大豆主要过敏原β-伴大豆球蛋白α亚基的分段及克隆载体的构建

利用生物信息学软件将大豆主要过敏原β-伴大豆球蛋白α亚基分为相互重叠的4个片段(A、B、C、D),设计和合成系列引物。利用PCR技术分别扩增β-伴大豆球蛋白α亚基Overlapping分段基因,将其插入到p MD-18T vector中,对重组质粒进行PCR和双酶切鉴定,测序结果与设计基因序列一致,成功构建了克隆载体。为研究β-伴大豆球蛋白α亚基的分段表达及抗原表位的筛选提供参考。     

酶解法专一性去除大豆7S球蛋白中的α-亚基

GlymBd30k、GlymBd28k和β-伴大豆球蛋白(7S球蛋白)的α-亚基(MW68k)是大豆中的主要致敏蛋白。7S球蛋白的3个主要亚基极易同时被酶水解,主要采用分离和酶解两步工艺专一性去除大豆7S球蛋白中的α-亚基,这为大豆蛋白的脱敏提供新的思路。     

大豆主要过敏原β-伴大豆球蛋白β亚基的抗原表位分析及分段克隆

利用生物信息学软件SWISS-MODEL对大豆主要过敏原β-伴大豆球蛋白β亚基建立出三级结构模型,并根据Disco Tope 2.0服务器预测出该模型的构象表位相关区段,采用分段克隆方式扩增目的基因的3个片段区域,利用PCR技术扩增目的基因全长及3个互相重叠的片段(A、B、C)将其连接至p MD18-T载体,并转化到大肠杆菌感受态JM109。经蓝白斑筛选,以及对重组质粒进行PCR和双酶切验证,测序结果与设计的基因序列一致,成功得到了目的基因片段的阳性克隆子,为β-伴大豆球蛋白β亚基分段表达及抗原区域位置的筛选与鉴定提供参考。     

处理方法对大豆致敏蛋白的影响

Gly m Bd 30K、Gly m Bd28K和β-伴大豆球蛋白的α亚基(MW68K)是大豆中的主要致敏蛋白，本文对经过不同处理的大豆进行SDS-PAGE电泳，结果显示，结合盐析和pH值处理可以有效去除Gly m Bd 30K和Glym Bd28K，但要同时去除三种致敏蛋白还需进一步研究。     

加热联合酶解大豆7S蛋白的分子结构及抗原性研究

选用不同加热预处理条件、不同蛋白酶处理大豆7S蛋白,SDS-PAGE考察酶解后大豆7S蛋白的降解情况,间接竞争ELISA法考察酶解物的抗原性。结果表明:加热预处理联合酶解可显著增大β-伴大豆球蛋白的降解程度,β亚基消化程度得到极大提升,α亚基、α'亚基几乎完全被降解,在相同酶解时间下,胰蛋白酶的酶解速度快于胃蛋白酶;加热预处理联合酶解大幅降低了β-伴大豆球蛋白的抗原性,胰蛋白酶的效果优于胃蛋白酶,经80℃加热10 min预处理再经胰蛋白酶处理,大豆7S蛋白的抗原性降低了79.99%,而胃蛋白酶最优条件下最多仅降低50.4%; SDSPAGE结果表明,胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解物中出现了抗消化肽段,经过质谱鉴定,均来自于β-伴大豆球蛋白的α亚基。     

