碱性木聚糖酶在毕赤酵母的表达及酶学性质研究

将教酒链霉菌L1105第10家族碱性木聚糖酶基因去除纤维素结合域(CBD)后将功能结构域基因xynAe SC克隆到毕赤酵母表达载体。经筛选得到重组工程菌GS1153-20,用甲醇诱导后产酶活力达到最高683±9U/m L。结果表明,重组木聚糖酶的最适p H为7.2,且在p H 6.2~8.6有较高的相对酶活;其最适温度为70℃,40~60℃时相对酶活力都在70%以上;重组酶Xyn Ae SC以燕麦木聚糖为底物时,酶活力最高,相对酶活力为桦木的259.7%±10.7%;对甘蔗渣木聚糖的酶活力最低,只有对桦木木聚糖酶活的16.0%±1.5%。研究表明,碱性木聚糖酶基因成功地在毕赤酵母中表达,且去除CBD域后,其酶学性质并未改变。     

杂合木聚糖酶的设计及在毕赤酵母中的表达

人工设计合成木聚糖酶,为木聚糖酶分子改造研究提供新思路。采用合成生物学思路,以黑曲霉XZ-3S木聚糖酶Xyn ZF-2基因序列为基础,将N端48个氨基酸替换成Ev Xyn11 N端的34个氨基酸;引入芳香族氨基酸P9Y和H14F;在C端引入二硫键Cys38-Cys191;α-螺旋及cord区域分别引入疏水性氨基酸K164M、G166A、N160I、V111A以及G109A,设计杂合酶Xyn ZL。基因全合成后,构建毕赤酵母重组表达质粒p PIC9K-ZL,将其转化酵母菌GS115,对工程菌GS115-XynZL进行单因素发酵条件优化及重组酶酶学性质测定。最佳发酵培养基为土豆培养基,最佳诱导温度为28℃,最佳种龄为20 h,最佳诱导时间为168 h,最佳诱导起始pH值为6. 5,甲醇诱导最佳体积分数为15 mL/L。重组酶酶学性质显示:最佳反应温度为55℃,最适pH值为5. 0,杂合酶Xyn ZL在毕赤酵母中表达后具有特定性质和功能,其设计方法拓宽了木聚糖酶分子改造研究的思路。     

枯草芽孢杆菌B2(Bacillus subtilis B2)木聚糖酶在毕赤酵母中的表达

木聚糖酶是主要工业用酶制剂之一,在食品行业应用广泛.将编码枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis B2)木聚糖酶XYN的基因克隆到pPIC9K载体中,构建了分泌型表达载体pPIC9K-XYN,载体经线性化后转化Pichia pastoris GS115,G筛选获得了分泌表达XYN的重组毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-XYN.初步研究表明:以山毛榉木聚糖为底物时,重组毕赤酵母工程菌摇瓶水平发酵上清液中木聚糖酶酶活可迭1542.6 U/mL,重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH值为6.0,并显示出较好的热稳定性和宽pH适应性.     

玉米皮纤维发酵裂褶菌的产酶分析及木聚糖酶基因克隆、表达和酶学性质测定

以玉米皮为唯一碳源培养裂褶菌,分别测定发酵液中半纤维素酶活性,结果显示木聚糖酶酶活为7.45U/mL、乙酰木聚糖酯酶酶活为3.41 U/mL、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-葡萄糖醛酸苷酶活相对较低,分别为0.44 U/mL和0.074 U/mL。根据酶活测定结果克隆了裂褶菌的木聚糖酶基因Xyn22,完成了该基因在大肠杆菌中的表达、重组蛋白纯化和性质研究。Xyn22的最适反应温度为40℃,当反应温度在45℃时其相对酶活在80%以上。Xyn22的最适pH为5.0,在4.5~6.5的范围内酶活均在80%左右。Xyn22在pH 3.0~10.5范围内较稳定,酶活保持在80%左右。Mg~(2+)、Ba~(2+)、EDTA和Hg~(2+)对酶活有很大的抑制作用,Hg~(2+)可以使Xyn22几乎完全失活。     

