离子液体双水相提取木瓜蛋白酶及条件优化

采用[C4mim]Br/K2HPO4双水相体系提取木瓜蛋白酶。首先考察各成相试剂对木瓜蛋白酶活性的影响,其次考察了离子液体侧烷基链长度、离子液体浓度、酶添加量、pH、温度对木瓜蛋白酶分配行为的影响;并采用响应面法(CCD)优化[C4mim]Br/K2HPO4双水相萃取木瓜蛋白酶的条件。结果表明:离子液体对木瓜蛋白酶的活性影响较小,低浓度时还能促进酶活性,而无机盐对木瓜蛋白酶活性的影响较大;高温不利于离子液体双水相萃取木瓜蛋白酶;各因素对木瓜蛋白酶萃取的影响从大到小依次为K2HPO4的浓度、[C4mim]Br的浓度、酶添加量、pH。响应面优化得到的最佳萃取条件:0.30 g/mL的[C4mim]Br,0.30 g/mL的K2HPO4,pH 6.0,酶添加量3.0 mg/mL,温度30℃。在此条件下木瓜蛋白酶的酶活性回收率达到91.20%,纯化因子可以达到1.73。为该体系的放大实验或规模化生产提供理论指导。     

离子液体双水相体系分离辣木叶凝乳酶

采用[C_4mim]Br/K_2HPO_4双水相抽提技术从辣木叶蛋白中分离凝乳酶,研究双水相参数[C_4mim]Br浓度、K_2HPO_4浓度、粗酶浓度、体系pH对凝乳酶活力和分离效果的影响,并与传统的硫酸铵三步盐析法相比较。结果表明:1.3 g/mL的[C_4mim]Br,2.2 g/mL的K_2HPO_4,粗酶添加量为20 mg/mL,pH7.5可达最佳凝乳酶萃取效果,此条件下辣木叶凝乳酶的酶活性回收率达到85.5%,纯化因子达1.49。与三步盐析法相比,较强的疏水相互作用提高了酶的分离效果,且分离步骤少可有效降低酶活力损失。根据电泳结果,分相后的辣木叶凝乳酶分子量为(55~60)ku存在于上层的富离子液体相,部分杂蛋白的分子量为(25~40)ku保持在富盐底部。     

响应面法优化离子液体双水相萃取木瓜蛋白酶

采用1-乙基/丁基/戊基/辛基-3-甲基咪唑醋酸盐{[C_nmim]Ac(n=2,4,6,8)}与K_2HPO4离子液体双水相体系对木瓜蛋白酶进行萃取分离。用浊点法测定双水相体系的双节线并采用Merchuk方程对数据进行拟合。考察各成相试剂及pH值对木瓜蛋白酶分配行为的影响,利用单因素试验和响应面法确定其离子液体双水相最佳萃取条件为:离子液体[C_8mim]Ac浓度为28.03%,K_2HPO_4浓度为20.08%,pH值为8.55。在该条件下,分配系数可达到11.65。     

盐析法联合离子液体双水相纯化木瓜蛋白酶

本实验以海南产番木瓜为研究对象,采取盐析法联合离子液体双水相对其富含的木瓜蛋白酶进行提取纯化。以不同饱和度的(NH4)2SO4对粗酶液进行盐析,通过实验结果分析,确定了以饱和度分别为20%和45%的两步盐析法的最佳条件。然后再进行双水相萃取,通过单因素试验结果设计3因素3水平的响应面试验,优化双水相萃取条件为离子液体[C4mim]N(CN)2质量分数29.76%、(NH4)2SO4质量分数16.08%、pH?8.18,在此最优条件下木瓜蛋白酶萃取率为89.01%,酶活力回收率为86.72%,所得到木瓜蛋白酶比活力为1?056?U/mg,纯化倍数达到9.6?倍。然后对实验产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,经纯化的酶中杂条带明显减少,验证了分离纯化的效果。     

基于氨基功能化离子液体萃取番茄中超氧化物歧化酶

本实验利用新型绿色化学功能溶剂离子液体与无机盐形成的双水相体系对番茄中的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）进行萃取,考察离子液体的种类和质量浓度、K2HPO4的质量浓度、萃取温度及萃取时间对SOD活力的影响。通过单因素试验及响应面优化试验得到的最佳萃取条件为[(H2NC2)Mim]Br质量浓度0.40 g/mL、K2HPO4质量浓度0.60 g/mL、萃取温度35 ℃、萃取时间25 min,在该条件下萃取得到的SOD活力为345.68 U/g。与传统的缓冲液法及[C4Mim]Br/K2HPO4双水相法相比,本实验所用方法提高了萃取酶的活性且标准偏差更小。本实验为果蔬中蛋白酶类物质的萃取提供了新的实验思路。     