大豆过敏原在低盐固态酱油酿造过程中的降解规律

为研发低致敏酱油,探究了低盐固态酱油酿造过程中大豆蛋白致敏原的变化规律。在建立实验室的模拟低盐固态酱油酿造的基础上,采集大豆未经处理、高压灭菌(121 ℃,8 min)、制曲阶段(44 h)、发酵阶段(30 d)、灭菌前和灭菌后等样品,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)测定酿造过程中蛋白的组成变化,用兔抗大豆多克隆抗体进行酶联免疫试验和免疫印迹实验分析发酵过程中大豆致敏原抗原性变化,用过敏病人血清进行酶联免疫试验测定大豆致敏原过敏原性变化。结果表明,经高压蒸煮、制曲、发酵和加热灭菌后,原料中的大豆蛋白条带减少或消失,其中制曲变化的最大。β-伴大豆球蛋白的α、α'亚基和大豆球蛋白的酸性亚基分别在制曲阶段开始降解,β-伴大豆球蛋白的β亚基及大豆球蛋白酸性亚基在制曲之后消失,大豆球蛋白的碱性亚基在整个酿造阶段变化不大。免疫印迹结果显示相同的结果,酿造过程中大豆过敏原的过敏性和抗原性逐渐降低,在发酵30 d后的生酱油中仍能在检测到大豆球蛋白,在灭菌后也没有完全降解,但是这些残留的大豆致敏原没有检测到IgE结合能力。酶联免疫试验结果表明,和原材料大豆相比,样品中的抗原性在经过4个酿造阶段高压蒸煮、制曲、发酵和加热灭菌之后分别下降了8.13%、39.00%、69.10%和87.06%,过敏原性分别下降了8.92%、71.66%、92.26%、98.45%。在酱油酿造过程中大豆致敏原逐步降解,制曲阶段对大豆致敏原的降解最大。酱油中仍残留有大豆球蛋白,但是没有检测残留蛋白的致敏性。     

碱性蛋白酶水解对豆粕中大豆抗原蛋白的影响

大豆是八大食物过敏源之一,其中主要蛋白成分7S和11S球蛋白也是致敏性较强的抗原蛋白。本试验研究了豆粕在Alcalase酶水解过程中7S和11S两种大豆抗原蛋白的变化。结果表明,酶解10 min时7S伴球蛋白的α’、α和β亚基、酶解60 min时11S球蛋白的酸性亚基等主要抗原蛋白成分即被完全水解,同时新产生了23 ku和大量14 ku以下组分;酶解豆粕中95.1%的蛋白可溶于水,其中68.1%蛋白质可溶于三氯乙酸。     

β-伴大豆球蛋白糖基化产物的致敏性研究

为探究食品热加工过程中糖基化产物对蛋白质致敏性的影响,该文模拟3种不同加工条件,制备β-伴大豆球蛋白的糖基化产物,利用β-伴大豆球蛋白致敏模型,对糖基化产物的致敏性进行评价,并探讨β-伴大豆球蛋白结构变化与致敏性的关系。检测小鼠过敏症状评分、体重、免疫球蛋白E（immunoglobulin E,IgE）、组胺、类胰蛋白酶以及接枝度、内源荧光性和二级结构。结果表明,与低温糖基化产物和蒸煮糖基化产物相比,高压灭菌糖基化产物的结构变化最显著,引起小鼠致敏反应最弱。     

大豆中β-伴球蛋白的分离与纯化

从大豆中分离制备β—伴球蛋白，对通过电泳进行分析鉴定。采用分级盐析(70％～90％)和凝胶过滤(sepharose 6B)分离纯化大豆中的β—伴球蛋白。免疫电泳的结果证实所提取的β—伴球蛋白纯度很高，大豆中的其它成分与β—伴球蛋白抗血清无交叉免疫反应。SDS—PAGE的结果表明本实验所提取的β—伴球蛋白是由不同形式单体组成的复合物，共有6种亚基。     

微生物发酵对豆粕抗原性的影响

探讨了微生物发酵对豆粕抗原性的影响。选用植物乳杆菌、干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和米曲霉这5种菌株,在液态和固态条件下分别发酵豆粕12 h,对发酵产物进行抗原性测定。结果表明:豆粕经这5种菌株发酵后,粗蛋白含量均有所提高,其中枯草芽孢杆菌在固态发酵时降解豆粕抗原蛋白和降低豆粕抗原性的效果优于其它菌株,此时,豆粕蛋白水解度为4.89%,必需氨基酸含量为193.51mg/g。SDS-PAGE显示发酵豆粕中β-伴大豆球蛋白的α’和α亚基消失,β亚基条带和大豆球蛋白的酸性亚基条带密度减弱,同时大豆球蛋白与β-伴大豆球蛋白的抗原性降低率分别为20.62%和50.12%。     

