SIRT3多酚激活剂的筛选及其对UVB诱导HaCaT细胞衰老的修复作用

沉默信息调节因子2相关酶类3（silent mating type information regulation 2 homolog 3,SIRT3）是位于线粒体基质中的一种去乙酰化酶,在线粒体能量代谢、氧化应激调节、延缓衰老等方面具有重要的作用。本研究通过采用SIRT3-EGFP报告基因系统及实时荧光定量聚合酶链式反应技术,从白藜芦醇、山柰酚、石榴皮鞣素、安石榴苷、漆树黄酮、咖啡醇、矢车菊素、飞燕草素葡萄糖苷这8 种多酚类化合物中筛选SIRT3激活剂,并评价筛选得到的SIRT3多酚激活剂对于中波紫外线（ultraviolet radiation B,UVB）诱导的人正常皮肤永生化角质形成细胞（human immortalized keratinocytes,HaCaT）衰老的抑制作用。结果表明,白藜芦醇、山柰酚、安石榴苷、漆树黄酮和咖啡醇具有显著增强SIRT3基因表达水平的作用（P＜0.05）;白藜芦醇、安石榴苷、漆树黄酮以及咖啡醇均能有效降低UVB诱导的细胞内活性氧水平;这5 种多酚均显著提高了谷胱甘肽（reduced glutathione,GSH）/氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione,GSSG）比值（P＜0.05）,白藜芦醇与咖啡醇显著增强了超氧化物歧化酶2活性（P＜0.05、P＜0.01）;此外,安石榴苷不仅可以激活SIRT3,修复细胞的抗氧化系统,且显著降低了细胞衰老标志物SA-β-gal的相对活力（P＜0.05）。结论：白藜芦醇、山柰酚、安石榴苷、漆树黄酮和咖啡醇均能激活SIRT3基因的表达,其中安石榴苷能够显著修复UVB诱导的HaCaT细胞衰老,其抗衰老机制可能与SIRT3-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-GSH/GSSG抗氧化途径有关。     

安石榴苷对UVB诱导HaCaT细胞光损伤的保护作用

利用Caco-2细胞和HaCaT细胞建立肠-皮肤共培养体系,采用免疫荧光法评价安石榴苷对中波紫外线(UVB)诱导的光损伤产物环丁烷嘧啶二聚体(CPD)的抑制效果,通过实时荧光定量PCR、免疫沉淀、蛋白免疫印迹法探究安石榴苷对核苷酸切除修复(NER)途径相关基因转录和产物表达的影响。结果表明,安石榴苷能降低HaCaT细胞中的CPD水平,上调着色性干皮病基因组C(XPC)的mRNA转录水平,并以SIRT1基因依赖的方式降低XPA蛋白的乙酰化水平。这表明在Caco-2细胞与HaCaT细胞的肠-皮肤共培养体系中,安石榴苷可能通过激活NER途径相关的XPC/XPA蛋白促进UVB诱导的光损伤的修复,其作用依赖于SIRT1蛋白的去乙酰化活性。     

茶叶中表没食子儿茶素没食子酸酯抑制中波紫外线诱导HaCaT细胞氧化损伤研究

目的研究茶叶中表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对中波紫外线(UVB)诱导的人表皮角质形成细胞(HaCaT)光损伤的保护作用。方法用不同浓度的EGCG对HaCaT细胞进行预处理6 h,采用60 m J/cm2的剂量照射细胞,用MTT法检测细胞生存率,吸取细胞上清液检测超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH–Px)、乳酸脱氢酶(LDH)的活性和丙二醛(MDA)含量变化,用荧光法检测细胞内ROS含量。结果 UVB辐射对Ha Ca T细胞造成严重损伤,与对照组相比,细胞活性下降21.63%;与UVB辐射模型组相比,EGCG尤其高剂量可提高UVB照射后HaCaT细胞的存活率5.89%,显著提高SOD、GSH–Px活性(P0.01),降低LDH活性(P0.01),减少自由基ROS和MDA含量(P0.01)。结论 EGCG可以减少UVB诱导HaCaT细胞的损伤和凋亡,具有光保护作用,其机制与增强细胞抗氧化能力和加速清除氧自由基有关。     

