酒酒球菌抗酒精基因RAPD标记的研究

以抗酒精酒酒球菌和酒精敏性酒酒球菌为材料,提取基因组DNA构建抗性与敏性基因池,对RAPD-PCR反应体系进行优化,利用RAPD分子标记技术对45条随机引物进行筛选。结果引物S90在750bp附近扩增出了差异条带,且重复性好,这表明S90 750是与酒酒球菌抗酒精基因相连锁的RAPD标记。     

酒酒球菌中生物胺相关基因的检测

酒酒球菌在葡萄酒苹果酸-乳酸发酵过程中可通过脱羧基作用将氨基酸转化为生物胺.该研究采用PCR技术对27株酒酒球菌中与生物胺产生相关的基因-组氨酸脱羧酶基因、鸟氨酸脱羧酶基因、酪氨酸脱羧酶基因进行了检测,研究了这些菌株产生生物胺的特性.结果显示,所有菌株均不含有组氨酸脱羧酶基因、鸟氨酸脱羧酶基因、酪氨酸脱羧酶基因,不具有产生组胺、腐胺和酪胺的能力,因而具有较高的生物胺代谢安全性.     

酒酒球菌基因组DNA提取及RAPD反应体系的优化

以酒酒球菌SD-2a为试验材料,研究了酒酒球菌基因组DNA的提取方法,对影响RAPD-PCR反应体系的主要因素进行了优化,最终建立了适合于本实验室的RAPD反应体系.结果表明,采用改良的传统细菌基因组DNA提取方法,所提取的DNA质量较高,能够满足RAPD反应的需要;建立的RAPD-PCR反应体系为:25μL反应体积、1.0 UTaq酶、160 μmol/L dNTP、0.4 μmol/L随机引物、3.0 mmol/L Mg2+、10 ng的DNA模板用量;PCR反应程序为:94℃变性300 s,1个循环;94℃变性60 s,36℃退火60 s,72℃延伸90 s,45个循环;72℃延伸300 s.     

耐酸与酸敏酒酒球菌环丙烷脂肪酸合酶基因的差异

目的:研究筛选得到的野生耐酸与酸敏酒酒球菌环丙烷脂肪酸基因(cfa)的差异,探索酒酒球菌环丙烷脂肪酸基因与酒酒球菌耐酸性的相关性。方法:35株野生酒酒球菌中,利用酸胁迫环境筛选耐酸能力最强的菌株,并与野生酸敏菌SX-1b及实验室离子注入诱变的耐酸、酸敏突变菌a3、b2共同进行环丙烷脂肪酸基因cfa的克隆、测序和比对;选择存在氨基酸突变的野生耐酸酒酒球菌及野生酸敏菌株的cfa基因在植物乳杆菌ATCC33222中进行外源表达,从而验证耐酸菌株cfa基因与耐酸能力的相关性。结果:(1)筛选出野生型耐酸酒酒球菌CS-7b和ME-5b,确定其耐酸生长极限为p H 2.6;(2)对野生菌与诱变菌的cfa基因进行测序比对发现,耐酸菌株的野生型和诱变型的序列相同,较酒酒球菌PSU-1发生3处碱基突变,而酸敏菌野生型、诱变型的序列则与酒酒球菌PSU-1一致;(3)将SX-1b与CS-7b的cfa基因在植物乳杆菌中表达,构建重组载体pMG36ecfa1和pMG36e-cfa2,并得到对应重组菌L1和L2;(4)在pH 3.6培养基中培养,重组菌L1和L2的生长情况明显优于含空载体的植物乳杆菌L0,且L2的生长优于L1。而在p H 3.4培养基中培养,L0没有生长迹象,只有重组菌L1和L2正常生长,cfa基因的导入突破了植物乳杆菌宿主菌的生长极限。结论:酒酒球菌cfa基因及基因间存在的稳定差异与菌株耐酸表型具有一定相关性。     

酒酒球菌基因功能研究方法进展

酒酒球菌(Oenococcus oeni)是葡萄酒苹果酸-乳酸发酵(Malolactic fermentation,MLF)的主要启动者与承担者,在葡萄酒酿造工业中具有重要地位。葡萄酒生境中的高酸度、高酒精度、低温等胁迫环境的存在,使得MLF的启动常常发生延迟甚至失败,因此,需要明确在酒酒球菌中发挥胁迫应答功能的关键基因及其作用机制。研究者利用组学技术发掘出大量与酒酒球菌特定表型或功能相关的基因,但相关研究进展缓慢,亟需确证这些基因与表型或功能的确切关系及其作用机制,为代谢调控或定向菌种改造增加MLF启动稳定性提供理论与技术支撑。文章归纳了组学技术和基因工程技术在酒酒球菌和植物乳杆菌中的应用进展,以期让研究者更加关注基因工程技术在酒酒球菌基因功能及其他相关的研究中,解决酒酒球菌基因功能研究的难题。     

