强烈炽热球菌几丁质酶水解制备低脱乙酰度壳寡糖及其组成与结构分析

利用全基因合成方法合成了强烈炽热球菌（Pyrococcus furiosus）的几丁质酶编码基因并在大肠杆菌（Escherichia coli）中实现了可溶表达。利用该酶对低脱乙酰度壳聚糖进行水解并对获得的壳寡糖产物进行组成及结构分析。分子排阻高效液相色谱结果显示,水解产物相对分子质量分布范围为1?000～5?000。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析结果显示,酶解产物中包含聚合度2～9、不同脱乙酰度的壳寡糖。核磁共振对酶解产物壳寡糖的结构鉴定结果显示,所有寡糖组分的还原端均主要由两个连续的N-乙酰氨基葡萄糖组成。综上,本研究利用来源于强烈炽热球菌的几丁质酶制备了还原末端结构确定的低脱乙酰度壳寡糖,为复杂结构壳寡糖结构与功能关系研究提供了理论支持。     

毕赤酵母表达解淀粉芽孢杆菌壳聚糖酶及其水解制备可控结构壳寡糖

优化并全合成解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）壳聚糖酶编码基因并在毕赤酵母（Pichia pastoris）中实现分泌表达,表达产物的蛋白质量浓度达到0.23 mg/mL。壳聚糖水解酶的最适pH值为5.0,最适温度为45 ℃,比活力达52.2 U/mL。该酶在50 ℃以下较稳定。利用该酶水解低脱乙酰度壳聚糖并对产物进行了组成及结构分析。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析结果显示,酶解产物中包含聚合度3～15、不同脱乙酰度的壳寡糖。核磁共振鉴定结果显示,壳寡糖组分的还原末端及非还原末端均主要由氨基葡萄糖组成。综上,本研究高效表达了来源于解淀粉芽孢杆菌的壳聚糖酶,并制备了确定末端结构的壳寡糖,为壳寡糖的结构与功能关系研究提供理论支持。     

纤维素酶中双功能酶水解壳聚糖作用方式的研究

采用HPLC、HPLC-MS及TLC等方法,研究了从纤维素酶中分离得到的既具有纤维素酶活又具有壳聚糖酶活———双功能酶的水解壳聚糖的专一性。通过对氨基低聚糖(GlcN)n、乙酰氨基低聚糖(GlcNAc)n标样及壳聚糖的双功能酶水解进程及水解产物分析,表明该双功能酶能水解(GlcN)n,而不能水解(GlcNAc)n,即它能水解GlcN-GlcN之间的-β1,4糖苷键,但不能水解GlcNAc-GlcNAc之间的糖苷键。不同脱乙酰度壳聚糖经酶水解,其产物大部分为单糖,壳聚糖脱乙酰度(DD)对水解反应产物的形成和反应速率影响较小,表明该酶也可作用于GlcN-GlcNAc之间的-β1,4糖苷键。运用Time-Course分析法对双功能酶水解壳四糖(GlcN)4的进程进行分析,表明其作用方式为外切,推测此双功能酶为一外切氨基葡萄糖苷酶。     

壳聚糖酶解产物的功能研究

为了了解壳聚糖酶解产物的组分及功能,利用蜡状芽孢杆菌发酵所得到的壳聚糖酶,经盐析,透析,蛋白质纯化等步骤精制后所得酶液,对壳聚糖商品进行酶解,进而利用液质联用分析壳聚糖酶解产物的组分,并对酶解产物抗氧化的能力,以及螯合重金属的功能进行了研究。发现利用酶法降解壳聚糖所得的酶解产物中的组分分为4部分,分别为N-乙酰氨基葡萄糖、壳二糖、壳三糖、壳四糖,除N-乙酰氨基葡萄糖外,其余均为低聚合度(2～4)的壳寡糖。壳寡糖具有抗氧化的能力,且浓度越高,抗氧化的效果越显著。壳寡糖具有螯合Zn~(2+)和Cu~(2+)的能力,主要是通过分子内的羟基、氨基和乙酰氨基三个活性官能团与Zn~(2+)和Cu~(2+)发生配位反应。     