嗜热裂孢菌木聚糖酶在毕赤酵母中的表达及酶学性质

将优化后的来自嗜热裂孢菌的木聚糖酶基因在毕赤酵母中进行异源表达并分析了其表达产物的酶学性质。对来源于嗜热裂孢菌的木聚糖酶基因催化域进行密码子优化,人工合成优化后的木聚糖酶成熟肽基因xyl11~M,构建重组表达质粒pPIC9K-xyl11~M,将其经SalⅠ线性化后电击转化毕赤酵母GS115,经G418筛选得到重组工程菌GS115/xyl11~M,甲醇诱导表达重组蛋白。表达的重组蛋白reXyl11M经SDS-PAGE分析,其相对分子质量约34 000,酶活性可达到105.3 U/m L,最适反应温度为70℃,并在30~75℃温度内较稳定;最适反应pH为6.0,在pH6.5~7.5范围内稳定;Co~(2+)、Ba~(2+)、Cu~(2+)、Li~+对酶活性有强烈的激活作用,Fe~(3+)有明显的抑制作用,其它金属离子及EDTA对re Xyl11M酶活性影响不大。结果表明xyl11M成功在毕赤酵母GS115中实现表达,且reXyl11~M的酶学特性优良。     

木聚糖酶Xyn43A基因在大肠杆菌及毕赤酵母中的表达比较

根据木聚糖酶Xyn43A基因序列,设计特异性引物,以p MD18-T-Xyn43A重组质粒为模板克隆Xyn43A成熟肽基因,将该基因分别克隆到大肠杆菌表达载体p ET-28a和毕赤酵母表达载体p PIC9K中,分别在大肠杆菌BL21及毕赤酵母GS115中表达。重组酶在大肠杆菌中胞内表达,比酶活力可达61.43 U/mg。重组酶在毕赤酵母中分泌表达,比酶活力可达145.24 U/mg。酶学性质显示,BL21-Xyn43A、GS115-Xyn43A重组酶最适温度、p H相同均为45℃、p H 5.0。GS115-Xyn43A温度稳定性、p H稳定性均优于BL21-Xyn43A。     

枯草芽孢杆菌B2（Bacillus subtiIis B2）木聚糖酶在毕赤酵母中的表达

木聚糖酶是主要工业用酶制剂之一,在食品行业应用广泛。将编码枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis B2）木聚糖酶XYN的基因克隆到pPIC9K载体中,构建了分泌型表达载pPIC9K-XYN,载体经线性化后转化Pichia pastoris GS115,G筛选获得了分泌表达XYN的重组毕赤酵母工程菌GS115／pPIC9K-XYN。初步研究表明：以山毛榉木聚糖为底物时,重组毕赤酵母工程茵摇瓶水平发酵上清液中木聚糖酶酶活可达1542.6U／mL,重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH值为6.0,并显示出较好的热稳定性和宽pH适应性。     

双功能木聚糖酶Xyn2083的异源表达和酶学性质研究

木聚糖酶Xyn2083来源于Clostridium clariflavum,是一种双功能木聚糖酶,包括2个催化结构域GH11、GH10(glycosyl hydrolase families,GH)和一个非催化结构域DockerinΙ。在文中,将该双功能木聚糖酶基因及GH11、GH10这2个结构域的木聚糖酶基因成功在大肠杆菌Rosetta (DE3)中进行异源表达,得到了3个重组木聚糖酶。将纯化后重组酶进行酶学性质分析,结果表明Xyn2083的最适反应温度与p H值分别为60℃、6. 0,且在60℃以下或p H 4. 5～10. 5的范围内有较好的稳定性。水解反应研究表明,Xyn2083中GH11和GH10结构域协同作用于木聚糖底物,将木聚糖水解为木糖和木二糖。     

