植物病毒样品的超薄切片技术研究

应用超薄切片技术及电镜检测植物病毒在寄主细胞中内含体的形态,是确认病毒的可靠手段之一。然而由于超薄切片的效果与取样及固定处理程序等有直接关系,植物细胞内含物质对观察病毒在细胞中的存在影响很大,目前常规的生物处理程序,对观察病毒在细胞内的形态都不理想,作者近两年在植物病毒样品的前处理上进行了一系列实验研究。样品先经0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)处理12小时,再行常规固定、包埋切片程序,获得了明显效果。选三种病毒材料,萝卜(TuMV)、克里夫兰烟(CMV)、蔓陀岁(PXV)。样品采集后,切成1     

用免疫电镜的方法观察间充质干细胞及再生纤维的超微结构和胶体金标记

本文研究神经再生过程中雪旺氏细胞的功能和作用 ,观察间充质干细胞在体内的存活和功能情况。方法 :以逆转录病毒为载体 ,将EGFP报告基因导入大鼠的骨髓间充质干细胞后 ,注入受损伤的周围神经组织内。三周后取材 ,用FA GA混合固定 ,分为二组 ,A组用K4M低温包埋切片后标记anti EGFP,IgG Au ;B组经冷冻超薄切片后标记anti EGFP ,IgG Au ;观察其超微结构及胶体金标记情况。结果 :电镜下可以观察到A、B二组均呈明显的阳性反应 ,胶体金颗粒均匀地分布在细胞核内及胞浆内。其中K4M低温包埋方法的金颗粒为散在分布 ,超微结构较好 (图 1…     

细胞内病毒抗原定位的低温包埋及胶体金标记

本文报告使用低温包埋剂Lowicryl K4M对感染细胞进行低温包埋和制作超薄切片,用包被SPA或IgG的胶体金作为第二抗体,采用间接法对两种RNA病毒(脊髓灰质炎病毒和轮状病毒)和两种DNA病毒(单纯疱疹Ⅰ型病毒及SV_(40))在感染细胞中作了定位标记实验。将结果同常规环氧树脂Epon 812包埋的感染细胞包埋前穿透标记和包埋后超薄切片标记进行比较。常规包埋法对细胞超微结构保存良好,但由于高温聚合对病毒抗原活性破坏较大,不能获得理想的金标记结果。使用皂角甙(Saponin)改变细胞膜进行包埋前穿透标记,虽能获得特异性标记,但皂角甙对细胞膜结构破坏严重,不利于进行病毒与细胞相互作用关系的研究,且作用条件及时间不易掌握。以上缺点可通过使用低温包埋法得到解决。     

免疫金法与ABC法在电镜包埋前染色之比较

包埋后免疫电镜术虽能精确定位抗原,但难度大。本文用胶体金标记法与ABC法对人鼻中线恶网瘤组织在树脂包埋前作抗人T细胞免疫染色,并对两种方法进行比较。简述如下:临床活检鼻中线恶网组织,经4％多聚甲醛加1％戊二醛4℃固定,振动切片(50μm),PBS冲洗,在预先硅化的载玻片上作免疫染色:鼠抗人T细胞McAb(Dako公司出品)孵育过夜;金标羊抗鼠抗体(10nm,军科院基础所出品)室温下孵育1小时,再将切片倾入小瓶,经1％锇酸后固定,常规脱水包埋及超薄切片,不作铀铅复     

盖玻片在培养细胞免疫电子显微术中的应用

体外培养的细胞不仅可用于研究其形态和机能的变化,而且可进行不同药物学作用时细胞内抗原成分的定位检测及细胞特征的研究。通常盖玻片放入培养皿中作为培养细胞的支持物,细胞在盖玻片上长成单层,可立即固定、染色,进行光学显微镜的观察。在实验中我们发现,加盖玻片的单层细胞培养法也可以直接应用于免疫电镜的包埋前和包埋后染色方法。该技术具有以下优点。(1)使用盖玻片可以避免免疫电镜标本制作过程中,为了搜集细胞而进行的数次刮取、离心。免疫反应及后固定、脱水、浸透、包埋均在盖玻片上进行,使培养细胞的损伤降低至最小程度。(2)如果在直径3．5cm的培养皿中进行免疫过氧化物酶反应大约需要至少200μl抗体,而使用盖玻片法,每张盖玻片则仅需要10μl抗体,大大节约了免疫反应的抗体量,既简便又经济。(3)盖玻片法使包埋后培养细胞呈单层位于包埋块的表面,在每一张超薄切片中都能观察到很多细胞。     

微波辐射对细胞膜通透性的影响

本实验通过电镜镧细胞化学方法，观察了微波辐射对生物样品细胞膜通透性的影响。在常规化学固定的情况下，镧颗粒沿细胞间隙密集分布而不能进入细胞内。生物样品经微波辐射后，在细胞内甚至在线粒体等细胞器内可观察到较多的镧颗粒。提示：微波辐射使生物膜的通透性发生了改变。     

