PMA-LAMP检测单增李斯特活菌方法的建立

建立一种将荧光染料Propidium Monoazide(PMA)与环介导等温扩增(LAMP)相结合的检测方法,用于高效检测活的单核细胞增多性李斯特氏菌(简称单增李斯特菌)。利用PMA抑制单增李斯特死菌后进行LAMP扩增实验、并研究了PMA-LAMP方法检测单增李斯特活菌的灵敏度,同时与PMA-PCR方法灵敏度进行比较。结果表明,50μmol/L的PMA处理浓度为5×108cfu/mL单增李斯特死菌,能够完全抑制LAMP扩增。PMA-LAMP方法检测单增李斯特活菌的检出限为4.9×101cfu/mL,其灵敏度是PMA-PCR方法的10倍。该方法可以作为一种快速检测单增李斯特活菌的新技术。     

食品中单核细胞增生李斯特氏菌实时浊度(LAMP)检测方法的建立

建立单核细胞增生李斯特氏菌实时浊度LAMP检测方法。根据单核细胞增生李斯特氏菌hly A基因设计4条特异性引物,采用环介导等温扩增方法 (LAMP)建立单核细胞增生李斯特氏菌快速检测方法。建立的LAMP方法具有高度特异性,经对14株细菌进行扩增,单核细胞增生李斯特氏菌为LAMP阳性,其他菌株均为LAMP阴性。建立的LAMP方法对培养的单核细胞增生李斯特氏菌的检测下限为32 CFU/m L,可在60 min内完成扩增反应。用建立的LAMP方法对160份不同食品进行检测,共检出5份LAMP阳性样本,与传统培养方法结果一致。该方法与传统方法相比,可节省大量时间,且对试验仪器和操作人员的要求低,具有良好的实用性。     

环介导等温扩增法检测动植物源性单核细胞增生李斯特氏菌

目的采用环介导等温扩增技术检测动植物源性单核细胞增生李斯特氏菌。方法在北京市范围内各业态餐厅购买600份凉菜样品为研究对象,以单核细胞增生李斯特氏菌的hlyA基因为目标基因,设计4条特异性引物,使用环比等温扩增法(loop-to-isothermal amplification, LAMP)创建凉菜中单核细胞增生李斯特氏菌快速检测方法并将其应用于鉴定凉菜中分离的单核细胞增生李斯特氏菌。结果通过细菌分离培养法对600份凉菜进行检测,一共检测分离出37株致病菌菌株,其中包括7株单核细胞增生李斯特氏菌、10株沙门氏菌和20株大肠埃希氏菌,单核细胞增生李斯特氏菌的检出率为1.2%。用LAMP对样品中的菌株进行测定,7株凉菜中分离的单核细胞增生李斯特氏菌为阳性,其他菌株为阴性。通过LAMP方法检测动植物源性凉菜中分离的单核细胞增生李斯特氏菌平均检出限为2.2*10 CFU/μL、特异性为100%。动物源性凉菜中的致病菌含量较高。结论环介导等温扩增法具备灵敏、快速、操作简便的特点,适合用于餐饮行业的现场快速检测领域。     

环介导等温扩增技术快速检测奶粉中的单增李斯特菌

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种在等温条件下特异、灵敏、快速的新型基因扩增技术。试验以单增李斯特菌为研究对象,根据其特有的hlyA基因设计了一套特异性引物,进行LAMP扩增。结果表明,LAMP检测单增李斯特菌的灵敏度为2.45×101cfu/mL,其对人工感染奶粉样品的检出限为7.32×101cfu/mL。对其它食品病原菌进行检测,结果均未出现目的条带,特异性强。表明LAMP法适合于食品中污染单增李斯特菌的快速检测。     

食品中单核细胞增生李斯特菌DNA环介导恒温扩增快速检测方法的建立

基于单核细胞增生李斯特菌胞壁质水解酶iap基因,设计两对特异性引物,利用DNA环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,以扩增副产物焦磷酸镁实时浊度为判定标准,建立食品中单核细胞增生李斯特菌LAMP快速检测方法。结果显示,本LAMP方法特异性强,经过对29株细菌进行检测,所试单核细胞增生李斯特菌均为LAMP阳性,其他菌株为阴性;本LAMP方法对单核细胞增生李斯特菌纯培养菌的检测灵敏度为8CFU/管,对污染食品中单核细胞增生李斯特菌的检测灵敏度为12CFU/管。本研究建立的LAMP检测方法简便快速、结果判断直观。     

