空肠弯曲菌与食品

近几年来空肠弯曲菌(Campylahacterjej－uni)已被世界各国公认为是引起人类急性腹泻,特别是婴儿腹泻的重要病原菌。空肠弯曲菌可以多种方式从动物宿主传播给人,也可通过直接接触污染的动物宰体传播。但是,更多的是通过摄入污染的食物或水而间接传播的,...     

多重PCR鉴定动物源空肠弯曲菌和结肠弯曲菌方法的建立

建立鉴定空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的多重PCR(mPCR)方法。方法 分别以16S rRNA、马尿酸酶和16S-23S rRNA基因为靶序列设计特异性引物,建立多重PCR方法检测37株菌株样品,同时采用ⁱⁿgene CAM nested PCR检测试剂盒检测验证,进行结果比较分析。结果 该多重PCR方法可扩增出空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的特异性条带,其他对照菌株均未扩增出条带,具有较好的特异性;检测敏感性可达0.81pg/μl空肠弯曲菌DNA,0.93pg/μl结肠弯曲菌DNA。多重PCR方法和试剂盒检测结果的符合率为100%,二者与国标GB/T 4789.9—2008方法的符合率达97%以上。结论 本试验建立的多重PCR方法操作快速方便、节约试验成本,具有较好的特异性、敏感性和重复性,可用于弯曲菌的鉴定。     

双重PCR 方法检测沙门氏菌和空肠弯曲菌

为建立能够同时检测食品中沙门氏菌和空肠弯曲菌的双重PCR 方法。采用沙门氏菌鞭毛基因fimY 和空肠弯曲菌马尿酸酶基因hipO 设计特异性引物,并对影响PCR 扩增的主要因素——引物浓度、退火温度、Mg2+ 浓度因素进行优化,比较单一PCR 和双重PCR 的检测效果。结果表明：采用单一PCR 法检测沙门氏菌和空肠弯曲菌时,灵敏度分别可达到3.98pg 和4.05pg;而采用双重PCR 检测时,灵敏度较单一PCR 法有所下降,沙门氏菌和空肠弯曲菌检出限量分别为398pg 和40.5pg。本研究建立的特异性强和灵敏度高的双重PCR 检测方法,可为实现食品中沙门氏菌和空肠弯曲菌的同时检测提供新方法。     

空肠弯曲菌定量检测方法的建立和优化

目的 建立一种空肠弯曲菌定量检测方法,为食品安全风险评估提供准确的数据支持。方法 参照ISO/TS 10272—3和GB/T 4789.9—2008,基于MPN原理建立空肠弯曲菌定量检测方法,对定量加标的生鸡肉和鸡粪样品进行不同增菌培养基、不同培养环境和不同培养方式优化比对研究,用加标回收试验对建立的方法进行验证。结果 增菌培养基的优化选择:Preston肉汤对加标菌量10cfu/g的生鸡肉和鸡粪样品进行空肠弯曲菌检测的平均值分别为12.26和10.96MPN/g,Bolton肉汤检测的平均值分别为2.38和2.32MPN/g,二者比较差异有统计学意义(P＜0.05);微需氧环境的优化选择:用三气培养箱法、产气袋法、抽气换气法和烛缸法对加标生鸡肉和鸡粪中的空肠弯曲菌检测的平均值分别为12.26和12.12MPN/g、12.26和10.96MPN/g、12.26和12.86MPN/g、10.82和12.12MPN/g,和三气培养箱法两两相比差异无统计学意义(P＞0.05);培养方式:静止培养法对加标生鸡肉和鸡粪空肠弯曲菌的检测值分别为15.8和15.2MPN/g,振荡培养法检测值分别为11.36和8.72MPN/g,二者比较差异有统计学意义(P＜0.05);用该法对低、中、高浓度加标生鸡肉样品的回收率分别为115.25%、111.5%和95.0%。结论 此方法可以对高污染样品中空肠弯曲菌进行准确定量,特异度高,值得推广应用。     

空肠弯曲菌致病分子机制研究进展

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是人类的食源性病原菌,感染后主要引起急性肠炎,与人类格林-巴利综合症也有密切关系.研究表明,空肠弯曲菌致病性是多种毒力因子共同作用的结果.作者从分子生物学研究水平综述空肠弯曲菌黏附、定植、侵入、产细胞毒素、分子模拟等致病机制.     

