酵母细胞不对称还原4-氯苯乙酮合成相应手性醇

以4-氯苯乙酮(C l-ACP)为苯环上含卤素的芳香酮的模型底物,研究了活性酵母细胞在水相体系中催化该类芳香酮不对称还原合成相应手性醇的反应特性。结果表明,酵母细胞可催化C l-ACP的不对称还原反应,产物为S-型的4-氯-α-苯乙醇(C l-PEA),反应的立体选择性很高,S-C l-PEA的e.e.值可达到99%左右。较合适的反应条件为:反应60 h,底物浓度低于20 mmol/L,体系的pH为6~8,温度为30℃左右,酵母细胞用量为20 g/L左右,以质量浓度为20 g/L的葡萄糖为辅助底物。产物得率可达到33%。同时发现酵母细胞可以选择性地氧化外消旋C l-PEA中的S-型醇为C l-ACP。     

稀土-联萘酚催化潜手性酮不对称氢转移反应

以右旋联萘酚和稀土为原料,在无水无氧下合成了2个配合物[(THF)2Na]3[Sm(R-BINOLate)3](1)与[(THF)2Na]3[Gd(R-BINOLate)3](2)。以异丙醇作氢源,在常压下配合物(1)和配合物(2)用于苯乙酮不对称氢转移反应。考察了催化剂种类、催化剂用量、反应温度对底物转化率和产物对映选择性的影响规律。结果表明,在室温条件下反应24 h,5%的配合物(1)催化苯乙酮的不对称还原反应,反应产物S-苯乙醇的e.e.值可达94%;5%的配合物(2)催化苯乙酮的不对称还原反应,反应产物S-苯乙醇的e.e.值可达85%。     

全细胞近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)SYB–1不对称转化苯基乙二醇

为了获得较高光学纯度和产率的光学纯苯基乙二醇，通过筛选得到不对称转化外消旋苯基乙二醇效果较好的菌株近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)SYB-1，其转化产物为S-苯基乙二醇，光学纯度为91% e.e.，产率为88%；通过对近平滑假丝酵母SYB-1拆分苯基乙二醇的反应条件进行优化研究，在细胞量5%、底物浓度8‰、pH值6.5、温度33℃、反应48 h条件下，产物光学纯度可以提高至e.e. 99%. 在证明中间体为b-羟基苯乙酮后推测全细胞近平滑假丝酵母SYB-1拆分外消旋苯基乙二醇的机理是通过将R-苯基乙二醇氧化为中间体后不对称还原为S-苯基乙二醇.     

引入树脂吸附促进酵母细胞不对称还原芳香酮

以酵母细胞不对称还原苯乙酮合成S-α-苯乙醇为模型反应,研究了酵母细胞催化芳香酮的不对称还原情况.首先考察了底物和产物对细胞的毒性情况及对反应的不利影响;再在此基础上研究通过引入树脂吸附控制底物和产物浓度以避免较高浓度底物和产物对细胞的毒性,进而提高反应时-空产率.实验发现苯乙酮和α-苯乙醇对酵母细胞活性具有显著的毒害,抑制反应的活性;引入树脂吸附可显著促进反应的进行,使用杭州争光树脂厂的ZG3^#树脂可获得最好的效果;当使用适量的树脂时底物初始浓度即使提高到70 mmoL·L^-1还可以获得较好的产物收率,这比未引入树脂吸附时的底物浓度提高了近1倍.     

解脂耶氏酵母不对称还原苯乙酮合成(R)-苯乙醇

为了提高解脂耶氏酵母对苯乙酮的催化效率,以20mmol/L的苯乙酮和苯乙醇为筛选压力,采用紫外诱变获得突变株,优化了反应体系参数,如温度、pH值、辅助底物、有机溶剂(如甲苯、己烷、辛烷、DMF、DMSO等)以及离子液体(1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐,BMIM·PF6)等对催化体系的影响。结果表明,利用解脂耶氏酵母突变株全细胞催化苯乙酮(20mmol/L)合成(R)-苯乙醇,转化率76%,e.e.达99.2%。优化后的反应体系如下:最适辅助底物为葡萄糖,反应温度30℃,pH=7.0,30%(体积分数)疏水性离子液体BMIM·PF6。当利用解脂耶氏酵母突变株的发酵液为催化体系,向反应体系中添加30%(体积分数) BMIM·PF6,以60mmol/L苯乙酮为底物,反应36h,(R)-苯乙醇的转化率达95%,e.e.值达97%。解脂耶氏酵母突变株全细胞催化苯乙酮不对称还原反应,在高底物浓度、高转化率以及高光学纯度等方面具有突出表现。     

