番茄乙烯信号转录因子LeERF2在大肠杆菌中的表达和纯化

从破色期番茄果实中提取了总RNA,用RT-PCR方法从中克隆到了627bp全长LeERF2基因.测序结果分析表明,该LeERF2基因序列与已发表序列的同源性为100%.将LeERF2基因亚克隆至载体pET-30a上,构建了原核表达载体pE-LeERF2,将其转化到大肠杆菌BL21中.蛋白质诱导表达的温度为37℃,诱导剂IPTG浓度为1mmol/L,诱导时间为3 h,LeERF2表达蛋白在细菌沉淀中约占菌体总蛋白的58%.应用Ni-NTA亲和层纯化回收的LeERF2表达蛋白的纯度为99%.银染凝胶阻滞实验表明,LeERF2蛋白能与含有GCC盒的逆境相关的几丁质酶启动子基因TLBP1结合.     

菰黑粉菌孢子萌发过程形态学观察及系统发育研究

通过显微观察法研究菰黑粉菌厚垣孢子在28℃、PDA液体培养基中静止萌发各时期的菌体形态,克隆了菰黑粉菌18S rDNA序列并测序,结合已有ITS-5.8S rDNA序列和18S rDNA序列分析其系统发育地位.结果表明,从厚垣孢子到形成稳定的担孢子需要62~72 h,经历厚垣孢子萌发、芽管形成、先菌丝形成、担孢子和小孢子等几个阶段,在体外培养时多以棒状担孢子形态存在,培养30 d后,在培养基表面或边缘形成白色丝状菌丝;系统发育分析结果显示菰黑粉菌与Ustilago属和Sporisorium属亲缘关系较近,与黑粉菌属中的Ustilago triodiae亲缘关系最近.     

凋亡相关新基因TFAR19的cDNA克隆、表达和功能研究

利用RDA技术从人白血病细胞TF-1中克隆成功一个与凋亡相关的新基因TFA R19.序列分析表明,TFAR19 cDNA全长559bp,其中25-399bp编码125个氨基酸的蛋白质.mRNA斑点杂交分析表明TFAR19在50种组织中均有不同程度的表达.在大肠杆菌中表达并纯化了重组TFAR19蛋白质,制备了多克隆抗体,Western Blot发现TFAR19蛋白在凋亡的TF-1细胞中高表达.瞬时转染TFAR19正义基因后,TF-1细胞去细胞因子后凋亡速度增加.研究表明它能抑制胃癌细胞株803细胞和Hela细胞的生长,促进它们的去血清所致的凋亡.     

雌黄纳米粒对K562细胞的体外治疗作用及其机制

采用MTT法、细胞形态学观察和流式细胞术检测纳米雌黄对白血病K562细胞生长的影响;通过免疫组化、RT-PCR方法检测雌黄纳米粒处理K562细胞后凋亡相关基因的表达变化．结果表明,雌黄纳米粒能强烈抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡,效果明显优于普通雌黄;雌黄纳米粒对K562细胞的bcl-2蛋白、bcl-2mRNA、survivin蛋白以及survivin mRNA表达均有抑制作用,对bax蛋白与mRNA表达均有促进作用,提示其抗肿瘤作用可能与凋亡抑制基因bcl-2、survivin表达减少、促凋亡基因bax表达增强有关,并从mRNA水平上发挥作用,     

口蹄疫三价重组鸡痘病毒疫苗分子设计及其构建

针对我国口蹄疫(FMD)流行情况,利用计算机软件模拟分析,构建了口蹄疫病毒(FMDV)复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT.该表达盒以O型、A型FMDV结构蛋白VP1全基因和AsiaI型FMDV 2个基因拓扑型的结构蛋白VP1基因上的5个抗原表位基因(其中2个抗原表位来源于FMDVIND63/7株,该毒株与我国新疆分离株属于同一基因拓扑型,其余3个抗原表位来源于FMDVYNBS/58株)作为主要免疫原基因,以非结构蛋白上的2个Th2细胞表位基因及结构蛋白上的1个Th2细胞表位基因作为辅助基因.将构建好的表达盒OAAT和猪IL-18基因分别插入到鸡痘病毒(FPV)表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子(ATI-P7.5×20)和单一启动子(P7.5)下游,构建了携带OAAT表达金和猪IL-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-OAAT-IL18.应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株FPV共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经BrdU进行3次加压蚀斑筛选后,以不同代次的细胞mRNA为模板,利用FMDV VP1基因和猪IL-18基因特异引物进行RT-PCR和IFA检测,筛选出OAAT和猪IL-18基因共表达的重组鸡痘病毒rF-PV-OAAT-IL18,该重组鸡痘病毒的构建为新型FMDV活载体疫苗的研究奠定了基础.     