PCR技术检测空肠弯曲菌的研究进展

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是一种人畜共患病病原菌,可以使人和动物引发多种疾病。目前,检测C.jejuni采用的国标方法是传统的培养法,但C.jejuni培养条件苛刻,且培养法存在操作繁琐、特异性不强、费时等缺点。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)以其快速、准确、灵敏度高、特异性强的特点,现已广泛应用于C.jejuni的检测,并成为目前快速检测临床与食品中C.jejuni最常用的的方法。本文综述了近年来利用RCR技术,包括常规PCR、多重PCR、巢式PCR、实时荧光定量PCR、PCR-酶联免疫吸附法、最大几率数-PCR、PCR-限制性片段长度多态性、PCR-变性高效液相色谱、PCR-变性梯度凝胶电泳和磁捕获-荧光PCR方法检测C.jejuni的研究进展,并针对这些PCR技术的原理、检测效果、优点和缺点等方面进行了分析比较,为有效控制和预防该菌引起的疾病提供重要信息。     

空肠弯曲菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

以C.jejuni ORF-C基因为靶基因设计合成引物及Taq Man探针,建立了实时荧光定量PCR快速检测C.jejuni的方法。结果显示,对15株试验菌株进行荧光定量PCR检测,只有C.jejuni菌株检测为阳性,表明该检测方法特异性强;该方法的灵敏度为11 CFU/m L,利用该检测方法对采集的60份样品进行检测,共计检出1份C.jejuni阳性样品,与国标法GB 4789.9—2014检测结果一致,显示了良好的实用性。该检测方法灵敏度高、特异性强,具有良好的实用性。     

空肠弯曲菌flhA突变株的构建及其功能研究

flhA是空肠弯曲菌鞭毛输出装置的关键基因,通过构建Campylobacter jejuni flhA突变株HXW001,进行毒力相关表型研究和分析。结果显示HXW001生长性能稳定,但其鞭毛和运动能力丧失,生物膜形成和自身凝集现象明显下降。RT-PCR实验证明flhA对鞭毛丝主要结构蛋白基因flaA的表达有一定的调控功能。研究表明flhA是空肠弯曲菌鞭毛生成和运动能力重要的分子基础,与空肠弯曲菌致病性密切有关。     

鸡肉中潜伏的致病菌——空肠弯曲菌

<正>英国食品标准局的调查显示,73%的零售鲜鸡肉携带空肠弯曲菌,大概有三分之一的人群一生中有可能被弯曲菌感染。空肠弯曲菌是什么?空肠弯曲菌是一种细菌,身长仅为1.5~3.5μm,比头发丝小多了,我们肉眼是看不见的,它的身材呈弯曲杆状、两端稍细。它可在低氧环境下生长。目前已发现的弯曲菌属有21个种和多个亚种,但人类感染多数是由空肠弯曲菌和结肠弯曲菌引起的,其中由空肠弯曲菌引起的约占90%。全世界每年由空肠弯曲菌引起的食源性腹泻病例达4~5亿人次。     

一种新的空肠弯曲菌外膜囊泡提取方法的建立

空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）外膜囊泡（outer membrane vesicles,OMVs）是其在生长过程中分泌到细胞外的球状小泡,主要含有外膜蛋白及一些周质空间的物质,对细菌的生存、定植、细菌与宿主细胞间的交流及致病机制发挥重要的作用。因此,开发一种高效提取方法是研究空肠弯曲菌OMVs生物学功能的关键。该研究发现在微需氧条件下,使用MH培养基培养空肠弯曲菌15 h后提取OMVs最为合适。在最优条件下,采用超滤浓缩法从菌液中提取OMVs,并使用0.22 μm的微孔滤头进一步过滤提取物除去鞭毛等杂质。为了表征所提取的OMVs质量,首先使用透射电镜技术,发现所提取的OMVs具有典型形态,大小在50~300 nm之间,所含杂质较少。SDS-PAGE电泳结果表明OMVs内部含有大量蛋白,含量可达40.50 mg/mL。最后利用外膜蛋白抗体成功证明所提取的物质的主要成分为OMVs。该研究成功建立了一种从液体培养基中提取空肠弯曲菌OMVs的提取体系,多种分析方法证明其提取效率高、质量较好,适用于后续空肠弯曲菌OMVs生物功能相关研究。     