烯丙基化合物对面包酵母立体选择性的影响机理

添加烯丙基化合物可以控制酵母催化不对称还原反应的立体选择性,以4-氯-3-羰基丁酸乙酯(COBE)为模型底物,用丙烯酰胺和烯丙基醇对酵母进行预处理,产物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(S-CHBE)的对映体过量值(e.e.)可以增加至94%;而用烯丙基溴预处理,则可以得到R型产物. 通过DNS法和API ZYM试验条证明烯丙基类化合物对细胞及胞内酶系存在毒害作用,且作用大小取决于烯丙基所带基团. 预处理后的酵母细胞经PBS缓冲液多次洗涤后,其活性可以逐渐得到恢复. 随着底物浓度的增加,经烯丙基醇预处理的酵母细胞,其S型产物的e.e.值维持在90%左右,而经烯丙基溴处理后,反应得到的R型产物的e.e.值则从90%下降到45%左右. 说明烯丙基类化合物竞争性地吸附于酶的活性区域,且其所带基团决定了被吸附酶的类型. 以抑制剂类似物处理酵母细胞,其反应结果说明酵母体内催化不对称还原反应的两类酶存在着空间位阻效应.     

两相系统中不对称还原2-辛酮的菌株筛选

从93株酵母、霉菌和细菌中筛选出能不对称还原2-辛酮的菌株.经过筛选获得一株博伊丁假丝酵母Candida boidinii CECT 10035.该菌种在底物浓度为78 mmol·L^-1时,能转化得到S-2-辛醇,2-辛酮转化率为32.6%,e.e.值达到95.6%.同时,还筛选出一株酒明串珠菌Oenococcus oeni CECT 4730,可以转化得到R-2-辛醇,当底物浓度为78 mmol·L^-1时,2-辛酮转化率为99.8%,e.e.值为97.8%.     

离子液体中酵母细胞催化的不对称还原反应

以咪唑类离子液体/水两相为反应体系,考察了咪唑类离子液体的不同咪唑环取代烷基链、离子液体与水相的体积比、反应温度、摇床转速和水相pH对酵母Candida Pseudotropicalis催化还原2'-氯-苯乙酮制备S-2'-氯-苯乙醇反应的影响。结果表明,随着离子液体咪唑环上取代烷基的增大,S-2'-氯-苯乙醇的收率呈下降趋势。以1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐/水两相为反应体系,在2'-氯-苯乙酮初始浓度为3 g/L,辅助底物葡萄糖浓度为50 g/L的条件下,较合适的反应条件为离子液体与水的体积比1:50,水相pH值6.8,反应温度30℃,摇床转速200 r/min,反应24 h,产物S-2'-氯-苯乙醇产率可达85.9%,ee值大于99.9%。酵母细胞催化剂的重复使用实验表明,随着使用次数增加,离子液体/水两相体系中酵母细胞的催化作用明显下降。     

活性干酵母与湿酵母催化不对称还原合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的对比研究

研究有机溶剂中面包酵母催化2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(OPBE)不对称还原合成标题化合物((R)-HPBE),分别考察用干酵母和湿酵母作催化、底物浓度、反应体系和湿酵母保存时间等凶素对OPBE转化率(X<,OPBE>)、HPBE产率(Y<,HPBE>)及(R)-HPBE的光学纯度(e.e.%)的影响.实验结果表明,湿酵母的立体选择性好于干酵母,但转化率和产率很低;乙醚为湿酵母催化较为适宜的介质.另外,湿酵母培养好后应立即反应.     