新型离子液体亲和萃取鸡蛋清中的溶菌酶

建立并优化利用辛巴蓝(Cibacron Blue F-3GA,CB)修饰[C₄MIM]Cl的新型离子液体[C₄MIM]₃CB特异性萃取分离鸡蛋清中溶菌酶的方法,并采用AutoDock Vina分析[C₄MIM]₃CB与蛋白的结合能,研究溶菌酶与[C₄MIM]₃CB相结合的能力。通过亲和萃取和反萃取并进一步脱盐、浓缩、冷冻干燥,得到溶菌酶产品。结果表明,通过对影响因素的研究,优化出最佳的萃取分离条件:蛋清粉溶液pH为7,新型离子液体中[C₄MIM]₃[CB]浓度为8 mg/mL,反应震荡时间为15 min,反萃取KCl溶液pH为7.0,浓度为1.5 mol/L。最终250 mg蛋清粉可得12.3 mg的溶菌酶产品,纯度为97.56%,酶活力为35000 U/mg,纯化倍数达到37.39,酶活回收率89.74%,且与其他蛋白达到完全分离。该方法具有选择性高、操作简便、产物纯度和活性高等优点。     

PEG/Na_2SO_4双水相萃取木瓜蛋白酶的研究

采用聚乙二醇(PEG)/硫酸钠(Na2SO4)双水相体系对木瓜蛋白酶进行分离提取。考察各成相试剂及pH对木瓜蛋白酶活性的影响,研究体系中不同相对分子量PEG、硫酸钠和PEG的质量分数、pH、酶添加量等因素对木瓜蛋白酶在两相体系中分配行为的影响,采用响应面法优化双水相萃取木瓜蛋白酶的最佳分离条件,并进行了实验室规模的放大。结果表明:Na2SO4的质量分数对分配行为的影响极显著,其次是PEG的质量分数,pH对分配行为的影响不显著。当两相体系中PEG的相对分子量为6000,质量分数为16.0%、Na2SO4质量分数为18.0%、pH7.0、酶添加量为1.0mg/g时,木瓜蛋白酶在两相体系中的分配系数最高可达3.1,可获得木瓜蛋白酶活性回收率82.6%。实验证明:响应面法优化双水相萃取木瓜蛋白酶的条件是可行的,可用于实际预测。     

反胶束固定木瓜蛋白酶的动力学研究

为了解木瓜蛋白酶在AOT/异辛烷反胶束体系中的催化行为,研究底物浓度、表面活性剂浓度、水含量ω(o)、pH值、温度、盐的浓度及种类对酶活力的影响.在单因素试验基础上,采用响应面法建立二次多项数学模型,并验证该模型的有效性.结果表明:酶作用于反胶束膜,最佳酶活力条件:含水量ω(o)为15,底物质量浓度12mg/mL,KCl浓度0.13 mol/L,温度50℃,pH 4.4,AOT质量浓度0.07 g/mL时,酶活力较高,可达720 431 U/mL.     

木瓜蛋白酶在[CnPy]Cl-K2HPO4双水相体系中相平衡数据的关联及分配模型的建立

以[C_nPy]Cl(n=2、4、6)-K_2HPO_4不同碳链长度的氯代吡啶类离子液体双水相为研究体系,利用清-浊点辅助法测定该体系的双节线及液液相平衡数据。采用Merchuk方程关联双节线,Othmer-Tobias、Bancroft方程关联液液相平衡数据。通过相关系数考察该体系上下相的氯代吡啶类离子液体浓度、上下相的K_2HPO_4浓度与蛋白浓度分配系数的相关度。结果表明:3个经验方程的拟合度分别在0.996、0.997、0.995以上,关联结果理想。木瓜蛋白酶分配系数的对数与上下相各组分浓度差的相关度均较高,故用Matlab建立其在该双水相中的分配模型,相对偏差都低于4%。相比其他同类模型,试验中建立的模型精确度提高,且能准确预测双水相中酶的分配行为。研究结果也可补充木瓜蛋白酶在双水相系统中的分配模型数据库。     

木瓜蛋白酶在金属螯合亲和双水相中分配行为的研究

利用金属螯合双水相亲和分配技术对木瓜蛋白酶的萃取进行了研究。考察了不同无机盐和浓度、PEG的分子量和浓度、亲和配基的加入量、pH、酶添加量对木瓜蛋白酶分配的影响,对不含亲和配基的双水相和含亲和配基的双水相萃取木瓜蛋白酶的效果进行比较。优化的分配条件为:质量分数17%PEG 4 000,1%PEG-IDA-Cu~(2+),18%Na_2SO_4,pH 7.0,酶添加量为2 mg/g,在此条件下,木瓜蛋白酶的酶活性回收率可达到90%左右,蛋白分配比达到5.11。结果表明,PEG 4 000/Na_2SO_4系统比PEG 4 000/(NH_4)_2SO_4系统更有利于木瓜蛋白酶亲和分配;无机盐的浓度和亲和配基的加入量是影响木瓜蛋白酶分配的关键因素;与不含亲和配基的双水相系统相比,亲和配基的加入可以提高木瓜蛋白酶在PEG相的分配,酶活性回收率和蛋白分配比可分别提高10%和2.0左右,表明金属鳌合双水相分配技术分离木瓜蛋白酶是可行的,为该体系的放大试验或规模化生产奠定了相应的试验基础。     