大豆NBS类抗病相关基因的克隆与序列分析

根据拟南芥RPS2基因、烟草N基因和亚麻L6基因的保守结构域设计简并引物,采用RT-PCR方法从大豆抗疫霉根腐病品种绥农10号的RNA中扩增获得两个通读的大豆NBS类抗病基因同源片段RNEAU-1和RNEAU-2,长度均为513bp,编码171个氨基酸。以RNEAU-1为靶序列,采用RACE方法获得了全长3574bp的大豆抗病相关基因SR1,该基因包括3411bp的开放读码框,72bp的5′非翻译区(non-translated region,NTR),68bp的3′非翻译区和20bp的多聚腺苷酸尾。编码1137个通读的蛋白质氨基酸序列,基因编码产物具有TIR、NBS、LRR、HD(conserved domain 1)和conserved domain 2等一系列抗病基因的保守结构域。同源性比较和序列分析显示,该基因为大豆中TIR-NBS-LRR类抗病相关基因。Southern杂交结果表明,SR1基因(或其同源基因)在大豆中具有2～4个拷贝。RT-PCR检测表明,SR1基因在大豆中为低丰度组成型表达,其表达不受病原菌接种和水杨酸的诱导,亦无组织特异性。以绥农10号基因组DNA为模板扩增得到长度为3972bp的SR1基因转录区核苷酸序列,其结构包含5个外显子和4个内含子。SR1基因在GenBank上的登录号为AY193892。     

番杏Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆及特性分析

根据同源序列设计筒并引物,通过RT—PCR及RACE的方法从盐生植物番杏中克隆出Na^ ／H^ 逆向运输蛋白基因。序列分析表明,该cDNA全长2199bp,开放读码框为1665bp,可编码一个554个氨基酸的多肽,与其他植物中已经克隆的Na^ ／H^ 逆向转运蛋白具有很高的同源性。系统发育分析表明该蛋白(TtNHX1)与液泡型的Na^ ／H^ 逆向转运蛋白的亲缘较近,与质膜型的Na^ ／H^ 逆向转运蛋白亲缘关系较远。TtNHX1的表达具有组织特异性,在番杏的根、茎和叶中均有表达,而花中没有表达。经NaCl诱导后根、茎和叶中的表达量增加,而花中仍没有表达。     

牙鲆抗菌肽hepcidin基因的克隆及表达分析

采用同源克隆的方法设计简并引物从牙鲆(Paralichthys olivaceus)肝脏中克隆了牙鲆hepcidin抗菌肽基因.牙鲆抗菌肽hepcidin基因组DNA全长821bp,序列分析表明该基因具有3个外显子和2个内含子.cDNA全长588bp,包含一个270bp的开放阅读框,编码一个长89氨基酸的前体肽.RT-PCR分析表明:该抗菌肽基因在正常牙鲆的肝脏、头肾、鳃、脾脏中表达量较高,在心脏、小肠中表达量较低;受到病原鳗弧菌感染的牙鲆各组织该基因表达量明显上升.牙鲆抗菌肽基因的克隆为水产养殖等领域的抗耐病品种的选育提供了基因源,为开发新的生物工程药物提供了基础理论和实验数据.     

抗真菌蛋白Rs-AFP2基因定点突变及其对大肠杆菌中表达的影响

为了研究遗传密码子对表达调控的影响,利用PCR重叠延伸法,对萝卜抗真菌蛋白Rs-AFP2基因编码序列区的部分核苷酸进行沉默突变,构建突变体Rs-AFPm.序列分析表明,PCR产物全长240bp,有一个阅读框,编码的蛋白由29个氨基酸的信号肽和51个氨基酸的抗真菌蛋白组成.突变体与突变前的Rs-AFP2基因相比,在编码区第3号氨基酸Lys相差一个碱基(TTG→TTA),第5号氨基酸Gln相差一个碱基(CAG→CAA),第6号稀有密码子Arg相差两个碱基(CAG→CGA).重新合成引物,将切除信号肽的Rs-AFP2基因和Rs-AFPm基因与原核表达载体pET-21b(+)分别重组到大肠杆菌BL21菌株.IPTG诱导后,二者均得到了表达.软件分析显示,突变前pETAFPo表达产物占全菌蛋白的3%,突变后pETAFPm的表达产物占全菌蛋白含量的8%;表达蛋白主要以包涵体的形式存在,包涵体经超声波破碎后,蛋白质复性,抑菌结果表明,pETAFPm表达产物的抑菌半径大于pETAFP2表达产物的抑菌半径.这些都说明改造后的Rs-AFPm基因与Rs-AFP2基因相比,已有效地提高表达量.     

牙鲆促性腺激素释放激素基因cGnRH-II和sbGnRH的克隆与表达特征分析

采用RACE和RT-PCR方法,从牙鲆脑组织中克隆获得了两种牙鲆促性腺激素释放激素cGnRH-II(DQ008580)和sbGnRH(DQ074693)的cDNA全基因序列,其长度为607 bp和395 bp,分别编码85和98个氨基酸的GnRH前体,均包含一个信号肽、具有活性的GnRH十肽和一个由蛋白水解位点(Gly-Lys-Arg)连接的GnRH相关肽.氨基酸同源性比较表明,牙鲆促性腺激素释放激素cGnRH-II与其他鱼类的cGnRH-II基因有较高的同源性,如与鲽科鱼类条斑星鲽的相似性为97.6%,但与哺乳类、爬行类和两栖类动物的同源性较低;sbGnRH与条斑星鲽的相似性为86.7%.采用RT-PCR方法分析了两种GnRH基因在成熟牙鲆个体中的表达,结果表明该两基因在脑区、垂体和性腺中皆有表达,但sbGnRH基因的体内表达部位稍多于cGnRH-II.