酒酒球菌蛋白质提取方法研究

以裂解液为提取介质,分别采用超声法、反复冻融法和玻璃珠破碎3种方法提取细菌蛋白质,通过分析细菌破碎程度、蛋白质SDS-PAGE电泳及蛋白质质量浓度,比较各提取方法的效果。结果表明,超声法细胞破碎明显,提取蛋白质条带丰度最高,蛋白质质量浓度最大,有较好的稳定性和重复性,且操作简单。     

烟草青枯病抗性基因的遗传分析及RAPD标记

选用高感青枯病品种"红花大金元"与高抗青枯病品种"Ti448A"配制杂交组合,采用温室苗期叶片人工注射法接种鉴定两亲本及其杂交后代F₁、F₂、BC₁P₁代的青枯病抗性表现,结果表明抗病亲本材料Ti448A的抗病性由一对显性基因控制。依据混合群体分组分析法(BSA)建立抗青枯病基因池和感青枯病基因池,通过RAPD试验,从近200个随机引物中筛选出一个在两池间具有多态性的引物S503,用双亲、F₁、F₂单株DNA进行RAPD试验证明了该引物扩增出的特异性片段S503-750是一个与抗青枯病基因连锁的RAPD标记,利用JOINMAP (version 1.4)软件计算得此标记与抗青枯病基因间的重组率为5.984%,连锁距离为6.261 cM。      

中国主要葡萄酒产区酒酒球菌糖苷酶活性

在苹果酸乳酸发酵（malolactic fermentation,MLF）过程中,一些酒酒球菌产生的糖苷酶活性受葡萄酒环境的影响,筛选并利用在酿酒环境中具有高活力糖苷酶的菌株进行MLF,有助于提升葡萄酒的香气复杂性。本实验以中国5 个酿酒产区19 株酿酒特性优良的酒酒球菌和一株商业菌为实验菌株,通过测定5 种糖苷酶活性,对其中5 株糖苷酶活性高的菌株研究其在葡萄酒环境中糖苷酶的酶学性质。结果表明：20 株菌在相应底物作用下均含有可检测到的糖苷酶活力,不同菌株酶活性差异显著,地区间差异不显著。5 株糖苷酶活性高的菌株最适pH值为4.0,最适温度为45 ℃,在低水平（4%乙醇＋0.1 g/100 mL果糖）时有促进作用,高水平（14%乙醇＋2 g/100 mL果糖）时抑制作用显著,葡萄糖则表现为抑制作用,但各种酶活性表现为菌株依赖性。在模拟酒条件下,菌株相对酶活力仅是菌株酶活力的9.805%～32.331%。总之,在所选菌株中,SD-1f在葡萄酒环境中的糖苷酶活性最高。     

甘肃河西走廊葡萄酒产区本土酒酒球菌发酵耐受性分析

为筛选出具有良好发酵耐受性的本土酒酒球菌(Oenococcus oeni),以甘肃河西走廊葡萄酒产区分离鉴定的7株O. oeni为供试菌株,分别对其进行pH值、乙醇、SO₂质量浓度和发酵温度等酿造因素的耐受性考察,选择耐受性较好的菌株进行复合因素(pH值×乙醇×SO₂质量浓度)适应性分析。结果表明,7株本土O. oeni发酵耐受性存在差异,且同一菌株对不同因素的抗胁迫性也不相同;菌株MG-1、MG-7、QL-11、ZX-1在pH 3.2、乙醇体积分数14%及SO₂质量浓度40 mg/L条件下均可生长增殖;影响菌株MG-1和MG-7生长的因素主次为乙醇体积分数>SO₂质量浓度>pH值,影响菌株QL-11和ZX-1生长的因素主次为乙醇体积分数>pH值>SO₂质量浓度。综合分析,供试菌株中ZX-1的发酵耐受性最强,其次为菌株MG-1、MG-7和QL-11,均具有一定的产业化应用潜力。     