响应面分析法优化麦麸酯酶双水相萃取的条件

研究采用聚乙二醇/硫酸铵双水相体系萃取麦麸酯酶,通过单因素实验考察不同PEG分子量、PEG浓度、无机盐种类、无机盐浓度、pH和离子强度对麦麸酯酶总蛋白分配系数、酶活回收率、纯化倍数的影响,并通过响应面分析法优化了萃取条件。结果表明最佳萃取条件为:PEG1000质量浓度为21%、(NH4)2SO4质量浓度为18%、pH4.4。回归方程预测双水相萃取纯化倍数可达到2.9208,三次验证实验的平均纯化倍数为2.9190,与预测值相对误差为0.06%。     

响应面法优化准噶尔山楂总三萜提取工艺及其纯化工艺研究

为了提高准噶尔山楂的高值化利用,以准噶尔山楂为原料,通过单因素实验、正交试验和响应面设计优化复合酶辅助提取准噶尔山楂总三萜的工艺,并对纯化工艺进行优化。结果表明,准噶尔山楂总三萜的最优提取工艺为纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶的添加量分别为4%、4%和2%,料液比为1:24 g/mL,温度51℃,pH为4.5,酶解76 min,此条件下准噶尔山楂总三萜的提取量为（36.570±0.332）mg/g,通过超声再次提取,总三萜的提取量达到（53.782±0.673）mg/g。纯化工艺为：上样液浓度为6 mg/mL,流速：1 mL/min,上样量：15 mL,洗脱条件为50 mL,70%乙醇,纯化后的准噶尔山楂总三萜的纯度可达29.93%,回收率为81.25%。以上结果说明复合酶法对准噶尔山楂总三萜的提取和采用大孔树脂纯化具有可行性且稳定性高。     

大豆豆酪凝乳参数优化及质构的比较

以大豆为试验原料,凝乳时间、凝乳状态及乳清OD值为参考指标,对大豆豆酪生产中的凝乳工艺参数进行优化,以期获得应用不同凝固剂(木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶)生产的大豆豆酪质构特性(硬度和黏附性)的差异。通过正交试验,对凝乳最佳温度、凝固剂最佳添加量、Ca Cl2的最佳添加量进行研究和探讨,进而对采用最优工艺参数生产的2类豆酪质构特性进行差异比较。结果表明:大豆豆酪凝乳的最佳工艺参数是凝乳温度为59℃、木瓜蛋白酶添加量为0.25%(活力为600 U/mg)、Ca Cl2添加量为0.08%;凝乳温度为55℃、菠萝蛋白酶添加量为0.50%(活力为300 U/mg)、Ca Cl2 0.08%。采用木瓜蛋白酶生产的大豆豆酪硬度比用菠萝蛋白酶生产的大123 g,用菠萝蛋白酶生产的大豆豆酪黏附性比用木瓜蛋白酶生产的大7 g·s。2类豆酪在凝乳工艺参数方面的差异,表现在凝乳温度及酶添加量不同,在质构特性方面的差异,表现在硬度和黏附性的不同。     

凡纳滨对虾过敏原酶法消减技术的研究

以凡纳滨对虾为研究对象,用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶对凡纳滨对虾虾肉水解,消减其过敏原。通过间接酶联免疫吸附实验对过敏原消减情况进行检测,以492nm 波长处的OD 值为指标确定最佳水解条件。结果表明：胰蛋白酶最佳水解条件为：pH8.0、酶与底物质量比1:100、水解温度45℃、底物质量浓度5g/100mL、水解时间3h,水解物OD 值为0.085;木瓜蛋白酶最佳水解条件为pH6.5,酶与底物质量比1:100、水解温度为60℃、底物质量浓度5g/100mL、水解时间3h,水解物OD 值为0.049。     

