氧在重组毕氏酵母发酵过程中的摄取与传递

引言 在生物发酵过程中,氧的供需是一个至关重要的问题[1-2].好气性微生物需要足够的溶解氧以维持自身的呼吸代谢.     

提高重组毕赤酵母表达hIFNb-HSA的碳源控制策略

研究了重组毕赤酵母KM71/IH菌体生长阶段饥饿培养对其细胞相对活性及人b干扰素-血清白蛋白融合蛋白(hIFNb-HSA)表达的影响. 结果表明，在以甘油为唯一碳源的细胞培养后期进行饥饿培养以耗尽培养基中的甘油会导致重组细胞相对活性的降低，进而减少hIFNb-HSA的表达量. 在此基础上，提出了菌体培养后期，即过渡阶段流加甘露醇碳源代替饥饿培养的策略，不仅可以消除培养液中甘油残留对甲醇诱导表达hIFNb-HSA的不利影响，而且能够保持重组细胞培养物较高的相对活性(>97%)，从而可以提高甲醇诱导表达hIFNb-HSA的水平，表达量可达37.3 mg/L，最大生产强度为0.78 mg/(L×h)，较对照分别提高了92.3%和44.4%.     

碱性纤维素酶基因在巴氏毕赤酵母中的表达及重组酵母菌发酵工艺的优化

目的克隆碱性纤维素酶基因,构建酵母整合型表达质粒,在巴氏毕赤酵母中表达,并对重组菌的发酵工艺进行优化。方法应用PCR技术从嗜碱性芽孢杆菌ATCC21833中扩增碱性纤维素酶基因,克隆至酵母整合型表达载体pGAPZαA中,构建重组表达质粒pGAPZαA-ATCC21833,并转化至巴氏毕赤酵母GS115。通过单因素实验及正交实验,确定重组酵母的最佳发酵培养基。在20L发酵罐中进行高密度发酵,观察碳源对批式发酵的影响,并检测在4种流加方式(连续恒速流加、间歇匀速流加、间歇递减流加、维持底物浓度流加)下的菌体干重及发酵液中的酶活性。结果重组表达质粒pGAPZαA-ATCC21833经酶切及DNA测序证明构建正确,其基因序列与嗜碱性芽孢杆菌KSM-635的碱性纤维素酶基因序列一致。最佳发酵培养基组成为6%葡萄糖、2%硫酸铵、12g/L磷酸二氢钾。碳源浓度对于重组酵母菌体生长及产酶至关重要。SDS-PAGE表明表达产物的相对分子质量约为103000。维持底物浓度的流加方式可获得最高的菌体干重(29.8g/L)及酶活力(24U/ml)。结论已成功构建了表达碱性纤维素酶的巴氏毕赤酵母工程菌,并确定了维持底物浓度的流加方式为最佳发酵方式。     

表达重组人白细胞介素11的毕赤酵母两种培养方式比较

目的 将表达重组人白细胞介素11(rhIL-11)的毕赤酵母,分别进行常规的补料分批培养和连续培养,以获得一种高蛋白产率及低蛋白降解的培养方式。方法 两种培养方式均在10L的发酵罐中进行,常规的补料分批培养方式历时3～4d,连续培养方式则是在前者的基础上,以D=0.05/h的稀释率进入连续培养阶段,整个过程历时约20d。发酵过程取样测菌体A_(600)及SDS-PAGE分析。结果 连续培养方式rhIL-11蛋白的产出率约为常规补料分批培养方式的1.5倍。在发酵过程中,常规补料分批培养方式在第2天就出现了降解,而连续培养方式则在第17天才出现。结论 连续培养方式对rhIL-11生产具有较大的使用前景。     

猪血清白蛋白基因的克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达

目的克隆猪血清白蛋白(PSA)基因,并在毕赤酵母中分泌表达。方法Trizol法提取新鲜猪肝组织总RNA,经RT-PCR扩增PSA全长cDNA,克隆至酵母分泌型表达载体pPICZaC,构建重组表达质粒pPICZaC-PSA,电转化至毕赤酵母X33,甲醇诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重组表达质粒pPICZaC-PSA经双酶切及测序鉴定正确,表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约69500处可见特异条带,表达量为菌体总蛋白的29.5%,紫外吸收法测定蛋白含量为0.06mg/ml,并可与PSA多抗发生特异性反应。结论已成功克隆了PSA基因,并在毕赤酵母中获得表达。     

基于人工神经网络的重组毕赤酵母表达期菌体浓度模型

针对生物反应过程控制关键变量难以测量的问题,提出一种基于人工神经网络的重组毕赤酵母高密度发酵表达期的细胞菌量软测量模型,并对该模型的拓扑结构以及训练参数进行了初步探讨.当选取合适的模型结构和输入参数,模型的预测值最大误差为3.12%,表明该模型的计算值与菌体浓度实验值基本一致.因此,在毕赤酵母的高密度培养过程中采用基于神经网络的软测量模型具有较高的准确度,可以应用于发酵过程中菌体浓度的实时预测.     