含内标的多重实时PCR法同时检测空肠弯曲菌和结肠弯曲菌

目的建立含内标的多重实时荧光PCR法同时检测空肠弯曲菌和结肠弯曲菌。方法针对空肠弯曲菌特有hipO基因和结肠弯曲菌特有ceuE基因设计引物探针,设计并优化内标DNA添加量。测试了方法的特异性、灵敏度以及在鸡肉中的检出限。结果内标的最适添加量为10~4copies/PCR。所建立方法对空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的灵敏度分别达到4.7copies/PCR和5.23copies/PCR;对115株空肠弯曲菌、49株结肠弯曲菌和42株非目标菌株在3种不同类型的实时荧光PCR仪上的特异性均达到100%;对鸡肉中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的检出限达到10CFU/25g,与传统检测方法一致。采用所建立的方法对50份市售生鲜鸡肉进行检测发现,空肠弯曲菌阳性率为12%(6/50),结肠弯曲菌阳性率为4%(2/50);传统国标检测方法除了1份空肠弯曲菌阳性样品未得到分离确认,其余PCR阳性样品均在平板上分离确认。结论该方法特异性强、灵敏度高、开放性好、含有内标可防止"假阴性",可应用于食品中2种重要致病性弯曲菌的快速同步检测。     

Fla-DGGE法对食品中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的检测和分型

本文应用鞭毛蛋白基因flaA和flaB的变性梯度凝胶电脉(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)方法对食品中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌进行检测和分型。采用RBB(rpeated bead beating)、CTAB和丙酮-氯仿抽提三种方法提取样品基因组后进行fla-DGGE检测,结果完全一致。10份生鲜鸡、鸭肉样品中有8份含有空肠弯曲菌或结肠弯曲菌,其中3份含有两种或两种以上的空肠弯曲菌或结肠弯曲菌或它们的不同型别。克隆测序后结果表明,有7份样品被同一种空肠弯曲菌所污染,其中3份样品还被同一种结肠弯曲菌所污染,1份样品被污染情况严重,检测到含有一种结肠弯曲菌和三种空肠弯曲菌。Fla-DGGE方法快速、准确、灵敏度高,可用于食品中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的快速检测和分型。     

空肠弯曲菌的鉴定及其主要特征的不同检测方法的比较

本文叙述了用一些生化试验鉴定了70株空肠弯曲菌和对该菌的几个主要特性用不同检测方法作了比较,所得结果如下:1.鉴定空肠弯曲菌所必需的最少项目应包括形态、触酶、动力、TTC 还原、1%甘氨酸中生长和马尿酸钠水解。前三个项目即表现为弯曲的形体、触酶阳性和具有动力为弯曲菌属中嗜热弯曲菌群的共性;TTC 还原则可用以排除胎儿弯曲菌胎儿亚种、猪肠弯曲菌和粪弯曲菌;1%甘氨酸中生长可用以排除幽门弯曲菌;马尿酸钠水解可用以排除结肠弯曲菌和海鸥弯曲菌。2.细菌的马尿酸钠水解试验用快速微量法,DNA 分解试验用含甲苯胺兰的 DNA 琼脂平板表面点种法、动力、TTC 还原试验用含0.4%TTC 的半固体琼脂单管法均较试验中所用的其他方法为优,可取得简便、快速和敏感的效果。     

食品中空肠弯曲菌荧光重组酶聚合酶扩增检测方法的建立

本研究为了实现空肠弯曲菌的快速和便捷检测,建立了一种基于荧光重组酶聚合酶扩增技术(exo-RPA)快速检测空肠弯曲菌的方法。通过对空肠弯曲菌和对照菌株的exo-RPA检测来判断该方法的特异性。用梯度稀释的空肠弯曲菌作为模板进行检测来分析exo-RPA方法的灵敏度。通过对模拟污染样品检测来分析exo-RPA的应用效果。分别以exo-RPA和荧光PCR检测实际食品样品来分析二者的检测效果。空肠弯曲菌exo-RPA方法可特异检出空肠弯曲菌,检测灵敏度达到6.0×102CFU/m L。在模拟污染试验中,含2.5×101 CFU/m L空肠弯曲菌的增菌液在培养24 h后可以被exo-RPA检测出阳性信号。exo-RPA和荧光PCR对于40份样品的检测结果相同。本研究建立的空肠弯曲菌exo-RPA具有特异、灵敏和抗干扰性强的特点,方法操作简便快速,具有较好的应用前景。     

辽宁省鸡源空肠弯曲菌耐药性监测与分析

目的了解辽宁省内鸡源空肠弯曲杆菌耐药性情况。方法采用特异性选择培养基分离出空肠弯曲菌,并使用生化反应和分子生物学方法双重方法进行鉴定,并进行耐药性分析。结果采集的辽宁省某屠宰场的鸡盲肠共198份样品,分离鉴定得到60株空肠弯曲菌,分离率为30.3%。同时对60株空肠弯曲菌进行了药物敏感性检测。结论 60株空肠弯曲菌几乎均对红霉素、庆大霉素、克林霉素和萘啶酸耐药,其MIC90值均高于所测试的最高药物浓度。空肠弯曲杆菌氟苯尼考和泰利霉素的敏感性最强。     

