大肠杆菌链长控制基因ddsA原位替换及多基因共表达对辅酶Q_（10）合成能力的影响

目的强化大肠杆菌合成辅酶Q10（CoQ10）的能力。方法利用途径工程的基本原理,对大肠杆菌辅酶Q生物合成途径中链长控制基因ispB进行遗传操作,并强化表达该途径中多个功能基因。结果首次成功用来自Gluconobacter suboxydans的十聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因ddsA原位替换大肠杆菌染色体上ispB基因,构建得到原位替换株JKL;同时强化表达CoQ生物合成途径的相关基因,发现在ubiCA和ddsA协同表达的重组菌pDCA/JKL中CoQ的合成能力比JKL提高了2.3倍,CoQ10合成量提高了2.5倍。检测该重组菌中ubiA的转录水平,发现其mRNA相对拷贝数是对照JKL的125倍。结论成功获得的重组大肠杆菌在降低内源性CoQ8合成能力的同时具备合成较长侧链CoQ10的能力,且通过强化表达相关基因使合成CoQ10的能力得到了提高。     

大肠杆菌链长控制基因ddsA原位替换及多基因共表达对辅酶Q_(10)合成能力的影响

目的强化大肠杆菌合成辅酶Q10(CoQ10)的能力。方法利用途径工程的基本原理,对大肠杆菌辅酶Q生物合成途径中链长控制基因ispB进行遗传操作,并强化表达该途径中多个功能基因。结果首次成功用来自Gluconobacter suboxydans的十聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因ddsA原位替换大肠杆菌染色体上ispB基因,构建得到原位替换株JKL;同时强化表达CoQ生物合成途径的相关基因,发现在ubiCA和ddsA协同表达的重组菌pDCA/JKL中CoQ的合成能力比JKL提高了2.3倍,CoQ10合成量提高了2.5倍。检测该重组菌中ubiA的转录水平,发现其mRNA相对拷贝数是对照JKL的125倍。结论成功获得的重组大肠杆菌在降低内源性CoQ8合成能力的同时具备合成较长侧链CoQ10的能力,且通过强化表达相关基因使合成CoQ10的能力得到了提高。     

促进剂对辅酶Q10生物合成的影响

目的研究不同的添加物对辅酶Q10发酵合成的影响。方法辅酶Q10用皂化法提取,高效液相法检测。结果添加与辅酶Q10的合成有关物质如对羟基苯甲酸、胡萝卜汁、西红柿汁及烟叶,均能提高辅酶Q10的产量,分别提高6.3%、9.0%、18.1%、12.1%。     

辅酶Q10临床应用研究进展

综述了辅酶Q10在心脏疾病、高血压、肝炎、乙型脑炎、帕金森病等方面的临床应用。     

诱导子对烟草细胞辅酶Q10生物合成的影响

比较了甘露醇、纤维素酶、果胶酶、水杨酸及茄子黄萎病菌和番茄叶霉病菌菌丝灭活物等几种诱导子对烟草NC89细胞生长和辅酶Q10合成的影响.结果表明:适宜浓度的甘露醇有利于NC89细胞生长,但抑制胞内辅酶Q10合成,当其浓度为5.0 mg/L时,NC89细胞干重提高14.6%,辅酶Q10产量仅提高1.9%;水杨酸、果胶酶及番茄叶霉病菌诱导子对NC89细胞生长有一定抑制作用,但可促进胞内辅酶Q10的合成,当水杨酸浓度和番茄叶霉病菌诱导子浓度分别为5.0 mg/L和25 mL/L时,胞内辅酶Q10含量分别提高25.8%和66.1%,但辅酶Q10产量分别降低7.0%和1.9%,当果胶酶浓度为3 U/L时,胞内辅酶Q10含量增加54.0%,辅酶Q10产量增加40.0%;茄子黄萎病菌诱导子及纤维素酶既有利于NC89细胞的生长,又可促进其胞内辅酶Q10的合成,当其浓度分别为25 mL/L和2 U/L时,辅酶Q10产量分别提高71.1%和36.6%.     

发酵条件对豌豆根瘤菌细胞生长和辅酶Q10合成的影响

以豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)1.1723为研究对象,对影响细胞生长和辅酶Q10合成的培养条件:温度、pH值、接种量、装液量、收集时间等进行了研究.结果表明:菌株的最适生长条件为pH值5.0,温度30℃,接种量体积分数2%,装液量25mL,培养时间24h,辅酶Q10的合成量最高.     