β-伴大豆球蛋白多克隆抗体的制备及纯化前后免疫学特性鉴定

以β-伴大豆球蛋白免疫新西兰兔,制备抗β-伴大豆球蛋白多克隆抗体。利用正辛酸-硫酸铵沉淀法纯化多抗血清,并分析纯化前后多抗血清蛋白含量、纯度、效价、敏感性及特异性。结果表明,经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析纯化后血清纯度得到提高;间接ELISA法检测多抗血清效价及敏感性无明显变化;与大豆Gly m Bd 28K蛋白和花生蛋白的交叉反应率分别由25.28%、1.16%降至为0.79%、0.2%。制得的抗β-伴大豆球蛋白多克隆抗体特异性高。为β-伴大豆球蛋白致敏蛋白的检测,和大豆β-伴大豆球蛋白致敏亚分子结构的定位奠定了基础。     

大豆过敏原β-伴大豆球蛋白提取纯化工艺研究

大豆蛋白具有丰富的营养价值,而其致敏性却给大豆敏感人群带来了极大的危害。其中7S伴大豆球蛋白是一种主要过敏原。本实验采用碱溶酸沉法从大豆中分离纯化出β-伴大豆球蛋白(7S伴大豆球蛋白)。通过设置浓度、料液比、pH、提取液的单因素对比实验,研究对大豆球蛋白提取的影响,并用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对提取的7S伴大豆球蛋白进行了纯度分析。结果显示,使用pH9.0、浓度为0.10 mol/L的Tris-HCl缓冲液在料液比1︰18的条件下,7S伴大豆球蛋白提取率为47%。     

大豆蛋白结构与功能的关系

综述了基因重组技术在揭示大豆球蛋白和β-伴球蛋白的结构与功能关系方面的研究进展.通过对β-伴球蛋白组成亚基(α,α'和β)和α,α'亚基核心区域的功能性质相比较发现,亚基核心区域决定着热稳定性和表面疏水性;α,α'亚基的外延区域决定着蛋白质的溶解度和乳化能力,碳水化合物部分抑制热诱导聚集体的形成.对不同方式改性的大豆球蛋白前体(A1aB1b)的功能性质研究表明,影响凝胶和乳化性能的结构因素明显不同,蛋白C-末端区域的疏水性影响其乳化能力的高低,而游离SH基团的拓扑学结构则与热诱导凝胶的形成有着密切的关系.     

大豆蛋白酶解过程中聚集行为的研究

主要研究了大豆β-伴球蛋白对大豆球蛋白酶解过程聚集行为的影响。在相同蛋白浓度下使用Alcalase进行酶解时,与β-伴球蛋白、大豆分离蛋白相比,大豆球蛋白聚集现象较为明显,这说明大豆蛋白酶解过程的聚集与蛋白种类有关;改变β-伴球蛋白对大豆球蛋白的添加量进行酶解时发现,β-伴球蛋白添加量越大,大豆球蛋白酶解过程的聚集程度越小,这说明β-伴球蛋白对大豆球蛋白的酶解过程的聚集有抑制作用。高效液相和SDS-PAGE结果表明上清液的分子质量大于聚集物的分子质量,聚集体主要是由分子质量小于5 ku的肽段聚集而成。     

大豆致敏蛋白的识别

我国是大豆的种植大国，但对大豆致敏蛋白的识别却一直没有进行过，本文就是利用大豆过敏患者的血清识别不同品种大豆致敏蛋白的组成，除已被发现的7S(β-伴大豆球蛋白)外，还识别到一种分子量85．3kDa的强致敏蛋白，同时发现，品种间的差异蛋白都有可能成为新的致敏蛋白。     

大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白对酶促聚集的影响

报道了大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白对酶促聚集的影响.两组分的枯草杆菌蛋白酶水解液均有聚集现象,但对大豆蛋白酶促聚集的贡献不同,其中α-伴大豆球蛋白对大豆蛋白酶促聚集的贡献较大,而大豆球蛋白对聚集过程的贡献较小,这主要是由于酶对大豆球蛋白的水解程度较低.     