黑曲霉xynC基因编码一种低温酸性木聚糖酶

木聚糖酶(xylanase,EC 3.2.1.8)可以随机切割木聚糖主链的β-1,4-糖苷键,在饲料、食品、造纸和纺织等领域具有广泛的应用。该研究通过分子克隆技术将黑曲霉CICIM F0510来源的木聚糖酶基因xyn C在毕赤酵母中进行了克隆表达,构建获得了重组菌GS115(p PIC-XynC)。在摇瓶水平上,重组菌的酶活为1.14 U/m L。酶学性质的研究表明,重组酶XynC的最适反应温度和pH分别为30℃和2.5,且它在25~40℃或pH 2.0~5.0有较好的稳定性;K+对XynC的活性有微弱的促进作用,而Ca~(2+)、Co~(2+)、Mn~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(3+)、Sn~(2+)、EDTA和SDS等对XynC的活性有不同程度的抑制作用。此外,该酶还可以水解戊聚糖产生聚合度为3~6的低聚木糖。这些良好的理化性质为重组酶XynC在饲料及食品等领域的应用奠定了基础。     

毛壳霉木聚糖酶B（CsXyn11B）的分泌表达及其在面包中的应用

目的:对毛壳霉（Chaetomium sp.）CQ31木聚糖酶B（CsXyn11B）进行分泌表达,以提高产酶水平并探究在面包烘焙中的应用价值。方法:将木聚糖酶基因在毕赤酵母中表达,高密度发酵提高其产酶水平,对酶学性质进行表征并将其应用在面包烘焙中。结果:重组菌经高密度发酵156 h,木聚糖酶酶活力为2788 U/mL。CsXyn11B最适pH为8.0,最适温度为65 ℃。CsXyn11B能够水解多种木聚糖底物,对燕麦木聚糖、小麦阿拉伯木聚糖、榉木木聚糖和桦木木聚糖的比酶活分别为1145.8、1041.7、692.3和653.3 U/mg。该酶水解阿拉伯木聚糖,水解产物以聚合度4~6的低聚木糖为主。在面包制作过程中加入3 mg/kg CsXyn11B使面包比容增加15.9%,面包硬度降低25.3%,4 ℃贮藏2 d后硬度比对照组降低17%。结论:毛壳霉木聚糖酶B的优良酶学特性使其在烘焙食品中具有良好的应用前景。     

毕赤酵母液态木聚糖酶的酶学特性研究

研究了毕赤酵母液态木聚糖酶的部分酶学特性,包括其最适温度、最适pH、温度稳定性和热失活动力学、pH稳定性和pH失活动力学,以及金属离子、有机溶剂对毕赤酵母液态木聚糖酶酶活特性的影响。结果表明,毕赤酵母液态木聚糖酶的最适温度为55℃、最适pH为pH5.6;温度为25℃时,pH5.6-6.4该液态木聚糖酶失活速率缓慢。毕赤酵母液态木聚糖酶在50℃以下在150 min内比较稳定的,70℃在30 min内几乎全部失活。Cu2+,Zn2+,Fe3+表现为不同程度的抑制作用。Mn2+,Mg2+对木聚糖有激活作用。乙醇和甘油对毕赤酵母液态木聚糖酶有轻微的抑制作用,蔗糖和Vc对毕赤酵母液态木聚糖酶有不同程度的激活作用。     

乙酰木聚糖酯酶基因的克隆、表达及酶学性质研究

乙酰木聚糖酯酶可以水解乙酰化木聚糖的O-乙酰基,消除木聚糖酶水解木聚糖时该基团产生的空间阻碍作用。以宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株的总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增了乙酰木聚糖酯酶成熟肽的编码基因(Auaxe),并构建了重组表达质粒p PIC9KM-Auaxe,SalⅠ线性化后电转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,经G418抗性筛选及甲醇诱导表达72 h,获得了重组乙酰木聚糖酯酶(re Au Axe),其酶活性为35.6 U/m L。发酵液经纯化获得电泳纯re Au Axe,其表观相对分子质量约为3.4×104,比酶活性为390.5 U/mg。纯化后re Au Axe的最适反应温度为50℃,在45℃及以下稳定;其最适反应p H为6.0,在p H 4.5~7.0范围内稳定;所测的多数金属离子及EDTA对其酶活性影响不大。     