空肠弯曲菌快速检测试剂盒研制及AOAC验证

本文自主研制出含内标的空肠弯曲菌实时荧光PCR快速检测试剂盒,并根据美国分析化学家协会(AOAC)微生物方法对试剂盒进行验证。结果表明,该试剂盒对115株目标菌和118株非目标菌的检测特异性为100%,灵敏度达6.4 CFU/mL。将试剂盒反复冻融30次,目的基因的Ct值无显著变化。稳健性测试结果显示,除了一株空肠弯曲菌对增菌液体积较为敏感外,增菌液体积、菌体裂解时间和DNA添加量均不影响其余10株空肠弯曲菌和5株同属的其它弯曲菌的检测结果。采用生产3 d、生产4个月和1年的3个批次试剂盒进行批间重复性测试和保质期测试,结果显示3批试剂盒对16株弯曲菌的检测结果一致,且11株空肠弯曲菌的Ct值无明显差异。对人工添加鸡肉、蔬菜和牛奶样品以及鸡肉实际样品检测结果显示,试剂盒方法与传统检测方法基本一致,未出现"假阴性"。试剂盒开放性好,可在不同品牌仪器上使用,含有的内部扩增对照可防止"假阴性",可应用于食品中空肠弯曲菌的快速检测。     

空肠弯曲菌分离株ERIC-PCR分型和生化分型的比较研究

建立空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)的ERIC-PCR分子生物学分型技术,比较ERIC-PCR分型和生化分型的分型效果。从菌株TY1273出发,运用L16(54)正交试验,对Mg2+、dNTPs、引物和TaqDNA聚合酶浓度等因素在较大范围水平内进行反应体系条件摸索,得到一个初步的优化体系;在此基础之上进行单因素的进一步小范围水平内的微调优化,得到最终的优化体系;最后以优化的ERIC-PCR方法对24株C.jejuni分离株分型;同时根据API Campy生化反应结果进行生化分型,比较ERIC-PCR分子分型方法和生化分型方法。结果显示ERIC-PCR方法将24株菌扩增均得到大小在100 bp-3000 bp之间的条带,并可将其分为22个基因型,分辨系数为0.92,具有较高的分辨力。生化分型将24株菌分为19个生化型,显示了菌株基因的多样性。表明ERIC-PCR技术比生化分型能更好的体现菌株的遗传多样性,且具有简便和分辨力搞等优点,可用于C.jejuni的多样性研究。     

葡萄霜霉病菌长期保存方法的研究

为了解决葡萄霜霉病菌的活体保存问题,本文开展了多种保存方法的研究。采用5%二甲基亚砜低温冷冻保存、液氮冷冻保存和琼脂粉包裹冷冻保存等三种方式,调查不同低温条件和不同保存时间对孢子囊致病性的影响。结果表明:用不同保护剂处理后葡萄霜霉病菌单斑病叶保存于-80℃中30 d,5%二甲基亚砜处理的孢子囊经回接后发病面积百分率为69.32%,其致病性明显高于液氮冷冻处理和琼脂粉包裹处理;低温保存条件下,-80℃中保存的孢子囊回接后致病性明显高于-20℃的处理;三种保存方式均表现随着保存时间的延长,致病性逐渐降低。     

空肠和结肠弯曲菌鞭毛蛋白基因fla A的检测

目的 运用一种快速、敏感、特异的检测空肠和结肠弯曲菌的方法.方法 以空肠和结肠弯曲菌所共有特异的鞭毛蛋白基因 fla A的一段高度保守序列为引物,用PCR法扩增fla A基因上的一段约1 700 bp的片断.用该引物对空肠和结肠弯曲菌的标准株、福建省的食品分离株进行PER扩增检测,并同时检测该PCR方法的敏感性.结果 扩增片断表现出极好的特异性,2株空肠和结肠弯曲菌标准菌株、8株分离自不同食品样品的空肠穹曲菌和结肠弯曲菌菌株均为阳性,且敏感性实验显示该PCR方法的反应体系最低检出菌量为6 CFU.结论 该方法快速、敏感、特异,可用于突发性食物中毒和暴发感染的调查.