电镜核酸分子原位杂交技术的探索

显微水平的核酸分子原位杂交技术已广泛地应用于基因在染色体上的定位,发育过程中的基因表达等方面,但电镜水平的原位杂交技术却仍在探索之中,主要因为剧烈的核酸分子杂交条件与样品精细结构的保存之间存在着矛盾,为此,我们分别在分级抽提的整装细胞,L-K_4包埋或Epon812包埋的超薄切片样品以及DGD包埋-去包埋样品中对进行电镜分子原位杂交研究的可行性和杂交条件进行了一些探索,目前在整装细胞样品中已取得初步的结果。     

日本脑炎病毒感染鼠脑神经元的超微结构研究

多种节肢动物传播的人类病毒性脑炎病毒能在鼠脑神经元内复制、增殖、并产生严重的细胞病变。本研究应用透射电镜观察日本脑炎病毒(JEV)感染小白鼠后,发病动物大脑海马回神经元的超微结构病变特征以及病毒在细胞内增殖的形态特点。7—8克小白鼠,脑内接种JEV(京卫研_1A_2株)病毒悬液,发病后经麻醉取大脑海马回部位脑组织,按常规固定、脱水、Epon812包埋、半薄切片经精确定位后制作超薄切片,Phiilps EM-400T电镜观察。     

耳蜗透射电镜超薄切片样品的制备技术改进

针对耳蜗组织透射电镜样品制备难度大,不易获得质量较好的超薄切片的问题,作者通过延长锇酸后固定时间和增加树脂渗透的浓度,改善了树脂包埋组织的切割性能.电镜图片显示,明显地提高了超微切片样品制备质量.     

免疫电子显微技术载网处理方法

本文介绍免疫电子显微技术中载网的清洁处理以及与载网相关因素对免疫标记效果的影响。在免疫电子显微技术中 ,能否获得低背底高特异性标记结果 ,其影响因素较多。如在生物样品制备时 ,既要考虑不使组织细胞内抗原受损 ,又要使细胞超微结构保存良好。因此 ,样品制备过程中应合理选择固定液种类及浓度、包埋剂类型及包埋方式。在免疫细胞化学标记实验中 ,高特异性抗体以及抗体的稀释度、温育的温度和时间也是关键。但对载网处理的重要性容易忽视 ,因载网不洁净而导致非特异性高背底标记或切片脱落现象屡屡发生。为此 ,对载网进行彻底的去污处…     

生物样品的冷冻超薄切片术

当生物材料在样品制备过程中需减少化学固定剂对样品中蛋白活性的影响或减少可溶性元素流失时,可采用快速冷冻固定法和冷冻超薄切片。切片在含水状态下或经冷冻干燥后,用电镜观察,这样既能显示生物细胞在体内的形态,又使细胞内各种活性得以保存,是一种值得推广的电镜技术。我们采用新鲜活组织快速冷冻固定和冷冻超薄切片,经冷冻干燥后在透射电镜下对亚细胞结构进行形态观察和微小区域内的元素定性、定量分析,本文总结了初步结果和经验。     

透射电镜神经组织制样包埋剂比较

为探讨两种常用包埋剂Epon 812和Eponate 12对神经组织透射电镜样品的影响,本文采用多聚甲醛-戊二醛溶液对wistar大鼠进行全身灌流固定后,取材海马、脊髓及坐骨神经,按常规透射电镜样品技术制作超薄切片.电镜观察显示,经Eponate 12包埋后的样品,在切片的透明度及超微结构的清晰度上均优于Epon 812包埋的超薄切片样品.由于Eponate 12的浸透效果好,有效地避免了有髓神经纤维髓鞘上出现孔洞结构的制样问题.本实验小组的实验结果表明:对于神经组织,尤其是周围神经组织的超薄切片样品,使用Eponate 12作为包埋剂,效果会更好一些.     

感染神经元内流行性出血热病毒抗原的免疫金标记

在所有的RNA病毒中,布尼安病毒科(Family Bunyaviridae)的病毒是唯一的具有在感染细胞高尔基复合体及其邻近光面囊泡内芽生成熟的形态发生学特征。我们曾应用常规超薄切片电镜技术,在我国两种出血热(流行性出血热,EHF和新疆出血热,XHF)病毒感染的新生乳鼠大脑海马回神经元内观察到病毒在增生、扩张的高尔基扁囊和囊泡内芽生成熟的图象。本研究应用低温包埋免疫金标记技术进行感染细胞内EHF病毒抗原分子的亚细胞定位,以求阐明高尔基复合体异常增生与病毒抗原分布的关系。     

DGD包埋—去包埋样品的免疫标记

小鼠膀胱上皮细胞经细胞选择性抽提和ＤＧＤ包埋后，制备超薄切片，并对其进行免疫标记。结果表明，ＤＧＤ包埋－去包埋样品中的ＡＵＭ蛋白仍可特异地被抗体所识别，这一结果为证明小鼠膀胱上皮细胞中由ＡＵＭ蛋白组成的梭形泡以及腔面不对称单位膜结构均与中间纤维相连提高了证据。本文还对ＤＧＤ包埋后样品免疫标记技术进行了讨论。     

