莱茵衣藻纤毛内运送蛋白IFT57抗原的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

IFT57是纤毛内运送蛋白IFT B复合物的一个重要组分,在鞭毛组装中发挥着重要作用。利用莱茵衣藻ift57基因中一段编码亲水性氨基酸序列的片段构建了带有6×His标签的原核表达载体pET-28a(+)-ift57,并转入大肠杆菌BL21(DE3),通过IPTG诱导表达蛋白质,以12 g/dL SDS-PAGE鉴定,获得相对分子质量大小为17 200的ITF57重组蛋白质片段。对6×His-IFT57融合蛋白质进行纯化,并用其免疫新西兰大白兔,采集第5次免疫后血液并分离血清。利用Western blotting对所获抗体进行特异性鉴定。ELISA测定结果表明,抗血清效价为512 000。在抗血清经Protein A纯化后,Western blotting检测显示所制备的IFT57多克隆抗体能够特异性识别莱茵衣藻中的IFT57蛋白质。这一结果表明,为表达纯化溶解性较差的蛋白质抗体制备提供了借鉴意义,所获抗体为深入研究IFT57在鞭毛组装中的作用机理奠定了基础。     

莱茵衣藻IFT25的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

IFT25是维持纤毛运动和感知所必须元件纤毛内运输蛋白IFT复合物B中的重要组分之一,探索IFT25尤其在模式生物莱茵衣藻中的作用机制具有重要作用。作者采用经济和简单的方法,制备莱茵衣藻IFT25的兔源多克隆抗体。将ift25分别连接到pMAL-c2X-和pET-28a(+)-载体上,转入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导大量表达,并经亲和纯化后蛋白质纯度超过90%。通过颈背部皮下多次免疫8周龄大的新西兰大白兔,制备多克隆抗体,取第五次免疫后血清用ELISA测定效价超过128 000。抗血清依次经过Protein A和硝酸纤维素膜纯化后,用Western blotting检测抗体特异性,结果表明制备的抗体可以特异性识别莱茵衣藻中的IFT25,为IFT25作用机制的阐明和纤毛相关疾病的诊断提供了重要理论和方法支持。     

莱茵衣藻BBSome蛋白BBS2原核表达、纯化和多克隆抗体的制备及鉴定

BBSome蛋白复合物是纤毛蛋白组分之一,BBSome组装或纤毛运输缺陷可导致巴-比二氏综合征。其中,BBSome组分BBS2缺失已被临床证明是导致BBS的病因之一。莱茵衣藻是研究BBSome组装和纤毛运输的一种很好的模式生物。为深入研究BBS2的致病机制,需要特异性识别其BBS2蛋白的抗体。本文将莱茵衣藻BBS2 基因5''端399 bp的cDNA序列克隆到原核表达载体pET28a-bbs2,转入大肠杆菌 BL21（DE3）细胞进行诱导表达。在8 mol/L尿素存在的情况下对该融合蛋白进行镍柱亲和纯化,并将纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔。SDS-PAGE电泳结果表明：分子量为15 kDa的重组6×His-BBS2融合蛋白为水不溶性蛋白。5次免疫后的抗莱茵衣藻BBS2抗血清效价高达1∶256 000。经Protein A琼脂糖CL-4B亲和纯化后的抗血清不仅在Western blotting 分析中能特异性识别莱茵衣藻BBS2,而且在免疫荧光染色分析中能精确定位BBS2于基体和纤毛内。这一多克隆抗体的成功制备为深入开展 BBS2在BBSome组装和纤毛运输中的分子作用机制提供了基础。     

苹果转录因子MdHB1的原核表达与多克隆抗体制备

HD-Zip转录因子在植物生长发育过程中具有重要作用,蛋白水平的研究有助于进一步阐释其功能。将苹果转录因子基因MdHB1分别连接到pGEX-6p-1和pET-28a（＋）表达载体,热激转化大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）,随后用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG）诱导培养,分别得到了带有GST和6×His标签的MdHB1融合蛋白（分别命名为MdHB1-GST和MdHB1-His6）。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明,在?18、28?℃和37?℃?3?个温度诱导条件下都是沉淀中MdHB1-GST融合蛋白的量较多,37?℃尤为明显,较低的诱导温度（18?℃和28?℃）能够提高融合蛋白MdHB1-GST可溶性形式存在的比例;28?℃条件下50?mg/L IPTG诱导的总蛋白量在8?h左右达到最大,且受IPTG质量浓度（10、50、100?mg/L）的影响不大。以Ni-NTA柱纯化的融合蛋白MdHB1-His6为抗原,成年兔免疫以制备多克隆抗体。间接酶联免疫法检测结果表明,所得抗体效价较高。蛋白质免疫印迹实验结果说明,所制备多克隆抗体特异性良好,能够从菌体和苹果幼叶总蛋白中成功检测MdHB1蛋白。综上所述,本实验所得多克隆抗体能够用于深入研究MdHB1在植物体内的功能。     

