3区缺失转移表达载体的构建及表达

目的构建狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3缺失转移表达载体,并在MDCK细胞系统中高效表达。方法将含狂犬病毒SRV9株糖蛋白(Rgp)cDNA的pGT载体,经双酶切后回收Rgp基因片段,与经双酶切的真核表达载体pIRES1neo连接,得到pIRES1Rgp,再经双酶切后回收2623bp片段,与E3缺失载体pBE3L连接,得到含狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3缺失转移表达载体pBE3LCRgp,再转染MDCK细胞。结果pBE3LCRgp转染的MDCK细胞,经间接ELISA和间接免疫荧光法在其培养上清中均能检出Rgp的高效表达。结论已成功构建狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3缺失转移表达载体,并在MDCK细胞中高效表达。     

狂犬病毒aG株核蛋白和糖蛋白双表达质粒的构建及其在真核细胞中的表达

目的构建狂犬病毒aG株核蛋白(NP)和糖蛋白(GP)双表达重组质粒,在中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)中表达核蛋白和糖蛋白。方法提取狂犬病毒RNA,应用RT-PCR方法扩增NP和GP基因,分别将其克隆到pIRES载体上,获得同时含有NP和GP基因的双顺反子重组质粒pING,并以脂质体介导法转染CHO-K1细胞,G418筛选,用ELISA和IFA检测NP和GP的表达。结果限制性内切酶分析表明重组质粒pING含有NP和GP基因片段,长度分别为1353bp和1575bp。应用ELISA和IFA方法,在转染细胞中均检测到NP和GP的表达。结论重组双表达质粒可在CHO细胞中同时表达NP和GP,为进一步开发重组狂犬病疫苗奠定了基础。     

狂犬病毒糖蛋白DNA疫苗的构建及免疫效果的研究

目的构建狂犬病毒糖蛋白基因DNA疫苗,并检测其免疫小鼠的免疫应答。方法用RT-PCR法扩增和分离CTN株狂犬病毒糖蛋白基因,测序后克隆入VR1055载体中,构建重组质粒VR1055-CTN,经碱裂解法提取质粒,并经Sepharose4FF柱层析纯化后免疫NIH小鼠,用ELISA法检测体液抗体,用MTT法检细胞免疫,并进行常规效力试验。结果VR1055-CTNDNA疫苗具有较好的诱导狂犬病毒抗体的能力,在诱导细胞免疫中,刺激脾淋巴细胞转化指数和小鼠血清中的IL-2活性均高于空白载体对照,差异有显著意义(P=0.000)。效力试验的小鼠存活率分别为73%和25%。结论该疫苗既能诱导体液免疫,又能诱导细胞免疫,并具有较好的免疫保护效果。     

狂犬病病毒糖蛋白真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的构建狂犬病病毒糖蛋白基因的真核细胞表达载体,并在COS-7细胞中表达。方法培养狂犬病病毒,提取负链RNA,采用RT-PCR的方法扩增糖蛋白基因,并将该基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(A)上,通过脂质体介导的方法,转染COS-7细胞,用ELISA及间接免疫荧光法检测狂犬病病毒糖蛋白在COS-7细胞中的瞬时表达。结果成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(A)/G,转染COS-7细胞后,在其培养上清中未检测到狂犬病病毒糖蛋白的表达。间接免疫荧光试验表明,pcDNA3.1(A)/G能有效地表达狂犬病病毒糖蛋白于转染的COS-7细胞膜上。结论真核细胞表达载体pcDNA3.1(A)/G能够在COS-7细胞中表达狂犬病病毒糖蛋白,为开发狂犬病病毒糖蛋白基因工程疫苗奠定了基础。     

狂犬病病毒糖蛋白基因重组逆转录病毒的构建及其免疫效果

目的构建狂犬病病毒SRV9株糖蛋白(GP)基因的重组逆转录病毒,并检测其对小鼠的免疫效果。方法酶切含狂犬病病毒SRV9株GP基因的质粒pVAX-G,将其克隆至逆转录病毒载体,构建重组质粒pLNCX-G,以脂质体介导转染包装细胞系PA317,筛选阳性细胞克隆并扩大培养。将病毒颗粒感染BHK细胞,采用PCR和RT-PCR法检测GP基因在细胞中的整合及转录,在NIH3T3细胞上测定病毒滴度。以重组逆转录病毒免疫昆明小鼠,通过荧光抗体病毒中和试验(FAVN)法检测小鼠血清抗狂犬病病毒中和抗体效价。结果所构建的重组质粒pLNCX-G经酶切鉴定正确;狂犬病病毒GP基因已整合至BHK细胞基因组中并能正常转录;病毒滴度最高可达1.2×104CFU/ml;肌肉和腹腔注射均可使部分小鼠产生抗狂犬病病毒中和抗体,其阳转率分别为6.7%和86.7%,有效保护率分别为0和76.9%。结论已成功构建了狂犬病病毒SRV9株GP基因的重组逆转录病毒,并可诱导小鼠产生一定的中和抗体,为进一步研究奠定了基础。