低聚合度壳寡糖制备及其组分的色谱行为分析

利用壳聚糖酶水解壳聚糖,再通过乙醇沉淀法制备低聚合度(Dp＜6)的壳寡糖.利用Shodex NH2P-50 4E色谱柱,以乙腈-氨水为流动相梯度洗脱,建立了一种分离度好、灵敏度高的壳寡糖HPLC分析方法;利用UPLC-MS定性鉴定壳寡糖中N-乙酰化的组分.研究还探讨了壳寡糖组分的色谱行为,发现壳寡糖的N-乙酰化是导致壳寡糖不按照聚合度大小进行色谱分离的主要原因,为壳寡糖质量分析、组分分离提供了依据.     

南极磷虾壳聚糖、壳寡糖的制备与品质鉴定

本研究以南极磷虾壳为原料,制备较高品质的壳聚糖与壳寡糖,并对二者的品质进行鉴定。南极磷虾壳经脱钙、脱蛋白处理,探索脱乙酰反应条件（碱溶液浓度、反应温度与反应时间）,制备具有较高脱乙酰度的南极磷虾壳聚糖,并对壳聚糖的理化指标进行鉴定;探索酶法降解条件（壳聚糖酶添加量、酶解时间）,制备较高纯度的南极磷虾壳寡糖,并对壳寡糖的结构特征进行鉴定。结果表明,使用60%的氢氧化钠于110 ℃脱乙酰处理4 h制备的南极磷虾壳聚糖脱乙酰度为85.74%,粘均分子量为 305.65 kDa,水分含量4.66%,灰分含量0.98%,酸不溶物含量0.40%,各项理化指标均符合食品级壳聚糖的要求;使用壳聚糖酶水解南极磷虾壳聚糖制备壳寡糖,在壳聚糖酶添加量为0.2% （m/V）,酶解16 h条件下,南极磷虾壳寡糖产品得率为46.0%,红外光谱与NMR谱图显示了表征壳寡糖结构的全部特征峰,质谱结果显示南极磷虾壳寡糖主要由二糖(GlcN)₂、三糖(GlcN)₂-GlcNAc与四糖(GlcN)₃-GlcNAc构成。本研究通过制备较高品质的壳聚糖与壳寡糖,为南极磷虾壳的高值综合利用与南极磷虾新产品开发提供了技术支持。     

抗真菌内切几丁质酶酶学性质及制备低聚壳寡糖功能分析

为开发几丁质及壳聚糖生物转化活性寡聚糖并实现几丁质酶在食品防腐及生防方面的应用,从金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)XZ-Sa62中分离纯化几丁质酶(ChiA-Sa62),并研究其生物转化及抗菌功能。本实验采用Q-Sepharose Fast Flow、Sephadex G-100层析和反相高效液相色谱纯化ChiA-Sa62,经纯化后ChiA-Sa62纯化倍数为41.3倍,比活力为1 119.8 U/mg。并采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱测得ChiA-Sa62是分子质量为62.55 kDa的单亚基蛋白。ChiA-Sa62在50℃和pH 5.0的条件下,活性最高,并在60℃以下及pH 3.0～9.0范围内有良好稳定性。金属盐离子Ca²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺和Co²⁺可激活酶活性。ChiA-Sa62对几丁质及脱乙酰度75%的壳聚糖具有专一内切水解活性,薄层色谱显示,水解产物分别为2～5个N-乙酰氨基葡萄糖单位的几丁寡糖和2～4个D...     