原核表达抗克伦特罗重组单链抗体及其纯化研究

目的:原核表达抗克伦特罗重组单链抗体,对表达的包涵体蛋白进行提取和纯化,并鏊定重组抗体特性.方法:通过温度诱导大肠杆菌表达抗克伦特罗单链抗体,超声破碎菌体细胞,采用不同洗涤溶液提取包涵体.以不同变性剂溶解包涵体,Ni-NTA亲和柱纯化后,经脉冲稀释法将其复性.超滤及透析浓缩蛋白复性液,经Ni-NTA亲和柱二次纯化,得到纯化重组目的蛋白.通过SDS-PAGE电泳分析重组目的蛋白纯度,采用Western bloning和间接竞争EUSA对所制备的抗克伦特罗重组单链抗体特异性进行鉴定.结果:以大肠杆菌Es-cherichia coli BL21(DE3)为宿主菌诱导表达重组单链抗体,产率最高,占菌体蛋白的31%.以1 mol/L尿素洗涤包涵体,6 mol/L盐酸胍为变性剂,经Ni-NTA亲和柱纯化,所得复性重组单链抗体蛋白的纯度达96%.Western blotting分析显示,纯化并复性后的单链抗体可与鼠抗His标签蛋白单克隆抗体发生特异性的结合反应.间接竞争ELSIA结果表明,该重组抗体IC50值为3.35 ng/mL,与沙丁胺醇等结构类似物无交叉反应.结论:原核表达制备的抗克伦特罗重组单链抗体具有较好的抗原结合活性及特异性,为进一步开展克伦特罗的免疫快速检测研究奠定基础.     

双孢蘑菇中AbbHLH的表达、纯化及多克隆抗体制备

碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix,bHLH）转录因子在真核生物中广泛存在,是数量较多的转录因子家族之一。该文首次克隆并鉴定双孢蘑菇中的一个AbbHLH（Agaricus bisporus basic helix-loop-helix）转录因子,建立原核表达载体pET-28a（+）-AbbHLH并将其转至E.coli BL21（DE3）感受态细胞中诱导表达,得到主要以包涵体形式存在的6×His-AbbHLH重组蛋白,经纯化与复性后得到纯度超过80%的抗原蛋白。用制备的抗原蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,间接酶联免疫吸附测定法测定结果表明抗体血清的效价可达102 400。将抗体血清依次经Protein A及CNBr亲和纯化后,用Western Blotting检测抗体特异性,结果表明该抗体能够特异性识别双孢蘑菇中的AbbHLH蛋白。     

太平洋牡蛎中类FUT10蛋白的原核表达及免疫印迹鉴定

目的 原核表达牡蛎类FUT10(Fucosyl-transferase 10)蛋白并探究与人FUT10的免疫相似性。方法 本研究基于课题组前期克隆完整的类FUT10基因cDNA, 依照大肠杆菌表达蛋白的密码子偏爱性, 利用DNAMAN软件对类FUT10基因开放阅读框序列进行优化并合成, 亚克隆至载体pET-28a(+), 得到重构质粒pET-OFu3, 转入大肠杆菌BL21(DE3), 通过异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后获取目的蛋白, 进行蛋白质印迹法(Western blot)鉴定。结果 在37 ℃、IPTG终浓度为1.0 mmol/L诱导4 h后, 出现蛋白分子量大小约为55 kDa的条带。该蛋白条带与抗6×His(组氨酸)标签抗体、抗人FUT10抗体均能发生特异性结合。结论 优化后的类FUT10蛋白与人体转移酶FUT10具有相似的免疫原性, 类FUT10蛋白的可溶性表达为探究太平洋牡蛎体内Ⅱ型血型抗原合成路径提供研究基础, 进一步探索了牡蛎体内特异性结合诺如病毒的分子机理。     

阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶的原核表达及其多克隆抗体制备

以阪崎肠杆菌(ATCC29544)的基因组DNA为模板通过PCR扩增出α-葡萄糖苷酶基因malA,将其克隆入表达载体PET22b(+),构建重组表达质粒pET22b-malA将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3),进行优化表达.采用尿素洗涤包涵体并切胶回收纯化融合蛋白,然后再免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.通过ELISA测定效价,并通过免疫荧光法鉴定与菌体表面结合能力结果表明克隆的目的基因全长1677bp,与Genebank的malA比较具有100％的同源性.带His标签的融合蛋白以包涵体形式表达,其最优化的表达条件是37℃下用0.8mmmol/L IPTG诱导5h.ELISA测定效价为5×105;免疫荧光法鉴定表明多克隆抗体能与阪崎肠杆菌表面结合.本实验为阪崎肠杆菌的免疫磁珠检测奠定了基础.     

牛乳主要过敏原αS1-酪蛋白的纯化鉴定及其多克隆抗体的制备

目的:从牛乳酪蛋白中纯化获得α_S1-酪蛋白并对其进行综合鉴定,以及制备特异性识别α_S1-酪蛋白的兔多克隆抗体。方法:采用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析色谱对α_S1-酪蛋白进行分离纯化,利用酪蛋白的理化性质（等电点和含量）、免疫学技术和质谱技术对纯化的α_S1-酪蛋白进行综合鉴定,然后通过透析和冷冻干燥获得高纯度的α_S1-酪蛋白,最后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并分析其特异性。结果:在4种酪蛋白中,α_S1-酪蛋白在阴离子交换层析色谱中的出峰时间最晚、峰面积最大,在电泳图中的位置最高,最终获得纯度高达94.26%的α_S1-酪蛋白,得率为27.19%。免疫5次后,两只兔子的抗血清效价分别为128万和32万,抗血清除了与大豆蛋白存在轻微交叉反应（<0.25%）外,与α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、蛋清蛋白、花生蛋白均无交叉反应,表明特异性高。结论:本研究制备了高纯度的α_S1-酪蛋白及其高特异性的多克隆抗体,为过敏原蛋白的纯化与综合鉴定提供了思路,为α_S1-酪蛋白免疫学检测方法的建立提供了物质基础。     

蛋白A的固定及在抗体亲和纯化中的应用

目的 以蛋白A作配基偶联活化的Sepharose 4FF后纯化兔免疫蛋白IgG.方法 以环氧氯丙烷(ECH)活化凝胶,正交试验确定最佳活化条件;以纯化数据确定抗体兔免疫蛋白IgG纯化最佳缓冲液盐浓度.结果 Sepharose 4FF最佳活化条件:ECH浓度20％(v/v),0.8 mol/L NaOH添加量为1 mL/1 g Sepharose 4FF湿胶,活化时间2.5 h,反应温度40℃.结论 建立将活化琼脂糖凝胶Sepharose 4FF与蛋白A偶联的条件,可应用于纯化兔免疫蛋白IgG.     

维氏气单胞菌来源几丁质酶的克隆表达及应用

丰年虾是一种小型甲壳类动物,孵化后的幼虫是水产动物的优质饵料,残留的卵壳则作为废弃物处理.然而丰年虾卵壳含有丰富的蛋白质和几丁质,具有极大的应用潜力.为了从丰年虾卵壳中制备几丁寡糖,选择了水解产物分布宽泛和含有几丁质结合域的维氏气单胞菌来源的几丁质酶ChiB565,将其在毕赤酵母Pichia pastoris中进行重组...     

鱼露中组胺降解菌的分离筛选及耐受性

生物胺(biogenic amines)在某些食品尤其是发酵食品中广泛存在,具有一定的食用安全隐患.为获得用于鱼露等发酵食品的生物胺降解菌,从天然发酵鱼露中采用双层显色培养基法初步筛选出不产生物胺的菌株,再用高效液相色谱(HPLC)法进行复筛,得到一株具有高效组胺降解能力的菌株MZ5.经鉴定该菌株为库德毕赤酵母(Pic...     

