单增李斯特氏菌快速检测方法的建立

建立单增李斯特氏菌的快速检测方法.针对单增李斯特氏菌virR基因序列设计特异性引物及探针,建立等温扩增法,并利用免疫金标试纸条对结果进行检测.用10株单增李斯特氏菌、6株李斯特菌属菌株及其他食源性致病菌24株进行特异性试验;通过定量DNA、纯菌液计数进行灵敏度验证.结果表明建立方法具有较好的特异性;增菌液检测灵敏度为102 cfu/test,DNA检测灵敏度为10°pg/test.建立的单增李斯特氏菌的快速检测方法特异性较好、灵敏度高,适合于单增李斯特氏菌快速筛选检测.     

侧向流免疫检测食品中单增李斯特氏菌的研究进展

单增李斯特氏菌监测对于保护食品供应及公众健康至关重要。侧向流免疫测定操作简单、成本低、快速,已被广泛应用于致病菌的即时检测。该文从样品制备和测定两方面概述应用于食品中单增李斯特氏菌检测的侧向流免疫测定检测方案,重点介绍核酸侧向流免疫测定。等温核酸侧向流免疫测定结合其他富集和信号检测方式,有望成为单增李斯特氏菌即时检测研发的新方向。     

单增李斯特菌与志贺氏菌多重PCR检测技术的建立

目的:为食品、卫生行业提供一种简便、灵敏、快速,并且特异性强的单增李斯特菌(Listeria Monocyto-genes)与志贺氏菌(Shigella)多重PCR检测方法.方法:根据单增李斯特茵转录调节子基因prfA、志贺氏茵侵袭性质粒抗原H基因ipaH筛选出引物;优化多重PCR的引物浓度、退火温度及Mg2+等条件,分析单-PCR及多重PCR的特异性、灵敏度;结合24 h增茵培养.确定多重PCR检测人工污染脱脂灭茵乳的检出限.结果:多重PCR扩增出了预计的PCR产物,即单增李斯特茵(274bp)和志贺氏茵(421bp).该方法的灵敏度:78 pg单增李斯特茵基因组DNA、7.5pg志贺氏茼基因组DNA.多重PCR检测人工污染脱脂灭菌乳,单增李斯特茵与志贺氏茵的灵敏度分别为2cfu/25mL和1.6cfu/25mL.结论:该方法在食品、卫生行业具有很好的应用和开发前景.     

基于荧光探针重组酶介导等温扩增技术快速检测食源性单增李斯特菌方法的建立

目的：建立一种基于荧光探针重组酶介导等温核酸扩增(Recombinant Enzyme Mediated Isothermal Nucleic Acid Amplification,RAA)技术的快速检测食源性单增李斯特菌的方法。方法：针对单增李斯特菌hlyA基因的保守序列设计特异性引物和探针,通过构建含hlyA靶基因片段的重组质粒和不同浓度单增李斯特菌核酸,评价其灵敏度;通过检测大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌等菌液核酸,评价其特异性。结果：所建立的荧光RAA法可在39℃、20 min内完成样本核酸的检测。采用所建立的方法对质粒和核酸进行检测,质粒最低检出限为1 copy/μL,菌液核酸最低检测限为103 CFU·mL^-1,且与其他菌株核酸无交叉反应。结论：成功建立了一种基于荧光RAA法的单增李斯特菌核酸检测方法,该方法具有特异性强和快速的特点,可用于疑似污染单增李斯特菌食品的快速检测。     

单增李斯特菌免疫磁珠的制备研究

目的:制备可高效、特异地分离单增李斯特菌的免疫磁珠。探讨羧基修饰磁珠与多克隆抗体的不同偶联条件和免疫磁珠捕获单增李斯特菌的能力。方法:以单增李斯特菌作为抗原,免疫新西兰兔,获得兔源多克隆抗体,鉴定其与单增李斯特菌体的结合能力;选择6种不同的偶联缓冲溶液,设置了6个主要偶联时间和6组偶联温度,通过比较磁珠与抗体偶联后上清中剩余的抗体量来确定最佳偶联条件。结果:制备的多克隆抗体效价为1.3×105,该抗体与单增李斯特菌体有较好的结合,抗体与1mg羧基修饰磁珠在pH6.0的0.01mol/L一水吗啉乙磺酸缓冲溶液(MES)中,37℃偶联2h,偶联抗体的量为160μg;制得的免疫磁珠的捕获率可达77.0%。结论:获得羧基磁珠与抗体偶联的最佳条件,该免疫磁珠用于食品中单增李斯特菌的检测,与常规的平皿增菌培养显色法比较,检测时间至少缩短20h。     