拷贝数对毕赤酵母重组菌表达猪胰岛素前体的影响

通过5 L发酵罐补料分批培养,分析了猪胰岛素前体(PIP)基因拷贝数对毕赤酵母生长、细胞存活率和基因稳定性的影响.结果表明,在甘油阶段和甲醇诱导初期拷贝数对毕赤酵母的生长无显著影响,但在甲醇诱导24 h后高拷贝数毕赤酵母菌株(12拷贝重组菌A2和18拷贝重组菌A3)的比生长速率明显比低拷贝数菌株(1拷贝重组菌G1和6拷...     

多拷贝重组HBsAg质粒的构建及在毕赤酵母中的高效表达

目的通过构建多拷贝数表达质粒,获得高表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株。方法通过对单拷贝表达质粒进行改造,将表达盒(5′AOX-HBsAg-TT)重复导入载体,构建多拷贝数表达质粒。通过电转化、15L规模发酵和纯化,获得纯化HBsAg颗粒,并对表达产物的特异性、免疫原性及表达量与拷贝数间的关系进行分析。结果多拷贝数重组毕赤酵母的表达产物经ELISA、SDS-PAGE、Western blot检测,显示出良好的特异性,电镜观察证明表达产物能够自发装配成22nm类病毒颗粒(VLP),其表达量与拷贝数呈正相关,拷贝数提高未对菌体正常生长带来影响,HBsAg制备的免疫原能有效刺激小鼠产生保护性抗体。结论含多拷贝数表达质粒的工程菌可显著提高毕赤酵母HBsAg表达量。     

密码子优化的人成纤维细胞生长因子-21在毕赤酵母中的表达

目的在毕赤酵母中表达密码子优化的人成纤维细胞生长因子-21(hFGF-21),为探讨hFGF-21在糖尿病治疗方面的作用奠定基础。方法经密码子优化合成hFGF-21基因,构建表达载体pPICZαA-hFGF-21,电转化毕赤酵母GS115,斑点免疫印迹法筛选工程菌株,甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物,并对诱导条件进行优化。结果重组表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确。筛选出5株阳性菌株,诱导上清经SDS-PAGE分析,可见相对分子质量约为25000的目的蛋白条带,目的蛋白的表达量约为6μg/L。Westernblot显示该蛋白具有良好的反应原性。诱导96h和培养液pH值为4.0时,目的蛋白的表达量最高,甲醇浓度对表达量无影响。结论已成功构建了密码子优化的hFGF-21真核表达载体,并在毕赤酵母GS115中分泌表达了hFGF-21。     

经基因优化的HPV16L1蛋白在毕赤酵母中的表达

目的利用毕赤酵母表达系统(Pichia pastoris)高效表达HPV16L1蛋白。方法按照Pichia pastoris密码子偏爱性合成HPV16L1基因,构建pAO819r-16L1表达载体,电转化至GS115菌株中,经MD板和不同浓度G418筛选,挑取高拷贝整合菌株,甲醇诱导目的蛋白的表达,用HPV16L1抗血清,经Western blot检测蛋白的特异性。结果重组质粒pAO819r-16L1在甲醇营养型酵母菌株中经甲醇诱导后可表达HPV16L1蛋白,在试管中的表达量超过10mg/ml,经Western blot验证,该蛋白可与抗血清特异结合,在相对分子质量55000附近出现目的条带,证明该蛋白确为HPV16L1蛋白。结论利用毕赤酵母表达系统可高效表达HPV16L1蛋白,为研制HPV疫苗奠定基础。     

Model‐based specific growth rate control for Pichia pastoris to improve recombinant protein production

Constant specific growth rate control in the methanol growth phase was investigated for the fed‐batch cultivation of Pichia pastoris expressing recombinant human serum albumin (rHSA). The methanol feeding strategy was determined based on an earlier proposed macrokinetic model to maintain the specific growth rate at preset levels. The experimental results demonstrate that the control strategy of constant specific growth rate is more effective than that of constant feeding rate to maximize production. Furthermore, the most productive setpoint of the specific growth rate is found between 0.005 and 0.006 h^?1, which yields protein concentrations higher than 5 g l^?1 at 160 h. In addition, a setpoint of 0.008 h^?1 is suggested as the upper limit for specific growth rate control for the given expression system. Copyright © 2005 Society of Chemical Industry