灵芝双向发酵液对于HaCaT细胞中波紫外线损伤的修复研究

该研究通过液体深层发酵制备灵芝、灵芝-玉竹、灵芝-桦树茸、灵芝-人参以及灵芝-三七发酵液冻干粉,MTT细胞毒性实验及细胞形态学检测筛选出样品给药浓度,建立300 mJ/cm²中波紫外线(ultraviolet radiation b, UVB,290～320 nm)辐射人角质形成细胞(human immortalized keratinocytes, HaCaT)的损伤模型,酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法检测HaCaT细胞分泌炎症因子白细胞介素-1α(interleukin-1α,IL-1α)及前列腺素E2(prostaglandinE2,PGE2)的含量。以此来探究灵芝、灵芝-玉竹等发酵液冻干粉对UVB诱导的HaCaT细胞光损伤的修复作用,筛选出最优的灵芝发酵组合方式。研究结果发现,相比于灵芝发酵液冻干粉,灵芝-桦树茸发酵液冻干粉对IL-1α及PGE2的分泌有显著的抑制作用(P<0.05)。综上,相较于灵芝发酵液冻干粉,灵芝-桦树茸发酵液冻干粉修复HaCaT细胞UVB光损伤的能力最强,...     

儿茶素对巨噬-脂肪细胞共培养体系中细胞因子基因表达及AMPK/SIRT1磷酸化水平的影响

基于巨噬-脂肪细胞共培养体系研究儿茶素对细胞炎性因子、炎性酶基因表达及AMPK、SIRT1磷酸化水平的影响,初步阐明儿茶素的抗炎作用机制。儿茶素的添加质量浓度为0,50,100μg/mL,采用定量PCR方法检测细胞炎性因子及炎性酶基因的表达水平,采用Western blotting方法检测AMPK及SIRT1的磷酸化水平。结果表明,各处理组中,儿茶素明显抑制促炎性因子(IL-1、IL-6和IL-12)及炎性酶(iNOS和COX-2)基因的表达,促进抗炎性因子(IL-4和IL-10)基因的表达,并且提高AMPK和SIRT1的磷酸化水平,AMPK和SIRT1两者之间呈协同作用。共培养体系中巨噬细胞TNF-α的分泌可诱导脂肪细胞的分化与成熟,儿茶素通过AMPK/SIRT1信号途径调节细胞炎性因子基因的表达实现其抗炎作用。     

组合体外与临床测试评价植物抗氧化剂抗老化功效

基于非动物测试理念,研究植物抗氧化剂复配后的皮肤抗老化功效。方法 体外培养HaCaT角质细胞,紫外线照射诱发氧化损伤模型,分别加入白藜芦醇、原花青素和二者复配物,用MTT比色法、荧光素标记法和ELISA法检测细胞活性、活性氧簇自由基(ROS)、超氧化物岐化酶(SOD)、细胞周期及细胞凋亡的变化。对含两种植物原料的眼霜配方进行鸡胚尿囊膜血管试验(CAMVA)和牛角膜混浊渗透试验(BCOP)的组合测试评价其眼刺激性。选择平均年龄40岁的女性志愿者25名,眼部连续使用该眼霜60 d,于使用产品的第0、30和60 d分别检测皮肤的水份、水份流失、弹性和肤色等皮肤老化相关指标。结果 白藜芦醇-原花青素复配的植物抗氧化剂可明显缓解紫外线造成的HaCaT细胞氧化损伤,SOD水平明显升高(P<0.001),ROS荧光强度、细胞凋亡率及S期细胞比例均明显降低(P<0.001),细胞修复作用强于单独作用。经过替代方法组合评价其安全性后进行临床志愿者测试,证明皮肤保湿、弹性和皮肤颜色等指标得到改善。结论 白藜芦醇和原花青素两种植物抗氧化剂复配使用可有效减少皮肤氧化应激和明显改善皮肤性能。     

银耳多糖的抗光老化作用初探

本文使用紫外线B(UVB)照射人永生化角质形成细胞（HaCaT细胞）,采用CCK-8法及台盼蓝染色检测细胞活力对银耳多糖（TFPS）的抗光老化活性进行研究。结果表明,1～5 mg/mL银耳多糖（TFPS）可提高HaCaT细胞被UVB照射后降低的细胞活力且安全性好,研究为银耳多糖（TFPS）在具有抗光老化活性的功能护肤品或修复皮肤光损伤治疗药物方面的应用提供了实验依据。     

羟基酪醇对LPS引起的小鼠急性肺损伤的保护作用

探索了羟基酪醇通过调控自噬在小鼠ALI模型中发挥其抗炎作用的潜在分子机制。通过Western印迹和染色方法检测LPS诱导的ALI小鼠细胞因子活性、炎症因子水平、sirtuin(SIRT1/3/6)表达、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)激活和自噬标志物表达,用Sybyl/Surflex模块研究了HT与SIRT和MAPK之间的分子对接。结果显示,LPS刺激的SIRT抑制、MAPK磷酸化和自噬抑制均被HT给药显著消除。伴随着BAL液中肺W/D比值、蛋白质浓度和炎症细胞水平的降低,HT治疗显著减弱肺水肿和炎症细胞浸润到肺组织中。包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和MCP-1等炎症介质的LPS驱动释放,被HT强烈调控。     