辅酶Q10市场陡增

<正>随着人们对辅酶Q10的认识进一步提高,积极使用辅酶Q10补充剂的消费者人数也在增加。据估计,目前在美国,大约有600万名消费者每天平均补充82 mg的辅酶Q10。鉴于对抗氧化剂辅酶Q10的需求急剧上升,原料供应商ZMC公司预计,今年辅酶Q10市场的增长率将达到两位数。2007年,大约有170 t辅酶Q10在美国市场上销售。     

前体物质对烟草细胞辅酶Q10合成的影响

采用细胞培养法研究了辅酶Q10、对羟基苯甲酸、茄尼醇、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸和甲硫氨酸等前体物质对烟草NC89悬浮细胞干重、辅酶Q10产量和胞内辅酶Q10含量的影响.结果表明,添加前体物质在一定程度上可促进烟草细胞干重的增加和胞内辅酶Q10含量的提高,其中对羟基苯甲酸、甲硫氨酸对细胞干重的增加作用显著;甲硫氨酸、对羟基苯甲酸与L-苯丙氨酸二者交互作用对胞内辅酶Q10含量的影响达到极显著水平;同时,辅酶Q10的产量随着烟草细胞干重和胞内辅酶Q10含量的变化而变化.在烟草细胞培养的不同阶段可以选择不同的前体物质及其适当的浓度进行分步添加.     

辅酶Q10、番茄红素单独以及联合补充对大鼠运动能力的影响

为观察辅酶Q10、番茄红素单独以及联合补充对大鼠的运动能力以及抗疲劳作用的影响;采用灌胃方法,各组持续给予受试物4周。4周后进行力竭游泳时间、力竭恢复24 h后测试肝脏/股四头肌的超氧化物歧化酶SOD、丙二醛MDA水平;血清乳酸脱氢酶LDH、肌酸激酶CK等各项指标。结果表明,补充辅酶Q10、番茄红素均能延长大鼠力竭游泳时间(P<0.05),联合使用具有极显著性差异(P<0.01);给药组肝脏组织超氧化物歧化酶SOD酶活有明显提高,其中联合组(P<0.01),Q10组(P<0.05);联合组的肝脏组织、肌肉组织以及Q10组的肝脏组织的丙二醛MDA水平有显著性降低(P<0.05)。联合组的血清乳酸脱氢酶LDH、肌酸激酶CK酶活均有明显降低(P<0.01),Q10组LDH(P<0.05),Q10组CK(P<0.01),番茄红素组CK(P<0.05)。辅酶Q10、番茄红素具有提高大鼠运动能力,促进剧烈运动后疲劳恢复,联合使用具有协同作用。     

辅酶Q10的药理与应用

根据相关文献,对辅酶Q10的药理和临床应用进行综述。     

大肠杆菌60Co诱变育种及其发酵生产聚唾液酸条件

对产聚唾液酸菌株大肠杆菌WX J11进行6 0 Co诱变 ,筛选出高产突变株WX J4 ,其聚唾液酸产量可达 10 0 1mg/L ,通过优化发酵条件即在 2 50mL的摇瓶中 ,2 50r/min转速下 ,37℃恒温培养 6 5h ,起始 pH值为 7.8,装液量为 4 0mL ,使聚唾液酸的产量提高到 150 0mg/L .聚唾液酸在菌体生长停止后释放到培养基中 ,动力学上表现为次级代谢产物 .此外 ,还对聚唾液酸的提取、水解和唾液酸的纯化作了初步研究 .     

嗜热古菌高温酸性淀粉酶基因合成和大肠杆菌中的表达

BD5088是来源于1种嗜热球菌Thermococcus sp.的高温酸性α-淀粉酶的人工突变体,研究中根据BD5088基因的氨基酸序列,经密码子优化,用2步PCR法合成去信号肽后的成熟肽基因。该基因全长1311bp,由436个氨基酸组成。现将其克隆到大肠杆菌的表达载体pET30a上,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达出的目的蛋白分子量约为48ku,大小与理论值一致,经过Ni+树脂纯化,得到纯化后的重组酶BD5088。重组α-淀粉酶BD5088具有α-淀粉酶的活性,最适反应温度范围为70～85°C,最适反应pH值为5.6～6.0,在100℃下酶活性半衰期约30min。活性不依赖于Ca2+。本研究为该基因在毕赤酵母中的表达和基因的定向进化改造打下了基础。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7变种Q蛋白对志贺毒素表达的影响