FTA滤膜用于PCR检测单核细胞增生李斯特氏菌的研究

建立单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria moncytones,LM)快速、敏感、特异的PCR检测方法.利用FTA滤膜提取模板DNA,采用PCR特异性扩增单增李斯特菌的溶血素基因(HIyA),并评价该方法的特异性与灵敏性.引物能特异性的扩增单增李斯特的HIyA基因,而其他细菌的扩增结果均呈现阴性:利用FTA滤膜提取模板直接检测单增李斯特具有较高的灵敏度,灵敏度为l 02 cfu/mL.利用FFA滤膜提取模板,操作简便,成本低且具有较高的灵敏度,为食品中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测提供新的手段.     

食品中单核细胞增生性李斯特氏菌PCR快速检测方法

为建立食品中单核细胞增生性李斯特氏菌 (单增李斯特氏菌 )的快速、敏感、特异的PCR检测方法 ,选取hlyA基因作为靶序列设计一对引物 ,用该引物对 6 3株从国内食品中分离的李斯特氏菌 (进行传统方法验证 )和 2 0株非李斯特氏菌进行PCR扩增 ,并用此方法对人工污染食品进行检测 ,扩增片段表现出极好的单增李斯特氏菌种特异性 ,人工污染的生肉、冷冻虾仁、卷心菜的检出限为 39cfu g ,为食品中单增李斯特氏菌的快速、敏感并且特异的检测方法。     

LAMP法检测单核细胞增生性李斯特菌的研究

单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)简称单增李斯特菌,属李斯特菌属,是食源性致病菌中的一种,它能够引起人畜共患病,在食源性细菌中毒中占主要地位。为了鉴定该菌,以单增李斯特菌的内化素基因(inlA)为靶基因,通过LAMP法对该基因扩增,并优化其反应条件。过夜培养的单增李斯特菌的菌液,取1 mL提取细菌基因组DNA,提取完成后测得其DNA含量为227 ng/μL,然后依次将其进行10倍梯度稀释,并以此作为LAMP实验模板,最终实验结果表明,LAMP检测单增李斯特菌纯菌培养物的检测限为2.27 fg/μL。     

单核细胞增生性李斯特氏菌荧光定量PCR快速检测方法的建立及初步应用

以单核细胞增生性李斯特氏菌的hly基因为靶基因,用Primer 5.0设计了特异性兼并引物,建立荧光定量PCR检测方法。并用阳性质粒标准品、不同菌株对该方法的特异性、灵敏度进行了验证,且在人工污染鲜切甜瓜上对该方法进行了初步应用。结果表明,建立的检测方法特异性强、灵敏度高,对阳性质粒标准品的灵敏度为7.69×10copies/μL,对人工污染的鲜切甜瓜中单核细胞增生性李斯特氏菌的最低检出限为3.11×10cfu/mL。     

基于双启动引物特异性检测单核细胞增生李斯特氏菌的PCR方法

以单核细胞增生李斯特氏菌iap基因为靶基因,利用一新型PCR引物设计方法--双启动引物(Dual-priming oligonucleotide,DPO),建立了特异性检测单核细胞增生李斯特氏菌的DPO-PCR方法,测试了DPO-PCR方法退火温度不敏感性、特异性及灵敏度,并在实践检测中进行了初步应用。结果显示:该方法检测单核细胞增生李斯特氏菌的灵敏度为1.51×102CFU/mL;退火温度不敏感性测试中,与常规PCR引物相比,DPO引物在48~68℃退火温度范围内均能够高效率地扩增靶基因;特异性测试中,DPO-PCR方法能特异地检测出目标菌,与其他菌株无非特异性扩增反应,比常规PCR方法显示出更强的特异性。实践应用证明,利用DPO-PCR方法对130份样本进行检测,共计检出9份单核细胞增生李斯特氏菌阳性样本,经国标法(GB/T 4789.30-2008)复检,两者检测结果一致,显示出良好的实用性,为单核细胞增生李斯特氏菌的快速准确检测提供了新方法。