苯胺柱前衍生麦芽糊精的高效液相色谱-电喷雾质谱分析

研究苯胺柱前衍生寡糖混合物麦芽糊精的高效液相色谱-电喷雾质谱分析方法。优化色谱及质谱分析的条件,采用反相C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);乙腈和乙酸铵溶液(pH4.5、10mmol/L)为流动相进行梯度洗脱;在239nm波长处检测,并采用高效液相色谱-电喷雾质谱联用技术对寡糖衍生物进行分析,建立苯胺衍生寡糖的高效液相色谱(HPLC)分离分析、电喷雾质谱(ESI-MS)及液相色谱-电喷雾质谱联用(LC-ESI-MS)组分分析方法。在液质联用条件下,麦芽糊精衍生物分离效果良好。该方法衍生化产物稳定,后处理简单,在食品体系寡糖混合物分离分析方面有潜在的应用前景。     

壳聚糖氧化降解制备聚合度6以下的壳寡糖

壳寡糖是壳聚糖经降解后的低聚物,其相对分子质量较小,水溶性好,易于吸收,生物活性高。本实验采用过氧化氢氧化降解脱乙酰度高于95%的壳聚糖,利用离子色谱-脉冲安培法对低聚合度的壳寡糖进行定性和定量分析,以制备聚合度在6以下的壳寡糖。以降解产物的离子色谱中聚合度6以下的峰面积和与产物得率之积作为响应指标,并结合凝胶渗透色谱来考察过氧化氢浓度、反应时间、反应温度对壳聚糖降解的影响及降解特性,并利用响应面分析法对氧化条件进行优化。研究结果表明,采用离子色谱测定聚合度6以下的壳寡糖在方法学上是可行的,具有良好的精密度、稳定性和重现性。得到的最佳降解工艺条件为:过氧化氢浓度4.50%、反应时间6 h、反应温度56℃。由最优条件下的降解产物离子色谱图可知,聚合度越低的壳寡糖越容易得到;可利用离子色谱法对壳聚糖的降解过程进行调控。     

过氧化氢制备壳寡糖的工艺

为了简便高效的制备出壳寡糖,采用过氧化氢(质量分数1.0%)来降解稀醋酸溶液(质量分数1.0%)中含量为3.5%的壳聚糖,60℃下摇床反应4.5h后得到壳寡糖水溶液,检测溶液中还原性端基数并估算降解物平均聚合度来表征降解程度。降解液浓缩到25%,调pH7.0,用体积分数95%乙醇分级沉淀分离壳寡糖可以除掉部分单糖,总的回收率达93.0%。通过电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析,3倍醇沉出的产物为2-4糖为主的壳寡糖产品。实验说明过氧化氢氧化降解壳聚糖可制取聚合度为2-4的壳寡糖。     

远东拟沙丁鱼黄嘌呤氧化酶抑制肽的制备及其降尿酸活性的研究

为了从远东拟沙丁鱼肉酶解物中制备黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XO)抑制肽并研究其降尿酸活性,该研究以远东拟沙丁鱼肉为原料,XO抑制率为考察指标,采用碱性蛋白酶水解远东拟沙丁鱼肉,产生的酶解物通过超滤与凝胶色谱、反相高效液相色谱(reversed phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC)分离纯化,从中分离出2个XO抑制肽,它们的氨基酸序列采用超高效液相四级杆飞行时间串联质谱(ultra-high performance liquid chromatography quadrupole time of flight tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)鉴定为苯丙氨酸-亮氨酸-精氨酸(Phe-Leu-Arg, FLR)与精氨酸-脯氨酸-赖氨酸(Arg-Pro-Lys, RPK)。采用腺苷及XO联合诱导人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2)构建高尿酸细胞模型,对2个肽的降尿酸功效进行评价,结果显示FLR、RPK具有显著降尿酸作用。     