β-伴大豆球蛋白天然活性亚基的分离纯化

本研究将离子交换层析和金属螯合亲和层析方法相结合,建立了系统的分离纯化β-伴大豆球蛋白天然状态亚基的方法,通过梯度脲透析复性,使纯化亚基恢复天然构象。利用β-伴大豆球蛋白免疫动物制备抗血清对纯化亚基的免疫活性进行检测。结果表明：离子交换层析结合金属螯合亲和层析方法可以有效地纯化β-伴大豆球蛋白的α、α＇和β亚基,该方法产率高,制备的亚基纯度好,而且能与抗β伴大豆球蛋白血清特异性结合,表明提纯的亚基具有免疫活性。     

超声预处理对大豆蛋白酶解物结构及抗氧化活性的影响

为充分利用大豆蛋白资源,在大豆球蛋白（11S）和β-伴大豆球蛋白（7S）酶水解前进行超声预处理,通 过荧光光谱、傅里叶变换红外光谱和紫外-可见吸收光谱分析超声预处理后大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的 空间构象变化。结果表明：大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物二级、三级结构发生改变,α-螺旋和β-转角结构含 量明显升高,无规卷曲和β-折叠结构含量明显降低,随着酶解效率提高,酶解物水解度显著增加（P＜0.05）。对 超声处理大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物进行还原能力、羟自由基清除率和Fe2＋螯合能力测定。结果表明：超 声预处理后大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解物的还原能力、羟自由基清除率和Fe2＋螯合能力明显增强。综上,超 声预处理能够有效提高大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解效率和抗氧化活性。本研究结果可为制备高品质改性大豆 蛋白提供技术参考和理论依据。     

脱脂豆粕预处理对大豆β-伴球蛋白结构的影响

采用新鲜低温脱脂豆粕、干热处理脱脂豆粕和溶剂浸提脱脂豆粕为原料制备大豆β-伴球蛋白,研究低温脱脂豆粕预处理对制备大豆β-伴球蛋白结构的影响。新鲜低温脱脂豆粕制备大豆β-伴球蛋白羰基、游离巯基和总巯基含量分别为2.93 nmol/mg、1.39nmol/mg和11.87 nmol/mg,干热处理脱脂豆粕制备大豆β-伴球蛋白羰基、游离巯基和总巯基含量分别为5.24 nmol/mg、0.41 nmol/mg和5.42 nmol/mg,溶剂浸提脱脂豆粕制备大豆β-伴球蛋白羰基、游离巯基和总巯基含量分别为1.85 nmol/mg、1.93 nmol/mg和15.64nmol/mg,表明干热处理脱脂豆粕增加制备大豆β-伴球蛋白氧化程度,溶剂浸提脱脂豆粕降低制备大豆β-伴球蛋白氧化程度。随着蛋白质氧化程度的增加,大豆β-伴球蛋白二级结构中α-螺旋和β-折叠含量、表面疏水性和内源荧光强度下降,内源荧光最大吸收峰发生蓝移,并且伴随着蛋白质聚集体的出现,表明蛋白质氧化使得大豆β-伴球蛋白聚集。     

大豆发芽过程中抗原蛋白降解及营养特性变化

研究大豆发芽过程中抗原蛋白降解、抗原活性和营养成分的变化规律。结果表明,发芽期间,大豆子叶组织结构变得疏松;主要抗原蛋白β-伴球蛋白的α′-和α-亚基降解较快,而β-亚基降解缓慢。大豆11S球蛋白的酸性链降解快,而碱性肽链降解慢。ELISA分析表明,在发芽的前4 d中,β-伴球蛋白和11S球蛋白的抗原活性剩余率分别为58%和76%,延长发芽时间抗原活性降低较小。整个发芽期间,必需氨基酸和总氨基酸含量变化不大,但天冬氨酸含量显著增加,谷氨酸的含量明显降低。抗坏血酸含量在发芽第3 d时达到最大值,延长发芽时间,其含量降低。综上可知,在发芽4 d时大豆的食用安全性和营养价值较为理想。