紫苏提取物的自由基清除能力和皮肤角质形成细胞的保护作用

探讨紫苏甲醇提取物(PLME)的自由基清除能力和对过氧化氢诱发人类角质形成细胞(HaCaT)细胞氧化损伤的保护作用。细胞经氧化损伤造模后,换用含不同浓度(50~200μg/mL)的PLME继续培养24h,MTT法检测细胞生存率,硫代巴比妥酸比色法测定MDA含量。DPPH和羟基自由基清除实验测定PLME的体外自由基清除能力。PLME干预氧化损伤细胞后,细胞生存率上升,且MDA生成量减少,与未干预组相比较差异有统计学意义(P<0.01),并显示出剂量效应关系。此外,PLME对DPPH和羟基自由基有强清除能力,其对DPPH自由基半清除剂量IC50=9.07μg/mL,对羟基为IC50=49.28μg/mL。结果提示,PLME具有较强的自由基清除能力,同时还能有效地减少氧化损伤下HaCaT细胞内MDA生成,提高细胞生存率,对细胞应激损伤有保护作用。     

广西产铁皮石斛花提取物的细胞毒性及体外抗氧化活性研究

目的：探讨广西产铁皮石斛花不同提取物的细胞毒性及体外抗氧化活性。方法：以乙醇和水提取并通过冷冻和热风干燥获得铁皮石斛花提取物，测定提取物的总酚、总黄酮含量，以DPPH、 ABTS自由基清除率和FRAP总还原能力评价抗氧化活性并进行相关性分析；以MTT法测定提取物的细胞毒性；以丙二醛(MDA)含量、ABTS总抗氧化活性、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化氢酶(GSH-Px)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)的活性水平评价提取物对H₂O₂诱导细胞氧化应激的保护作用。结果：乙醇提取物的总酚和总黄酮含量均高于水提取物，且抗氧化活性总体优于水提取物，冷冻干燥乙醇提取物(DEF)最优；总酚、总黄酮含量与抗氧化指标的相关系数均高于0.7；提取物在100～800μg/mL下对HepG2细胞毒性低；经H₂O₂诱导HepG2细胞的氧化应激后，提取物干预能降低MDA含量，提高ABTS、CAT、GSH-Px和T-SOD的活性水平。结论：铁皮石斛花乙醇提取物的总酚、总黄酮含量及抗氧化活性最优，细胞毒性低，可通过提高抗氧化活性...     

荔枝果壳原花青素对中波紫外线诱导HaCaT细胞氧化损伤的保护作用

为评价荔枝果壳原花青素对中波紫外线（ultraviolet B,UVB）（波长280～320 nm）诱导人永生化角质形成细胞（HaCaT）氧化损伤的保护作用。构建UVB辐射HaCaT细胞氧化损伤模型,研究荔枝果壳低聚原花青素（litchi pericarp oligomolymeric procyanidins,LPOPC）及从中分离鉴定的6 种单体化合物对HaCaT细胞氧化损伤的保护作用。实验分为对照组、UVB照射组、实验组（阳性对照对氨基苯甲酸（para-aminobenzoic acid,PABA）、LPOPC及6 种单体化合物）,以CCK-8法测定各组细胞活力,采用试剂盒检测各组细胞内活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）相对含量,超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、过氧化氢酶（catalase,CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）活力,还原型谷胱甘肽（glutathione,GSH）及丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量。结果表明：LPOPC及6 种单体化合物的干预处理均可明显提高UVB诱导氧化损伤的HaCaT细胞活力,减少细胞内ROS和MDA的生成,增加SOD、CAT、GSH-Px的活力和GSH水平。6 种单体化合物中,原花青素A2的保护作用最明显,与阳性药物PABA的效果相当。结论：LPOPC及6 种单体化合物均可通过增强细胞内抗氧化能力、抑制脂质过氧化来明显改善受损细胞氧化应激损伤,对UVB诱导氧化损伤的HaCaT细胞具有良好的保护作用,提示原花青素A2是荔枝果壳原花青素中对氧化应激损伤防护作用最强的活性组分。     