黑果枸杞花青素类型、含量及结构分析研究

研究高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)检测黑果枸杞中花青素含量的最佳方法,采用高效液相色谱-串联质谱(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,HPLC-MS)分析黑枸杞中的花色苷结构。以超声波辅助提取获得的花青素粉末作为样品,对影响检测结果的样品水解时间,液相流速等因素进行研究,并采用高效液相色谱-串联质谱检测花青素。确定水解液比例为乙醇:水:盐酸=3:2:1(体积比),水解液中HCl浓度为3.0 mol/L,水解时间1 h,流速为0.7 mL/min时,液相检测效果较好。结果表明,黑果枸杞中飞燕草素、矢车菊素、矮牵牛素和锦葵素的浓度分别为2.32、15.44、35.18、2.63μg/mL。通过试验确定高效液相色谱法的最佳检测条件,确定黑果枸杞花青素的含量;并对黑果枸杞花青素进行一定的结构分析,得到较好的结果,并检测出14种花色苷成分。     

壳寡糖及其相关衍生物对幽门螺旋杆菌的抑菌作用

采用打孔方法研究以壳寡糖为代表的益生元对于幽门螺旋杆菌的抑制作用。试验结果显示:不同浓度的壳聚糖、羧甲基壳聚糖未产生抑菌环。壳寡糖B(脱乙酰度为94%)在质量浓度为50 mg/mL的条件下,所形成的抑菌环半径为(4.1±0.23)mm。在质量浓度为10 mg/mL的阳性对照(甲硝唑)条件下,所形成的抑菌环半径为(5.5±0.15)mm。高脱乙酰度的壳寡糖B(50 mg/mL)与幽门螺旋杆菌共培养后导致菌体生物积累量下降,而壳寡糖A(50 mg/mL)对其生长无明显影响。质量浓度为50 mg/mL的高脱乙酰度壳寡糖B具有抑制幽门螺旋杆菌的作用,而壳寡糖A(脱乙酰度为80%)、壳聚糖和羧甲基壳聚糖不具有抑制幽门螺旋杆菌的作用。     

壳聚糖及其衍生物清除羟自由基的能力

目的 研究壳聚糖及其衍生物壳寡糖、羧甲基壳聚糖(CM-chitosan)、N-乙酰氨基葡糖,氨基葡糖盐酸盐体外清除羟自由基的能力.方法 采用邻二氮菲-Fe2+氧化法.结果在实验设置的浓度范围内,清除羟自由基的能力依次为壳寡糖>壳聚糖>N-乙酰氨基葡糖>氨基葡糖盐酸盐>羧甲基壳聚糖,清除能力均随浓度增加而增大.以0.32 mg/mL壳寡糖的清除率最大,达到97.81%,相当于0.64 mmol/L抗坏血酸清除羟自由基的能力.结论 本实验为开发壳聚糖及其衍生物作为抗氧化能力较强的食品和药品奠定了一定基础.     

壳聚糖及其衍生物清除羟自由基的能力

目的 研究壳聚糖及其衍生物壳寡糖、羧甲基壳聚糖(CM-chitosan)、N-乙酰氨基葡糖,氨基葡糖盐酸盐体外清除羟自由基的能力.方法 采用邻二氮菲-Fe2 氧化法.结果在实验设置的浓度范围内,清除羟自由基的能力依次为壳寡糖>壳聚糖>N-乙酰氨基葡糖>氨基葡糖盐酸盐>羧甲基壳聚糖,清除能力均随浓度增加而增大.以0.32 mg/mL壳寡糖的清除率最大,达到97.81%,相当于0.64 mmol/L抗坏血酸清除羟自由基的能力.结论 本实验为开发壳聚糖及其衍生物作为抗氧化能力较强的食品和药品奠定了一定基础.     