酒酒球菌胁迫适应性机制的研究进展

酒酒球菌是使苹果酸乳酸发酵(MLF)能够顺利进行的重要启动者,也是耐受性最强的乳酸菌。概述了酒体温度、乙醇浓度和pH值对酒酒球菌的影响及菌体的胁迫适应性机制的研究进展,并提出目前研究存在的问题及展望。这对更好的了解酒酒球菌的特性具有重要意义。     

Differentiation of Australian wine isolates of Oenococcus oeni using random amplified polymorphic DNA (RAPD)

Intraspecific variation of Oenococcus oeni , the preferred lactic acid bacteria species for inducing malolactic fermentation in wine, was studied using the randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) strain fingerprinting technique. Ten of fifteen isolates of O. oeni from Australian wineries situated in different wine regions could be distinguished by the RAPD technique. Strains of O. oeni which originated from the same winery were either indistinguishable or closely related to each other. Six different commercially available O. oeni strains could be differentiated with the four RAPD primers used and their genetic similarity determined. Analysis of O. oeni present in wines from a single source of fruit (Cabernet Sauvignon, vintage 2002) that underwent spontaneous malolactic fermentation revealed wide genetic variation amongst the isolates. Each fermentor contained several different O. oeni strains, which were present throughout alcoholic and malolactic fermentation. These data highlight the sensitivity of RAPDs when suitable primers are applied to O. oeni of unknown genetic origin, thus enabling O. oeni strains with desirable sensory and fermentation properties to be genetically analysed.     

酒酒球菌arcABC基因簇的检测

采用PCR技术和气相色谱-质谱联用方法对西北农林科技大学葡萄酒学院保藏的50株酒酒球菌的arcABC基因簇进行检测,以确定其产生氨基甲酸乙酯的特性。结果显示：所有菌株均含有arcA、arcB和arcC基因,即arcABC基因簇;在添加精氨酸的模拟酒培养基中培养酒酒球菌30d后,通过气相色谱-质谱联用方法能够检测出微量的氨基甲酸乙酯;说明这50株酒酒球菌都具有产生氨基甲酸乙酯的能力。     

酒酒球菌（Oenococcus oeni）相关生物组学研究进展

酒酒球菌（Oenococcus oeni）是触发葡萄酒苹果酸-乳酸发酵的主要微生物,而苹果酸-乳酸发酵有利于提高葡萄酒品质,为了进一步提高酒酒球菌在葡萄酒酿造工业中的应用,通过各种生物组学方法来探究酒酒球菌的生物调节和代谢体系是必要的。本文对不同生物组学的研究手段进行汇总,并对其在酒酒球菌相关研究中的应用进行归纳和展望。     

酒酒球菌计数方法研究

以酒酒球菌为试验材料,分别用平板计数法、浊度计法、分光光度计法进行计数,所得的细胞数分别与对应的NTU值、OD值建立回归方程,方程分别为y=(0.0913 3.0075x)×107;y=(73.561x-4.8994)×107.结果显示,两个方程均有极显著的直线回归关系(P＜0.01),但前者的回归系数大于后者.因此,在酒酒球菌计数时最好用浊度计法代替平板计数法.     

酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活性与耐酸胁迫能力的相关性分析

目的:β-葡萄糖苷酶是葡萄酒中结合态香气物质释放的关键酶,但其活性受诸多因素的影响。本研究旨在从酒酒球菌自身耐酸能力的视角去分析评估菌株糖苷酶活性,探索酸胁迫下不同耐酸表型酒酒球菌与其β-葡萄糖苷酶活性之间存在的相关性关系。方法:结合利用离子注入诱变与胁迫环境筛选的方式,获得耐酸(p H 3.0)、酸敏(p H 9.0)突变酒酒球菌菌株,对其β-葡萄糖苷酶的活力进行测定,并筛选3组酸胁迫下表型差异大的β-葡萄糖苷酶基因送样测序。结果:耐酸突变酒酒球菌的β-葡萄糖苷酶酶活力是出发菌株的2~4倍,是相应酸敏突变株的2~7倍。测序结果显示,除菌株a3的β-葡萄糖苷酶基因在108位(G置换成C)和1 232(A置换成T)位处发生了突变外,其余菌株β-葡萄糖苷酶的基因均未发生改变。结论:酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活性与菌株酸胁迫能力显著相关(P0.05)。耐酸胁迫能力越强的菌株,β-葡萄糖苷酶活性越高。