红毛藻多糖对H2O2诱导的Caco-2细胞氧化损伤的保护作用

目的：研究红毛藻多糖（Bangia fusco-purpurea polysaccharide,BFP）对H2O2诱导的人结肠腺癌（Caco-2）细胞氧化应激损伤的保护作用。方法：构建过氧化氢（H2O2）诱导的Caco-2细胞氧化损伤模型,通过形态学观察和测定细胞裂解液中的抗氧化物水平及相关酶活力,评价BFP对Caco-2细胞氧化损伤的保护作用。结果：BFP可明显提高H2O2诱导氧化损伤的Caco-2细胞活力,降低细胞内活性氧生成水平,提高细胞内超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活力以及还原型谷胱甘肽水平,减少丙二醛生成,并通过抑制Caspase-3和Caspase-9活性来改善氧化应激损伤引起的细胞凋亡。结论：BFP对H2O2诱导氧化应激损伤的Caco-2细胞具有保护作用,可通过增强细胞内源性抗氧化酶活力、提高非酶类抗氧化物水平和抑制细胞凋亡明显缓解H2O2诱导的Caco-2细胞氧化应激损伤。     

山楂果胶低聚半乳糖醛酸提取物对中波紫外线辐射HaCaT细胞氧化损伤和光老化的保护作用

探讨了山楂果胶低聚半乳糖醛酸提取物对中波紫外线（ultraviolet B,UVB）辐射后人永生化表皮角质形成细胞（HaCaT）的氧化损伤和光老化的保护作用。体外培养HaCaT细胞,分为对照组（HaCaT细胞不照射UVB,不给予山楂果胶低聚半乳糖醛酸提取物处理）、UVB辐射组（30 mJ/cm2）、低剂量（5 μg/mL）山楂果胶低聚半乳糖醛酸＋30 mJ/cm2 UVB辐射组、高剂量（10 μg/mL）山楂果胶低聚半乳糖醛酸＋30 mJ/cm2 UVB辐射组。以噻唑蓝比色法检测细胞活力,采用试剂盒检测超氧化物歧化酶（superoxide dismulase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）、过氧化氢酶（catalase,CAT）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）活力,丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量,羟脯氨酸（hydroxyproline,Hyp）质量浓度和活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平。采用酶联免疫吸附测定实验检测肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor alpha,TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）质量浓度和基质金属蛋白酶-1（matrix metalloproteinase 1,MMP-1）含量。结果表明,经UVB照射后,HaCaT细胞活力明显降低。低、高剂量的山楂果胶低聚半乳糖醛酸提取物对经UVB辐射的HaCaT细胞具有显著的增殖作用（P＜0.05）;SOD、GSH-Px、CAT活力增加;LDH活力、ROS水平和MDA含量下降;Hyp质量浓度增加;MMP-1含量和TNF-α、IL-6质量浓度下降,且与辐射组比较均具有显著或极显著差异（P＜0.05或P＜0.01）。实时荧光定量聚合酶链式反应检测MMP-1、TNF-α及IL-6 mRNA表达水平与其含量或质量浓度检测结果一致。因此,山楂果胶低聚半乳糖醛酸对UVB辐射HaCaT细胞的氧化损伤及光老化具有保护作用。     

天麻素调控SIRT3改善BV2细胞衰老和炎症的作用

目的:探讨天麻素对D-半乳糖诱导的BV2细胞衰老的保护作用及机制。方法:使用不同浓度（10、20、30和40 μg/mL）的D-半乳糖刺激BV2细胞24 h,建立细胞衰老模型,并用CCK-8法筛选出D-半乳糖的最佳造模浓度;实验分为4组:正常组、模型组、Silent mating type information regulation 2 homolog 3（SIRT3）抑制剂+天麻素组和天麻素组;用CCK-8法检测不同浓度（10、20、30、40和50 μmol/L）的天麻素对D-半乳糖刺激的BV2细胞活力的影响,并筛选出最佳的天麻素浓度;使用β-半乳糖苷酶（Senescence β-Galactosidase,SA-β-Gal）染色检测细胞衰老面积;使用生化法检测各组细胞活性氧（Reactive oxygen species,ROS）水平;使用Enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）法检测各组细胞神经炎症因子IL-1β（Interleukin 1β,IL-1β）、IL-6（Interleukin 6,IL-6）和TNF-α（Tumor necrosis factor α,TNF-α）水平;使用免疫荧光法检测各组细胞SIRT3荧光强度;使用Western Blot法检测细胞SIRT3、P16和P21的蛋白表达水平。结果:30 μg/mL的D-半乳糖刺激BV2细胞活力极显著降低（P<0.01）,引起BV2细胞中SA-β-Gal染色面积和衰老蛋白P16和P21表达极显著增加（P<0.01）,细胞中ROS水平和炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平极显著增高（P<0.01）,细胞内SIRT3蛋白表达极显著降低（P<0.01）。而30 μmol/L天麻素能极显著提高D-半乳糖刺激的BV2细胞活力（P<0.01）,并且极显著降低细胞SA-β-Gal染色面积和衰老蛋白P16和P21表达水平（P<0.01）,极显著降低ROS水平和神经炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平（P<0.01）,极显著提高细胞内SIRT3蛋白荧光强度和表达水平（P<0.01）。结论:天麻素能够提高D-半乳糖刺激的BV2细胞活力,改善BV2细胞衰老染色和衰老蛋白表达,并降低ROS水平和减缓炎症反应,这可能与天麻素提高SIRT3蛋白表达有关。     