单增李斯特菌免疫磁珠的制备研究

目的:制备可高效、特异地分离单增李斯特菌的免疫磁珠。探讨羧基修饰磁珠与多克隆抗体的不同偶联条件和免疫磁珠捕获单增李斯特菌的能力。方法:以单增李斯特菌作为抗原,免疫新西兰兔,获得兔源多克隆抗体,鉴定其与单增李斯特菌体的结合能力;选择6种不同的偶联缓冲溶液,设置了6个主要偶联时间和6组偶联温度,通过比较磁珠与抗体偶联后上清中剩余的抗体量来确定最佳偶联条件。结果:制备的多克隆抗体效价为1.3×105,该抗体与单增李斯特菌体有较好的结合,抗体与1mg羧基修饰磁珠在pH6.0的0.01mol/L一水吗啉乙磺酸缓冲溶液(MES)中,37℃偶联2h,偶联抗体的量为160μg;制得的免疫磁珠的捕获率可达77.0%。结论:获得羧基磁珠与抗体偶联的最佳条件,该免疫磁珠用于食品中单增李斯特菌的检测,与常规的平皿增菌培养显色法比较,检测时间至少缩短20h。      

单核细胞增生李斯特氏菌LAMP试剂盒的研制及在食品检测中的应用

利用环介导等温扩增(1oop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术建立食品中单增李斯特氏菌的检测方法。通过对反应条件的优化,组装单增李斯特氏菌LAMP检测试剂盒,并对其特异性、敏感性和适用性进行验证。试验结果显示:该试剂盒适用于食品中单增李斯特氏菌的快速检测,用环介导等温扩增法在65℃条件下,1h内可检出单增李斯特氏菌,其灵敏度达17CFU/mL,特异性为100%,无假阳性和假阴性出现。用该方法与国标方法分别检测120种样品中的单增李斯特氏菌,两种方法的符合率达100%。该试剂盒具有高效、特异性强和敏感性高等特点,可满足大批量样品快速筛选的要求。     

食品中单增李斯特氏菌检测PCR-免疫胶体金试纸条方法的建立

目的建立食品中单核增生李斯特氏菌快速检测PCR-免疫胶体金试纸条法。方法通过设计特异性引物建立单增李斯特氏菌检测PCR方法并使用免疫胶体金技术建立PCR产物快速检测试纸条;用试验菌株检测PCR-免疫胶体金试纸条方法的检测特异度与敏感度。使用新建方法对市售肉制品和乳制品中单核增生李斯特氏菌进行检测,验证该方法在食品检测中的可行性。结果 PCR-免疫胶体金法具有良好的特异度,敏感度比标准琼脂糖凝胶电泳法高100倍。采集乳品样品131份,阳性样品1份,检出率1.53%;肉制品224份,阳性样品4份,检测率1.79%。结论建立的单增李斯特氏菌检测PCR-免疫胶体金试纸条法特异度好,敏感度高,适用于食品中单增李斯特氏菌的检测。     

食品中单增李斯特氏菌检测PCR-免疫胶体金 试纸条方法的建立

目的 建立食品中单核增生李斯特氏菌快速检测PCR-免疫胶体金试纸条法。方法 通过设计特异性引物建立单增李斯特氏菌检测PCR方法并使用免疫胶体金技术建立PCR产物快速检测试纸条; 用试验菌株检测PCR-免疫胶体金试纸条方法的检测特异度与敏感度。使用新建方法对市售肉制品和乳制品中单核增生李斯特氏菌进行检测, 验证该方法在食品检测中的可行性。结果 PCR-免疫胶体金法具有良好的特异度, 敏感度比标准琼脂糖凝胶电泳法高100倍。采集乳品样品131份, 阳性样品1份, 检出率1.53%; 肉制品224份, 阳性样品4份, 检测率1.79%。结论 建立的单增李斯特氏菌检测PCR-免疫胶体金试纸条法特异度好, 敏感度高, 适用于食品中单增李斯特氏菌的检测。     

重大活动食品安全保障中沙门氏菌现场检测方法的建立

目的 针对重大活动食品安全保障工作对于现场检测的时间短和设备简单的要求及供应食品的类型,建立经加热处理和未经加热处理食品的沙门氏菌检测方法。方法 将重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)与侧流免疫层析法(lateral flow immunoassay, LFS)结合,建立RPA-LFS方法对切片水果样品进行检测,再加上叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)处理,建立PMA-RPA-LFS方法,对熟肉制品进行检测。并通过检测人工污染样品及实际样品验证方法的适用性。结果 RPA-LFS的沙门氏菌纯菌检出限为2.0×10¹ CFU/mL,新鲜水果基质检出限为2.0×10¹ CFU/g。对人工污染样品和实际样品的检测结果与GB4789.4—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》方法的结果一致。PMA-RPA-LFS的PMA处理方法为0.1%脱氧胆酸钠37℃处理20 min,加入10μg/mL PMA,室温避光孵育10 min,曝光15 mi...     