一种应用催化不对称硼氢化反应合成S-布洛芬的新方法

以4-异丁基苯乙酮为原料,发展了一条简洁的S-布洛芬不对称合成方法。经4步反应得到具有光学活性的S-布洛芬,光学纯度e.e.达到66%,总收率为61%,其关键步骤为一步催化不对称硼氢化1,1-二取代末端烯烃。     

Isolation of microbe for asymmetric reduction of prochiral aromatic ketone and its reaction characters

The favorable microbes for the asymmetric reduction of prochiral aromatic ketones was isolated from soil using acetophenone as the sole carbon source, when the asymmetric reduction of acetophenone (ACP) to chiral α-phenethyl alcohol (PEA) was chosen as the model reaction. Two microbe strains with excellent catalytic activity were obtained. They were Geotrichum candidum and Pichia pastoris identified by bacteria identification. The product of the asymmetric reduction of ACP catalyzed by Pichia pastoris was mainly R-PEA and that by Geotrichum candidum was mainly S-PEA. The yield and enantiomeric excesses (e.e.) could respectively reach 75% and 90% for Pichia pastoris, and 80% and 70% for Geotrichum candidum, much higher than those catalyzed by baker’s yeast. __________ Translated from Fine Chemicals, 2007, 24(5): 466–469 [译自: 精细化工]     

Studien zur Glyceridstruktur von Fetten VIII: Vergleichende Strukturuntersuchungen an ausgewählten natürlichen Triglyceriden mit Pankreaslipase,der Lipase von Geotrichum candidum und Äthylmagnesiumbromid

Studies on the Glyceride Structure of Fats VIII: Comparative Structural Studies of Selected Natural Triglycerides Using Pancreas Lipase, Lipase from Geotrichum candidum, and Ethyl Magnesiumbromide Studies on olive, poppyseed, linseed and rapeseed triglycerides using pancreas lipase, phospholipase A, ethyl magnesium-bromide, and lipase from Geotrichum candidum revealed that cis-9 unsaturated fatty acids preferentially occupy the position 2 of glycerides, whereas saturated fatty acids occupy preferentially the 1 and 3 positions. Erucic acid present in rapeseed oil is mainly located in the primary positions of glycerides. A method for calculating the individual classes of glycerides has been developed, which is based on the fatty acid composition of partial glycerides that are formed on hydrolysis of natural glycerides by the lipase from Geotrichum candidum. This method is applicable to glycerides which contain at least one cis-9 unsaturated fatty acid. The usefulness of this direct method for the determination of individual classes of glycerides was established by comparing the results with those reported in the literature that were obtained using other methods.     

10种药剂对柑橘采后酸腐病菌的室内毒力测定

为了筛选出防治酸腐病菌的有效药剂,为防治柑橘采后酸腐病提供理论依据,采用生长速率法测定了10种化学药剂对酸腐病菌的毒力。结果表明:肟菌酯毒力最强,EC50为0.038 5mg/L;其次是双胍三辛烷基苯磺酸盐,EC50为0.104 2 mg/L。毒力最弱的是吩胺霉素,EC50为73.112 5 mg/L。肟菌酯、双胍三辛烷基苯磺酸盐和咪鲜胺效果较好。     

表达重组人可溶性TRAIL的毕氏酵母发酵工艺

目的优化rhsTRAIL毕氏酵母工程菌在5L发酵罐中的发酵表达工艺参数。方法研究培养基种类、细胞密度、甘油含量、pH值、甲醇浓度、甲醇流加速率及诱导时间等参数对工程菌生长及目的蛋白表达的影响,并用电镜观察其诱导肿瘤细胞凋亡特征。结果在无机盐培养基中,按10%接种A600=8～12的种菌后,24h酵母菌增殖至A600=76;甘油含量为1%时,菌体生长速度快(A600=160);培养基pH值5.0,甲醇终浓度为1%时,诱导96h表达量最高达到120mg/L,并具有诱导肿瘤细胞凋亡特征。结论rhsTRAIL毕氏酵母的发酵工艺参数为无机盐培养基,pH值5.0,接种10%A600=8～12的种菌,甘油含量1%,甲醇终浓度1%,诱导96h。     