笛鲷鱼鳞源功能多肽对Caco-2细胞氧化应激损伤的保护作用

本实验利用650μmol/L H₂O₂构建Caco-2细胞氧化应激损伤模型,探究笛鲷鱼鳞源功能多肽(crimson snapper scale peptides,CSSPs)对Caco-2细胞氧化应激损伤的保护作用。通过测定细胞上清液乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活力和白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)质量浓度、胞内抗氧化酶活力和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)相对含量、相关凋亡基因(Caspase-3、Caspase-9、Bax和Bcl-2)的相对表达量,从细胞氧化还原状态和细胞凋亡两方面阐明CSSPs对损伤Caco-2细胞的抗氧化作用。结果显示,CSSPs能够通过抗氧化防御系统来减轻H₂O₂对Caco-2细胞的损伤,主要包括增加胞内抗氧化酶活性以抑制LDH释放、胞内ROS积累、MDA及IL-8的生成。此外,CSSPs抑制氧化应激损伤诱导的细胞凋亡与线粒体...     

Inhibition of β-amyloid peptide-induced neurotoxicity by kaempferol 3-O-(6″-acetyl)-β-glucopyranoside from butterbur (Petasites japonicus) leaves in B103 cells

One of predominant hallmarks in Alzheimer’s disease (AD) is extracellular senile plaques containing β-amyloid peptide (Aβ). Aβ is known to be directly responsible for the free radical production and lipid peroxidation, leading to apoptosis and cellular death. In this study, we investigated the possible protective effect of kaempferol 3-O-(6″-acetyl)-β-glucopyranoside (KAG) isolated from butterbur (Petasites japonicus) leaves against Aβ-induced neurotoxicity. Exposure of mouse neuroblastoma B103 cells to Aβ(25–35) at the concentration of 50 μM significantly reduced cellular viability and increased both oxidative stress and apoptotic rate. However, pretreatment of B103 cell with isolated KAG at 10 μM significantly inhibited Aβ-induced apoptotic cellular damage and reactive oxygen species (ROS) generation. Pretreatment of KAG also completely inhibited caspase-3 activity to the basal level at the concentration of 10 mM. This study therefore demonstrated that Aβ induced cellular death might be prevented by KAG from butterbur leaves by the suppression of ROS and the subsequent recovery of apoptotic cell death.     

白藜芦醇对玉米赤霉烯酮毒素致人胚肾HEK293细胞毒性的干扰作用

玉米赤霉烯酮毒素(ZEA)是一种非甾体霉菌毒素,存在于霉变的谷物中,具有类其雌激素样作用,能引起生殖机能异常。但是关于ZEA的肾脏毒性研究的比较少。白藜芦醇(RSV)是在红酒、葡萄中存在的一种多酚化合物,具有抗氧化作用。通过不同浓度梯度的ZEA(3、15、75、150、300μM)、RSV(0、0.01、0.1、1、10、100μM)和DL-α-lipoic acid(LA)(0、1、10、100、1000μM)作用于人胚肾HEK293细胞24 h,细胞活性的测定显示ZEA对HEK293细胞的IC50为80μM,而RSV(10μM)和LA对细胞无明显损伤。利用RSV和LA对细胞进行预处理24 h之后,再将ZEA作用于细胞24 h,通过细胞增殖力、ROS、MDA、SOD、Mn SOD指标的检测,表明RSV/LA能提高细胞的抗氧化性,减轻ZEA产生的细胞毒性和氧化损伤。同时,ZEA可引起促凋亡基因Bax的显著表达,但对于SIRT1和抗凋亡基因Bcl-2的表达没有影响,而RSV预处理能显著提升SIRT1和Bcl-2的表达,降低Bax的表达,发挥抗凋亡作用。