添加扩增内标的单增李斯特菌PCR检测方法的建立与应用

以单增李斯特菌inl A基因为靶基因,设计一对特异性引物,以16S rRNA为扩增内标对照,建立了一种含有扩增内标的单增李斯特菌PCR检测方法。优化了PCR反应体系,并对PCR检测方法的特异性、灵敏度、人工污染样品及食品样品检测效果进行了测试。对2株单增李斯特菌、1株英诺克李斯特菌以及19株非李斯特菌菌株进行PCR检测,结果显示,只有2株单增李斯特菌能被检出大小为826 bp的特异性片段,其余20株细菌只能检出1 500 bp的扩增内标片段。灵敏度实验结果显示,基因组DNA和纯培养物的最低检出限分别为1.80×10~2fg/μL和1.21×10~2CFU/m L。当人工污染牛乳样品中单增李斯特菌在最低接种量为0.48 CFU/m L时,经8 h增菌培养后可被该方法检出。采用该研究建立的检测方法对36种食品样品进行检测,证实了该检测方法可以指示检测过程中出现的假阴性现象。综上所述,该研究建立的PCR检测方法能特异性的检测单增李斯特菌,并可有效排除检测过程中出现的假阴性现象,提高检测的准确性。     

叠氮溴化丙锭-羟基萘酚蓝-环介导等温扩增法检测畜禽肉中单核细胞李斯特菌

将叠氮溴化丙锭（propidium monoazide,PMA）、羟基萘酚蓝（hydroxynaphthol blue,HNB）与环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术相结合,建立一种可视化PMA-HNB-LAMP方法快速检测畜禽肉中单核细胞李斯特菌（Listeria monocytogenes）。结果表明,当PMA终质量浓度为5.0 μg/mL、孵育和曝光时间均为15 min时,可有效抑制105 CFU/mL的单核细胞李斯特菌死菌DNA的聚合酶链式反应扩增,而对活菌DNA的扩增不具有抑制作用。LAMP反应体系中HNB终浓度为210 μmol/L时,检测显色结果肉眼可见。该方法的纯菌液灵敏度为2.4×102 CFU/mL,人工污染肉制品的检出限为2.3×104 CFU/ mL。分别采用国标法、PMA-HNB-LAMP法和HNB-LAMP法检测20 份市售畜禽肉样,3 种方法的单核细胞李斯特菌检出率分别为5%、10%和20%。PMA-HNB-LAMP法在一定程度上可解决LAMP法的假阳性问题,并且具有操作简单、可视性强的优点。     

单增李斯特氏菌SureTect实时PCR检测方法的 比较研究

目的 评估食品中单增李斯特氏菌SureTect实时PCR检测方法的性能。     

基于免疫蛋白质组学的单增李斯特菌强免疫原性蛋白挖掘

该研究采用高毒力持留基因型单增李斯特菌819-2菌株全菌蛋白免疫SPF级Balb/C小鼠制备抗血清,利用免疫蛋白质组学对菌株胞外蛋白质组进行分析,旨在挖掘筛选单增李斯特菌强免疫原性蛋白作为特异性抗体制备的候选抗原。超声法提取819-2菌株全菌蛋白免疫SPF级Balb/C小鼠制备抗血清,四次免疫后经间接ELISA测定效价达1:512 000。脱氧胆酸钠（DOC）-10%(m/V)TCA沉淀法提取单增李斯特菌819-2菌株胞外蛋白,利用免疫蛋白质组学和LC-MS/MS技术挖掘并鉴定具有强免疫反应的蛋白点,结果表明双向电泳图谱成功获得85个蛋白点,并成功鉴定了P60、InlC、MltG、Enolase和假定蛋白YxeA family protein等5个强免疫原性蛋白,研究结果为基于强免疫原性蛋白制备特异性抗体用于食品及其加工环境中单增李斯特菌富集及快速检测技术研制提供了数据基础。     

单增李斯特氏菌MALDI-TOF-MS鉴定与分型研究

为建立单增李斯特氏菌的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)快速鉴定与分型方法,实验收集37株单增李斯特氏菌分离株,应用MALDI-TOF-MS采集图谱,获取独特的蛋白质指纹图谱,汇总成标准图谱,建立单增李斯特氏菌鉴定数据库。采用单增李斯特氏菌标准菌株进行验证,表明鉴定结果的可信度很高。在数据库信息的基础上,对37株单增李斯特氏菌分离株进行聚类分型。分型结果表明,在蛋白质水平上,MALDI-TOF-MS可把37株单增李斯特氏菌分成9个型别。     