对某些难浸透材料的一种简单可行的包埋方法

在制备电镜生物样品过程中,包埋剂的性能是一个十分重要的因素。选用不同的包埋剂浸透样品时,形成的包埋块的切割性能直接关系到超薄切片的成败。有些生物样品如藻类和植物的细胞具有较硬的细胞壁,有的组织则富含脂肪,还有某些样品需要用细胞化学的方法处理(如银染)。上述这类样品一般都不易浸透,影响着切片的质量。因此,选择适当的包埋剂是制做电镜样品中的一个必要条件。目前,国内常用的包埋剂主要是环氧树脂如国产618树脂,Epon812树脂,Spurr树脂和Ardldite 502树脂等。而我们实验室常用的是Epon812树脂混合剂和Spurr树脂混合剂这两种。Epon812树脂混合剂能较好地保存细胞的精细结构,有适当的反差,在电子束的轰击下相对稳定,并     

脾气虚证骨骼肌线粒体超微结构图像分析研究

脾气虚证大白鼠骨骼肌的超微结构变化已作了观察研究,发现线粒体数显著减少,其结构改变表现为肿胀、嵴断裂、空泡化等。本文对线粒体的超微结构作进一步图像分析。实验动物Wistar大白鼠,取正常组、脾气虚证组、四君子汤复健组和自然恢复组的骨骼肌用4％戊二醛固定液作前固定,1％四氧化锇固定液后固定,Epon 812包埋。LKB V型超薄切片机切半薄和超薄切片,半薄切片作光学显微镜观察和修块定位,超薄切片用醋酸铀、柠檬酸铅双重染色,日立H-500透射电镜观察照相,Joyce-Loebl μMAGISCAN图像分析仪对四个组线粒体的面积、周长、长度、宽度(见图1)以及长度与宽度之比进行测定、统计分析,对四个组的上述参数分别作t测验。     

十二指肠上皮细胞的亚显微结构

本文以健康家兔十二指肠为实验材料,在超薄切片透射电镜观察的基础上,采用冷冻蚀刻技术对十二指肠上皮细胞的亚显微结构及其膜表面特化结构,进行观察分析。实验方法取新鲜材料,经4％戊二醛和1％锇酸双固定后,为了提高样品的反差和较好地显示细胞的膜结构,将样品放入1％单宁酸浸泡60分钟,尔后再用丙酮逐级脱水,EPON812包埋,超薄切片后送H—500电镜观察。冷冻蚀刻样品,系用HFZ—1型冷冻蚀刻装置,按常规操作步骤制备复型膜。     

DGD包埋－去包埋样品的免疫标记

小鼠膀胱上皮细胞经细胞选择性抽提和ＤＧＤ包埋后，制备超薄切片，并对其进行免疫标记。结果表明，ＤＧＤ包埋－去包理样品中的ＡＵＭ蛋白仍可特异地被抗体所识别，这一结果为证明小鼠膀胱上皮细胞中由ＡＵＭ蛋白组成的梭形泡以及腔面不对称单位膜结构均与中间纤维相连提供了证据。本文还对ＤＧＤ白埋后样品免疫标记技术进行了讨论。     

胃印戒细胞癌浸润转移与免疫超微结构特征的关系

胃印戒细胞癌是一种较其它类型胃癌恶性程度更高的肿瘤 ,其 5年生存率较低主要与肿瘤的生物学特征有直接关系。本文通过免疫组化及电镜技术对 5 3例胃印戒细胞癌进行功能与超微结构相结合的观察 ,对印戒细胞癌浸润性的特征进行探讨。材料与方法　收集 1 995年至 1 999年 2月病理标本中的 5 3例胃印戒细胞癌组织 ,标本均经 1 0 %中性福尔马林固定 ,石蜡切片 ,HE染色、免疫组化癌胚抗原 ( CEA)及层粘连蛋白 ( LN) S- P法检测。同时取其中 6例留取电镜样品 ,戊二醛、锇酸双重固定 ,低粘度包埋剂浸透包埋 ,半薄切片定位 ,超薄切片铀 -铅双重…     

一种用于贴壁培养细胞感染病毒检测的简易光镜-电镜联用技术

目的:建立一种简单易行的适用于病毒检测的光镜-电镜联用技术。方法:使用Lab-Tek腔室玻片培养细胞并接种不同类型病毒，通过光学显微镜选取目标病变细胞或通过荧光蛋白、免疫细胞化学标记、免疫荧光标记、量子点标记确定目标细胞并在腔室玻片上标记其部位。随后将腔室玻片改造为包埋模具，最后钻取目标细胞及其包埋树脂，并对目标细胞进行靶向性超薄切片及透射电子显微镜观察。结果:光镜下选取的目标细胞在透射电子显微镜下可顺利定位并进行观察。结论:建立了一种基于腔室玻片包埋模具的可用于病毒检测的光镜-电镜联用技术。