耐热木聚糖酶基因xyn11EM在大肠杆菌中的表达

将人工合成经密码子优化的11家族耐热木聚糖酶基因xyn11~(EM)克隆至表达质粒p ET-28a(+)中,获得重组质粒p ET-28a-xyn11~(EM)。将其转化Escherichia coli BL21(DE3),构建表达耐热木聚糖酶的重组工程菌E.coli BL21/xyn11~(EM)。用IPTG诱导表达重组木聚糖酶Xyn11~(EM)(re Xyn11~(EM)),酶活性可达47.5 U/m L。SDS-PAGE分析显示,re Xyn11~(EM)的表观相对分子质量为24 800。re Xyn11~(EM)的最适反应温度为70℃,在70℃以下稳定。最适反应p H为6.5~7.0,在p H5.0~8.0范围内稳定。大多数金属离子和EDTA对该重组酶的活性影响不大。re Xyn11~(EM)的Km和Vmax值分别为7.2 mg/m L和54.7 U/mg。结果表明xyn11~(EM)成功在E.coli中实现了异源表达,其良好的热稳定性具有较好的工业应用潜力。     

内切葡聚糖酶与木聚糖酶在毕赤酵母中的共分泌表达

为实现内切葡聚糖酶和木聚糖酶在毕赤酵母中的共分泌表达,进而降低酶制剂的生产成本,构建含木聚糖酶基因的重组表达载体pPICZαA-Aoxyn11A,经SacI线性化后,电转化至含内切葡聚糖酶基因Aucel12A的重组毕赤酵母GSC7中,获得双重重组毕赤酵母GSCX8。经甲醇诱导表达后,GSCX8发酵上清液中内切葡聚糖酶和木聚糖酶的活性分别为47.77IU/mL和192.71IU/mL,为单独表达菌株GSC7和GSX5的85%和80%。酶学性质分析显示,内切葡聚糖酶的最适pH为4.0,在pH3.0~8.5稳定;最适温度为50℃,在60℃以下稳定。木聚糖酶的最适pH为5.5,在pH3.0~10.0稳定;最适温度为55℃,在50℃以下稳定。GSCX8遗传稳定性测试结果表明,内切葡聚糖酶和木聚糖酶在毕赤酵母中实现了稳定的共表达。     

镰刀菌Fo47来源木聚糖酶的异源表达、酶学性质及其对全麦面包品质的影响

为开发新型面粉改良酶制剂,该研究对通过基因组挖掘手段筛选出的一种新型木聚糖酶——镰刀菌Fo47来源木聚糖酶（Fusarium oxysporum Fo47 xylanase,FXYL）,利用毕赤酵母X33首次对其进行异源表达,分析重组FXYL的酶学性质,并初步探究重组FXYL对全麦面包品质的影响。结果表明,摇瓶发酵144 h后,重组毕赤酵母发酵上清液木聚糖酶酶活力为779.64 U/mL;经过Ni-NTA柱层析纯化后,重组FXYL的比酶活为764.33 U/mg;酶学性质研究表明,重组FXYL最适反应pH值为5.0,最适反应温度为45℃,在中温（＜40℃）和pH 5.5～10.0表现出较好的稳定性。重组FXYL的酶学性质较适合面团发酵的偏酸环境;添加重组FXYL能够显著提高全麦面包的比容和弹性,降低全麦面包的硬度和咀嚼性,有望发展为一种新型面粉改良剂。     

耐热木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质

将一种11家族极端耐热木聚糖酶的密码子优化基因Syxyn11克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,得到重组质粒pPIC9K-Syxyn11,将其经SalⅠ线性化后转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115。经G418筛选得到重组工程菌GS115/Syxyn11,用甲醇诱导表达重组木聚糖酶SyXyn11,酶活可达到17.74 U/mL。SDS-PAGE显示,SyXyn11的相对分子质量为31 000。SyXyn11的最适反应温度为85℃,在80℃以下稳定。最适反应pH为6.5,在pH 5.0~7.5范围内稳定。EDTA和大多数金属离子对重组酶的活性影响不大。结果表明Syxyn11成功在P.pastoris GS115中实现表达,而且重组木聚糖酶的耐热性并未改变。     