1株肠出血性大肠杆菌O157∶H7变种EC169菌株,携带stx基因但不表达志贺毒素。通过高效热不对称交错聚合酶链式反应（high-efficiency thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction,hiTAIL-PCR）hiTAILPCR扩增得到EC169 stx1及其上游核苷酸片段并克隆测序,结果表明：EC169 q基因与标准株sakai q基因相比存在6个SNP位点。通过PCR扩增O157∶H7高毒株EC150 q基因全长,并构建表达载体pkk223-q分别转化EC169和低毒株EC157。反转录荧光定量PCR实验结果表明,外源q基因在EC169和EC157重组菌中可高效表达,并引起EC157stx转录水平上调,但EC169重组菌stx转录水平不变。反向乳胶凝集实验结果亦证实EC157重组菌志贺毒素表达量提高,而EC169重组菌志贺毒素表达量不变。Q蛋白变异可能并非EC169志贺毒素不表达的主要原因。     

Nisin-rbLF-N融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

针对乳链菌肽(nisin)抑菌谱窄的缺点,选择对抗菌谱较广且具有较强抗性的牛乳铁蛋白氨基末端多肽(rbLF-N)为材料,构建融合基因Nisin-rbLF-N。将融合基因克隆到原核表达载体pGEX-4T1 中,转化E. coli BL21(DE3)进行诱导表达,将诱导表达的产物进行Tricine-SDS-PAGE 蛋白电泳及抑菌活性检测。结果表明,克隆菌经诱导后可表达出可观的融合蛋白,融合蛋白以包涵体形式存在,包涵体经洗涤、尿素溶解、复性后具有抗菌生物活性。     

表面活性肽在大肠杆菌中的异源表达

为构建新型表面活性肽的表达载体,并探讨其在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化,将编码新型活性肽A₆K的重复DNA片段(A₆K)₁₅分别插入到4中不同的原核表达载体中,经酶切和测序验证后,转化到3种不同的表达宿主进行表达,通过改变异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG)浓度、诱导温度和时间来优化表达条件。表达产物通过镍-次氮基三乙酸(nickel-nitrilotriacetic acid, Ni-NTA)螯合层析进行纯化,通过(A₆K)₁₅上的6×His与抗体特异性结合进行Western blot分析,用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)法测定产物浓度,进行经济效益分析。构建了含有目的基因(A₆K)₁₅的重组表达质粒,筛选出最优载体pET-28a-SUMO-(A₆K)₁₅和最优宿主BL21(DE3)。当IP...     

γ-PGA合成酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

研究了γ-PGA合成酶基因pgsBCA在大肠杆菌中的克隆和表达,以pET28a(+)为载体,构建表达载体pET28a(+)-pgsBCA,导入宿主Escherichia coli Rosetta中,诱导使之表达。将发酵液离心去除菌体,得到上清液用旋转蒸发仪浓缩后,采用SDS-PAGE电泳检测重组菌E.coli Rosetta/pET28a-pgsBCA产生的γ-PGA分子量在200-300kDa之间,将产物水解,采用薄层层析法鉴定产物由单一的谷氨酸组成,表明γ-PGA合成酶基因pgsBCA在大肠杆菌中成功表达。     

黄曲霉毒素分解酶基因克隆及其在大肠杆菌中的融合表达

通过GenBank公布的黄曲霉毒素分解酶基因序列,合成ADTZ基因引物。从发霉的玉米样品中提取混合菌液,经菌液PCR扩增,筛选ADTZ基因片段,构建表达载体,将目的基因转化到大肠杆菌中,并进行诱导表达。通过SDS-PAGE检测表达产物大小和浓度。通过酶解试验检测表达产物对AFB1的降解能力。结果成功从发霉玉米混菌悬液中扩增到ADTZ基因,该基因序列全长2 088 bp,与已报道的ADTZ基因相似度达到99%。该基因可在大肠杆菌中进行融合表达,表达产物蛋白大小为118.5 kDa。重组大肠杆菌培养后获得的粗酶液可降解发霉玉米中的AFB1,降解率达到77.69%。     

转谷氨酰胺酶酶原在大肠杆菌中的重组优化表达

茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)转谷氨酰胺酶酶原(pro-transglutaminase,pro-TG)在重组大肠杆菌中的表达量低,限制了其在食品、化妆品、纺织行业中的应用。通过对转谷氨酰胺酶酶原的基因序列进行密码子优化,降低其GC含量,提高了它在大肠杆菌中的表达水平,结果表明经优化后转谷氨酰胺酶原的表达量达到了优化前的4.4倍。为提高转谷氨酰胺酶的比活力,通过基于融合PCR的定点突变技术将转谷氨酰胺酶第二位的丝氨酸突变为脯氨酸,突变后转谷氨酰胺酶的比活力达到了突变前的1.26倍。上述研究结果表明,密码子优化及定点突变技术可以应用于优化转谷氨酰胺酶酶原在大肠杆菌中的表达。