米黑根毛霉甘露聚糖酶的定向进化、高效表达与应用

为提高米黑根毛霉甘露聚糖酶（RmMan5A）对魔芋粉的水解效率,利用定向进化技术对该酶进行分子改造,经两轮筛选获得了一个对甘露聚糖酶催化效率显著提升的突变体（RmMan5AM2）。该突变体的最适pH为7.0,最适温度为65 ℃,较野生型甘露聚糖酶提高了10 ℃。该突变体继承了野生型甘露聚糖酶的高比酶活力,对槐豆胶的比酶活力达10 371.4 U/mg。在最适条件下,该突变体对槐豆胶、魔芋粉和瓜尔胶的催化效率分别提高了37.4%、28.9%和34.4%。进一步将该突变体在毕赤酵母中进行高效表达,经过156 h高密度发酵,发酵液胞外酶活力达176 000 U/mL,是目前产甘露聚糖酶的最高水平。利用该突变体水解魔芋粉成功制备魔芋甘露寡糖,产物主要为聚合度2~6的甘露寡糖（相对峰面积>85%）,总得率为88.5%。该突变体具有优良的酶学性质,对魔芋粉的水解效率显著提升,在魔芋甘露寡糖的酶法制备中具有很大的应用潜力。     

温度、保湿时间及菌龄对扩展青霉 H1侵染柑橘能力的影响

近年来,由扩展青霉(Penicillium expansum)引起的柑橘病害日益严重,目前对于柑橘采后病原菌侵染的研究主要以指状青霉(P.digitatum)和意大利青霉(P.italicum)为主,而对P.expansum侵染柑橘条件的研究还未见相关文献报道。作者以实验室前期筛选鉴定的P.expansum H1为研究对象,研究了不同温度、保湿时间和菌龄对P.expansum H1侵染柑橘的影响,结果表明,P.expansum H1在25℃时潜育期最短,侵染能力最强,4℃时P.expansum H1侵染能力受到抑制;保湿时间越长,越有利于P.expansum H1侵染柑橘;菌龄也会影响P.expansum H1侵染柑橘,不同菌龄的P.expansum H1侵染能力高低排序为:培养7 d培养11 d培养15 d培养9 d培养3 d。     

玛咖复合黄精和桔梗调节糖脂代谢作用的研究

旨在探讨玛咖、黄精和桔梗3种原料的水提物复方,在细胞水平对调节糖脂代谢的作用。用超声波辅助法分别提取玛咖、黄精和桔梗的水溶性成分,得到玛咖（maca）水提物,将黄精（HJ）水提物和桔梗（JG）水提物按质量比为1∶1的比例混合得到黄精-桔梗（HJJG）水提物。采用游离脂肪酸、果糖和葡萄糖诱导人肝癌细胞株（HepG2）细胞,建立糖脂代谢紊乱模型。以二甲双胍作为阳性对照组,分别评价质量浓度为0.25、0.5、1 mg/mL的maca水提物、HJJG水提物以及两者复配物对模型细胞的影响。测定的指标包括模型细胞的葡萄糖吸收量、细胞内糖原、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）的含量以及细胞内活性氧自由基（ROS）的水平。结果表明,玛咖和黄精-桔梗复配后能够通过促进糖吸收和细胞内糖原合成,以及降低细胞内TC含量和ROS水平P＜0.05）,调节模型组HepG2细胞糖脂代谢,其中质量浓度为1 mg/mL的玛咖和1 mg/mL HJJG（1∶1,体积比）复配后改善效果较优。     

克氏原螯虾虾青蛋白A2基因克隆、组织分布及原核表达

虾青蛋白对甲壳类水产品色泽的形成和调控具有重要作用。为探究克氏原螯虾虾青蛋白A2(PcCRA2)的基因结构及原核表达,作者通过基因克隆获得PcCRA2基因编码序列（cra2）,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测cra2基因在克氏原螯虾9种组织中的表达模式,并以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主,进行PcCRA2异源重组表达。结果表明,克氏原螯虾cra2基因cDNA全长573 bp,编码190个氨基酸。生物信息学分析显示,虾青蛋白A2相对分子质量为21 158.9,理论等电点为5.59。氨基酸序列比对发现,克氏原螯虾cra2编码蛋白质序列与红螯螯虾相似度最高,为91.58%。RT-qPCR结果显示,cra2在所检组织中均有表达,在表皮的表达量最高（P<0.05）。构建了pET28a-cra2原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达。其最佳诱导表达条件为：接种4 h后加入0.5 mmol/L IPTG于30℃诱导6 h;UV-vis结果表明重组蛋白质能与虾青素特异性结合,最大吸收峰为505 nm。该研究结果为进一步研究虾青蛋白质的生物功能奠定基础。     