文蛤酶解产物的抗氧化活性评价及其组成分析

比较不同分子质量分布的文蛤酶解产物的抗氧化活性,分析小分子酶解组分(enzymatic hydrolysate components with low molecular weight,LMEC)的组成。通过蛋白酶种类的筛选确定文蛤软体酶解工艺,以总还原力与多种自由基清除能力表征各酶解组分的抗氧化活性,采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)与高效液相色谱(high-performance liquid chromatography,HPLC)分析LMEC分子质量,采用超高压液相色谱-质谱联用技术(ultra-performance liquid chromatography and mass spectrometry,UPLC-MS)分析LMEC的肽段组成。建立了以风味蛋白酶与中性蛋白酶双酶酶解获取文蛤软体酶解物的稳定工艺流程,LMEC具有较好的抗氧化活性,其总还原力为54. 16%,羟自由基、DPPH自由基及超氧阴离子清除率最大分别为53. 5%、49%、47. 7%。LMEC含有79%蛋白肽类,平均分子质量1. 05 k Da,富含Ala、Thr、Val、Leu、Pro、Glu等氨基酸,推测了6种可能的肽段组成。该研究为文蛤抗氧化活性提供理论依据,也为后续活性肽的分离提供参考方向。     

壳寡糖的制备及应用研究

壳寡糖是壳聚糖通过物理、化学或酶水解法脱乙酰解聚而得到的降解产物。与壳聚糖和甲壳素相比,壳寡糖具有较低的分子量、较高的脱乙酰度、黏度低、溶解性高、胃肠道易吸收、可生物降解性、生物相容性等优点。文章对壳寡糖的不同制备方法进行了比较,阐述了壳寡糖在食品、农业、畜牧业以及人类健康、日化品等各个领域的研究与应用,并对壳寡糖的未来应用和研究方向进行了展望。     

黑葵花籽壳中主要花色苷类物质的结构分析

为确定黑葵花籽壳中主要花色苷类物质的结构,采用高效液相色谱(HPLC)和高效液相色谱串联四极杆质谱研究黑葵花籽壳中的花色苷类物质,结果表明：纯化后的黑葵花籽壳花色苷主要有两种单体,之后采用纸层析对两种物质进行分离,再用红外光谱、紫外-可见光谱、Francis的研究结论等方法对两种单体结构初步推测。最后采用高效液相色谱串联四极杆质谱对两种花色苷结构确认为：花青素-3-O-单葡萄糖苷和甲基花青素-3-O-单葡萄糖苷两种单体。     

液相色谱-串联质谱法检测蜂蜜中氨苯砜及其代谢产物残留量

目的建立液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC–MS/MS)检测蜂蜜中氨苯砜及其代谢产物N-乙酰氨苯砜的分析。方法样品经磷酸盐缓冲液(pH=9)提取,经OasisHLB固相萃取小柱净化,富集后采用液相色谱-电喷雾质谱进行检测,以正离子多反应监测模式测定,同位素内标法定量。结果氨苯砜及其代谢物产物的线性范围为0.5～50 ng/mL,加标回收率为90.0%～110.0%,相对标准偏差小于10.0%(n=6);方法检出限为0.1μg/kg,定量限为0.5μg/kg。结论该方法快速、准确、灵敏,适合用于蜂蜜中氨苯砜及其代谢物N-乙酰氨苯砜残留的确证检测。     

高效液相色谱-串联质谱法测定母乳中的 N-乙酰神经氨酸

目的建立高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法测定母乳中N-乙酰神经氨酸的分析方法。方法用盐酸对样品进行酸水解释放出母乳中的结合态N-乙酰神经氨酸,高速离心后,采用C_(18)柱进行分离。以0.1%甲酸-乙腈溶液和0.1%甲酸-水溶液作为流动相进行梯度洗脱,电喷雾质谱检测,正离子多反应监测模式(MRM)进行定性和定量分析。结果在优化的条件下,N-乙酰神经氨酸在0.01~0.5 mg/L范围线性关系良好(r=0.9997)。以10、50、100 mg/kg 3个添加水平进行加标回收试验,N-乙酰神经氨酸的平均回收率为95.0%~98.7%,相对标准偏差为11.6%~14.5%,N-乙酰神经氨酸的检出限为0.21μg/kg。结论该方法简单、快速、重复性好、灵敏度高,可广泛用于母乳中N-乙酰神经氨酸的测定。