SARS病毒S2蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的研究用毕赤酵母菌表达SARS病毒S2蛋白亚单位。方法依据GenBank中SARS基因组序列,采用人工合成的方法合成SARS病毒刺突蛋白S2亚单位的基因(1590bp),再与CTL表位基因(195bp)重组后,将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建重组表达质粒pPIC9K-S2,转化毕赤酵母GS115,并经MD和MM平板筛选及PCR鉴定,得到阳性重组酵母工程菌GS115/pPIC9K-S2。经诱导、表达,并对表达产物进行分析、鉴定。结果所构建的重组质粒pPIC9K-S2正确,在毕赤酵母中可高效表达,其表达产物与阳性SARS血清产生特异性反应。结论SARS病毒刺突蛋白S2亚单位可在毕赤酵母中高效表达,产物具有良好的抗原特异性。     

人纤溶酶原K5基因在毕赤酵母中的表达及其抗肿瘤活性

目的在毕赤酵母中表达人纤溶酶原K5基因,并检测hK5蛋白的抗肿瘤活性。方法根据酵母遗传密码的偏爱性优化设计hK5基因,构建重组表达质粒p819-8α-hK5,经G418加压筛选和甲醇诱导表达,并对摇瓶发酵条件进行优化。表达的hK5蛋白经纯化后,通过荷H22肿瘤昆明小鼠模型检测其抗肿瘤活性。结果筛选到2株高表达hK5蛋白的转化子,摇瓶表达量超过150mg/L,纯化后的蛋白纯度大于95.0%,并能够显著抑制昆明小鼠H22肿瘤的生长。结论hK5基因能够在毕赤酵母中高效分泌表达,且表达的hK5蛋白具有良好的抗肿瘤活性。     

抗菌肽Cecropin D在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定

目的在毕赤酵母GS115中表达抗菌肽Cecropin D,并检测其抗菌活性。方法根据毕赤酵母密码子的偏爱性,人工合成6条寡聚核苷酸片段,经磷酸化、退火、连接并克隆入酵母表达载体pPIC9K。重组表达质粒pPIC9K-D转化至毕赤酵母菌GS115,经G418筛选,阳性高拷贝克隆用0.5%的甲醇诱导表达,表达产物经CM-Sepharose层析柱纯化,Tricine-SDS-PAGE分析,琼脂糖扩散法和比浊法测定其抗菌活性。结果经Tricine-SDS-PAGE检测,在相对分子质量3900左右处可见目的蛋白表达条带,纯化后的目的蛋白纯度达90%以上,获得的抗菌肽Cecropin D对一些革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抑菌活性。结论抗菌肽Cecropin D成功地在毕赤酵母中分泌表达,为以后深入研究抗菌肽奠定了基础。     

人溶菌酶基因在毕赤酵母中的表达及发酵条件的优化

目的在毕赤酵母中表达人溶菌酶(Human lysozyme,hLY)基因,并对发酵条件进行优化。方法将人工合成的hLY成熟肽基因克隆至表达载体pPIC9K中,电转化至毕赤酵母GS115,通过抗G418筛选获得高拷贝重组子GS115/hly,经甲醇低温诱导表达后,取发酵液上清进行SDS-PAGE分析及酶活性检测,并对培养基初始pH值、甲醇添加量、诱导温度和时间进行优化。结果人工合成的hly测序结果与GenBank中报道的核酸序列完全一致;GS115/hly经PCR鉴定,hly基因已整合入GS115基因组内;经甲醇诱导表达的GS115/hly发酵液上清具有溶菌活性,活性达30U/ml;经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约15200处可见目的蛋白条带;GS115/hly的最佳诱导条件为:培养基初始pH5.0,甲醇添加量2.0%,26℃诱导108h。结论在毕赤酵母GS115中表达了具有较高酶活性的hLY,并对发酵条件进行了初步优化。     

肉桂酸生物合成苯乙酮微生物的筛选及反应条件优化

以肉桂酸为碳源,从肉桂种植区土壤中富集筛选获得了一株能将肉桂酸高效、高选择性地转化为苯乙酮的菌株JX66,经鉴定,菌株JX66为越南伯克氏菌(Burkholderia vietnam iensis)。研究表明,在肉桂酸质量浓度为5 g/L,反应体系的初始pH=9.0,28~30℃,反应48 h,Burkholderia vietnam iensisJX66催化肉桂酸转化为苯乙酮的转化率为83.5%;反应产物为单一的苯乙酮。