苦荞对发酵豆乳纳豆激酶活力、风味及抗氧化活性影响

相较于纳豆,以纳豆芽孢杆菌发酵获得的发酵豆乳食用更方便,但同样存在纳豆激酶活性低、风味不良等缺点。作者首先研究了苦荞、糙米、薏米、藜麦、燕麦粉对纳豆芽孢杆菌产纳豆激酶能力的影响。结果表明,添加苦荞的效果最好,当添加质量分数为3%时,纳豆芽孢杆菌液体发酵的酶活力由原来的5 803.12 U/mL提高到23 326.23 U/mL;然后研究了苦荞粉对纳豆芽孢杆菌发酵豆乳的纳豆激酶活力、风味及抗氧化活性的影响。结果显示,当添加的苦荞质量为大豆质量的50%时,发酵豆乳的纳豆激酶活力、挥发性盐基氮质量浓度和总抗氧化能力分别为 4 460.28 U/mL、3.45 mg/dL和16.34 mmol/L,分别为纯大豆发酵所得豆乳的161.42%、79.84%和196.39%。添加苦荞能够明显提高发酵豆乳中纳豆激酶活力,并且改善风味和抗氧化活性。该研究可为开发富含纳豆激酶、食用方便的纳豆食品提供借鉴。     

TAT-SOD在长期保藏的重组毕赤酵母中表达的条件优化

TAT-SOD是TAT蛋白转导结构域与SOD的融合蛋白质。作者以2007年构建的产TAT-SOD重组毕赤酵母菌为出发菌株,通过摇瓶实验研究不同温度、初始pH、诱导剂浓度等因素对蛋白质表达的影响。通过比色分析法测定菌体浓度、超氧阴离子自由基清除法测定酶活、SDS-PAGE分析目的蛋白质TAT-SOD的浓度;并采用定量PCR法分析表达菌株的目的基因的mRNA变化规律,从而研究长期保藏重组毕赤酵母菌株表达TAT-SOD的适合性及其条件优化。研究结果表明,摇瓶发酵的最佳条件下（YPDM培养基,体积分数1.0%诱导剂浓度,诱导温度30.0 ℃,初始pH值7.0）,发酵液上清酶活水平为753 U/mL,是未优化初始酶活水平的5.1倍,其中pH值优化使TAT-SOD表达水平提高到原始值的3.4倍。7.0的初始诱导pH值的mRNA水平是对照组pH 4.0的3.5倍。这些结果说明,长期保藏的重组毕赤酵母菌株仍然适合表达TAT-SOD,发酵条件会对毕赤酵母的TAT-SOD表达造成显著影响,影响表达水平的最主要因素是目的蛋白质的mRNA水平变化。     

农杆菌介导转化黑曲霉条件优化及脂肪酶表达

优化了农杆菌介导转化黑曲霉的方法,优化条件包括共培养材料、农杆菌种类、诱导剂浓度、共培养时间、共培养温度以及共培养时农杆菌的菌体浓度。结果表明,农杆菌介导转化黑曲霉的最适条件为107个/mL不萌发的新鲜孢子与OD_(600)培养至0.9～1.0的农杆菌以1∶1的比例混合后,在乙酰丁香酮浓度为200μmol/L的IM平板上,23℃避光培养48 h后进行转膜,转化子个数可达到(60±5)个转化子/10~6个孢子,且阳性率达到90%以上。并且构建了同源黑曲霉脂肪酶的组成型和诱导型启动子表达载体,通过优化后的农杆菌介导转化方法转化至黑曲霉中,利用罗丹明橄榄油平板对产酶转化子进行筛选鉴定,并获得了阳性克隆。     

鼠李糖乳杆菌利用不同益生元的增殖及耐受性研究

作者旨在通过对比鼠李糖乳杆菌（Lactiplantibacillus rhamnosus）与不同益生元组合后,在生长情况、pH和胆盐耐受性及乳酸产量方面的变化筛选出鼠李糖乳杆菌与益生元的最佳组合。结果表明,鼠李糖乳杆菌GG（L. rhamnosus GG, LGG）、鼠李糖乳杆菌HN001在以低聚半乳糖为唯一碳源生长时,最大生物量分别为1.253、1.552,最大比生长速率分别为0.316、0.290 h^-1,乳酸产量分别为3.654、10.914 g/L,与其他益生元组合相比,表现出显著优势。为验证这两种组合在不同胁迫条件下的生长情况,进一步测定了其在不同pH和胆盐质量浓度下的耐受性。这两种组合在1 g/L胆盐条件下的最大生物量分别为0.712和0.694,在pH 4.0条件下的最大生物量分别为0.639和0.728,与其他组合相比存在极显著差异。该研究结果有助于推动鼠李糖乳杆菌与低聚半乳糖组合在食品、医疗等领域的广泛应用,为后续益生菌-益生元组合产品的开发提供了理论依据。