表面活性剂脱氧胆酸钠在单增李斯特菌死活细胞EMA-PCR鉴别中的应用

通过脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate,SD)结合染料叠氮溴乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)与PCR反应体系相结合,建立纯培养条件下区分单增李斯特菌死活细胞的方法,即SD-EMA-PCR鉴别单增李斯特菌死活细胞检测法。结果表明:向浓度为2.0×108CFU/mL的单增李斯特死菌悬液中加入终浓度为1.5 mg/mL的表面活性剂脱氧胆酸钠后,EMA激活光解最佳曝光时间为25 min。SD-EMA-PCR检测体系中,对死菌细胞DNA的PCR扩增抑制的EMA最小浓度为1.6μg/mL;而对活菌细胞DNA的PCR扩增不抑制的EMA最大浓度为9μg/mL,活菌细胞的最低检出限为20 CFU/mL。SD-EMA-PCR检测法能够减小EMA-PCR漏检死菌细胞给检测结果带来假阳性的可能,降低了检测的成本,为单增李斯特菌的快速检测提供了一种新的有效途径。     

建立DARQ-LAMP方法快速检测单增李斯特菌

该研究针对单增李斯特氏菌的特异性基因hlyA设计引物,优化反应条件,建立实时荧光环介导等温扩增（realtime loop-mediated isothermal amplification,real-time LAMP）的检测方法,在此基础上,建立检测单增李斯特氏菌的基于淬灭基团释放环介导等温扩增检测方法（detection of amplification by release of quenching-LAMP,DARQ-LAMP）,分析其特异性和灵敏度。结果表明,该方法的适宜反应条件为反应温度63℃、Bst DNA 3.0聚合酶0.32 U/μL、淬灭探针双链（quenching probe double chain,QPD）探针浓度10%、Mg2+浓度6 mmol/L;对单增李斯特菌的检测限为7.3×101copies/mL,灵敏度是普通聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）的100倍。该方法效率高、特异性好、灵敏度高,为环介导等温扩增技术检测食源性致病菌的研究提供参考。     

单增李斯特菌反转录环介导等温扩增检测方法的建立

本研究针对单增李斯特菌的快速检测方法进行开发,首先根据单增李斯特菌hly A基因序列保守区设计2对引物,在同一体系中对单增李斯特菌的RNA进行反转录及环介导等温扩增,同时使用羟基萘酚蓝(终浓度200μM)作为反转录环介导等温扩增产物的指示剂,在不开盖进行凝胶电泳检测的情况下,可直接根据体系颜色变化判读结果,能够在20 h内(包括增菌时间)检测出样本中是否存在单增李斯特菌的RNA。本研究建立的RT-LAMP-HNB检测方法对单增李斯特菌RNA的检出限为5.8×10~(-3)μg/m L,起始接种浓度检出限为10 CFU/10 mL,灵敏度是RT-PCR的10倍,且能够检测出是牛奶中否存在的单增李斯特活菌,具有实际应用价值。本研究开发的检测方法具有快速、准确、便捷、灵敏度高等特点,适用于在基层或不便利地区推广使用。     

环介导恒温扩增方法快速检测乳中单增李斯特菌

建立了一种快速检测灭菌乳中单增李斯特菌的环介导恒温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)方法。以hlyA基因作为靶基因,对人工污染乳中单增李斯特菌进行了LAMP方法的灵敏度试验,同时与PCR方法进行比较。并对单增李斯特菌和7种其他乳中常见致病菌进行了LAMP检测,以验证该方法的特异性。结果表明,LAMP检测单增李斯特菌的特异性强,检出限为42 mL-1,其灵敏度比普通PCR高10倍。并且检测时间比PCR更短,在1.5 h内即可完成扩增反应。此方法快速、特异、简单、灵敏,具有较高的推广价值。     

应用LAMP检测方法检测肉制品中的单增李斯特菌

本研究使用恒温环介导技术, 以单增李斯特菌的肌动蛋白大会诱导蛋白聚集因子A(actA)基因设计引物, 建立单增李斯特菌的LAMP快速检测方法.不同来源的13株单增李斯特菌LAMP检测均显示阳性, 其他21种细菌LAMP检测显示阴性.使用使用本研究建立的LAMP方法检测肉类样品中的单增李斯特菌结果与细菌分离方法检测结果一致.