产木聚糖酶毕赤酵母工程菌株构建及表达条件优化研究

将黑曲霉XZ-3S木聚糖酶Xyn43A成熟肽基因插入表达载体p PIC9K,重组质粒SalⅠ线性化后分别电击转化2种毕赤酵母GS115和KM71,转化液经MD平板、G418浓度梯度平板和摇瓶复筛,获得两株重组菌GS115/Xyn43A(Mut~+)和KM71/Xyn43A(Mut~s)。其中GS115/Xyn43A菌株最优表达条件为:甲醇浓度2.0%,接种时间24 h,诱导时间108 h,诱导温度30℃、诱导培养基初始p H6.3;KM71/Xyn43A菌株最优表达条件为:甲醇浓度1.75%,接种时间26 h,诱导时间132 h,诱导温度30℃、诱导培养基初始p H6.5。在最优表达条件下两重组菌GS115/Xyn43A和KM71/Xyn43A比酶活力分别可达139.36、143.29 U/mg。     

来源于Rhodohalobacter barkolensis的昆布多糖酶RbLam16的重组表达及生产条件优化

为实现昆布多糖酶的异源表达以及提高工程菌的产酶水平,将来源于Rhodohalobacter barkolensis的昆布多糖酶RbLam16基因经密码子优化后克隆至pPIC9K质粒,并重组到毕赤酵母GS115中。分泌表达的重组酶经镍柱纯化后对其酶学性质进行表征;为提高酶的表达量,对重组毕赤酵母菌的发酵条件进行了优化。结果表明:Rb Lam16能够在毕赤酵母GS115中高效分泌表达;以来源于海带的昆布多糖作为水解底物时,RbLam16最适反应温度及p H分别为55℃和p H 7.0;通过热稳定性及pH稳定性研究发现,RbLam16在55℃保温30 min后,残留酶活力在90%以上;在50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)中保存24 h后残留酶活力高达90%;金属离子Mn2+和Co2+对酶活力有促进作用,而Cu2+、乙二胺四乙酸和十二烷基硫酸钠可严重抑制酶活力。发酵条件优化结果显示,在发酵液初始p H为6.0、培养温度为28℃以及每24 h添加体积分数1.5%的甲醇条件下发酵120 h,发酵上清液中酶活力达到27.42 U/m L,与初始酶活力相比提高了26.42%。R...     

引入盐桥改善木聚糖酶AoXyn11A的温度特性

为改善米曲霉(Aspergillus oryzae CICC40186)木聚糖酶Ao Xyn11A的温度特性,基于其与同一糖苷水解酶家族耐热木聚糖酶Ev Xyn11TS一级和三维结构的比对和分析,在Ao Xyn11A N端空间区域引入3对盐桥。采用大引物PCR技术对野生型木聚糖酶基因(Aoxyn11A)实施定点突变,构建突变酶Ao Xyn11AS基因(Aoxyn11AS)。分别将Aoxyn11A和Aoxyn11AS在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中进行表达。酶学性质分析显示:Ao Xyn11AS的最适温度(Topt)为58℃,较Ao Xyn11A提高了8℃;突变酶在50℃的半衰期(t501/2)为60 min,较原酶延长了1倍多,其在55和60℃完全丧失酶活性的时间分别由原酶的15和4 min延长至35和15 min;而突变酶的p H特性和动力学常数较原酶改变不大。在Ao Xyn11A N端空间区域引入盐桥增加了其三维结构的刚性,从而明显改善了其温度特性。     

嗜热地衣芽孢杆菌植酸酶的原核表达及酶学性质研究

将地衣芽孢杆菌SR01(Bacillus licheniformis SR01)的植酸酶phy基因重组于表达载体p GEX-4T-3中,导入大肠杆菌BL21(Escherichia coli BL21)构建工程菌p GX1143,并得到了高效表达。对其酶学性质的研究表明:该酶最适反应p H为5.0,最适反应温度为55℃,具有广泛的p H稳定性和较好的热稳定性;Co~(2+))、Li~+、Mg~(2+))和Ba~(2+)对酶活性有促进作用,Cu~(2+)、Pb~(2+)、Fe~(2+)、Ag~+、SDS对酶活性有不同程度的抑制作用,并且Pb~(2+)、Fe~(2+)和SDS对酶活性的抑制作用较强烈;此外,该酶还具有非常好的抗胰蛋白酶水解能力和部分抗胃蛋白酶水解的能力。