大孔树脂固定化磷脂酶A1及其用于菜籽油脱胶工艺的优化

选择8种大孔树脂对磷脂酶A1进行固定化,结果表明,离子交换树脂D001的固定化效果最好,其优化的最佳条件为缓冲液pH5.0、酶添加量1.5mL/g、固定化时间4h,在该条件下获得的固定化酶活力为665.8U/g。将固定化酶用于菜籽油脱胶实验,经响应面优化确定最优脱胶条件为固定化酶添加量1.8g/kg、反应时间3.6h、反应温度51℃、反应pH5.5,在此条件下得到的脱胶油中磷含量为5.82mg/kg。将固定化酶重复脱胶5次后,仍保留初始酶活力的47.9%,脱胶油中磷含量为9.78mg/kg。     

产琼胶酶菌株NBRC102603发酵条件优化及酶的分离纯化

通过正交试验对产琼胶酶海洋菌株NBRC102603发酵条件进行了优化,优化得到的发酵产酶条件为:蛋白胨浓度5.0 g/L、酵母膏浓度1.25 g/L、琼胶浓度4.0 g/L、装瓶量100 mL、接种量1%、转速150 r/min,28℃下发酵48 h后酶活力达到58.94 U/mL,比未优化前提高了2.08倍。经纯化得到琼胶酶A和琼胶酶B,琼胶酶A纯化倍数为17.29倍,酶比活力为870.51 U/mg;琼胶酶B纯化倍数为16.65倍,酶比活力为838.39 U/mg。纯化后琼胶酶经SDS-PAGE检测,显示为单一条带,其相对分子质量酶A约为83.6 ku、酶B约为36.8 ku。     

双水相法萃取黑曲霉C2J6脂肪酶条件的优化

为提高黑曲霉C2J6发酵液中脂肪酶的分离纯化效率,采用PEG2000/(NH_4)_2SO_4双水相法进行萃取。探讨PEG2000质量浓度、(NH_4)_2SO_4质量浓度、p H、Na Cl质量浓度对脂肪酶萃取的影响,利用Box-Behnken响应面法优化萃取条件。结果表明:在PEG2000质量浓度35%、(NH_4)_2SO_4质量浓度21.60%、p H 6.90的条件下,脂肪酶萃取率高达85.92%,酶活力47.53 U/mL,比粗酶活力提高了3.02倍。此法简捷、高效,为黑曲霉脂肪酶的进一步纯化奠定基础。     

黄杆菌褐藻胶裂解酶的高效表达及其在褐藻寡糖制备中的应用

研究黄杆菌褐藻胶裂解酶基因(rFlAlyA)在枯草芽孢杆菌中的高效表达,高密度发酵48 h最高酶活力为2550 U/mL,蛋白质量浓度达4.5 mg/mL.经(NH4)2SO4沉淀和SP强阳离子交换柱纯化后得到电泳级纯酶,分子质量约为30 kDa.褐藻胶裂解酶rFlAlyA最适pH值为7.5,在pH 4.0～11.0范...     

离子液体双水相提取菜籽粕蛋白及其相行为的研究

用浊度法测定并绘制了30℃下亲水性离子液体1-丁基-3-甲基咪唑氯盐([Bmim] Cl)+K2 HPO4+ H2O体系的三元相图,求得的离子液体在该双水相体系中的溶解度曲线方程分别为:w([Bmim]Cl,上相)=0.026 88 +0.914 32×exp(-w(K2HPO4,上相)/0.113 39),r上相=0.999 59w([Bmim]Cl,下相)=-0.044 11 +28.974 45 ×exp(-w(K2HPO4,下相)/0.028 26)+0.289 58×exp(-w(K2HPO4,下相)/0.678 55),r下相=0.991 24.建立了由[Bmim] Cl和K2HPO4形成的双水相体系提取菜籽粕蛋白质的新方法,考察了在该离子液体双水相体系中不同离子液体及其浓度、盐浓度以及蛋白质浓度、pH对菜籽蛋白提取率的影响;并通过L16(45)正交优化试验得到了离子液体双水相提取菜籽粕蛋白质的最佳工艺条件为:K2HPO4质量浓度为150 mg/mL、[Bmim] Cl质量浓度为350 mg/mL、菜籽蛋白质量浓度为70.0 mg/L、pH值为6.8.验证试验结果表明在此最佳条件下菜籽蛋白质的提取率达到99.1％,这显示了该分离体系对提取菜籽蛋白质的独特性,为进一步的放大试验或工业化规模生产奠定了一定的试验基础.     

条斑紫菜蛋白酶解物降血压活性

研究了以条斑紫菜为原料,采用木瓜蛋白酶制备紫菜蛋白活性寡肽,以ACE抑制率为评价指标,研究不同水解条件下酶解液的降血压活性,优化酶解工艺条件并测定酶解物的分子量。优化后的木瓜蛋白酶酶解工艺条件为pH7.5,温度50℃,底物浓度30 mg/mL,酶添加量600 U/g,在此条件下,水解4 h的酶解产物抑制活性达30%以上,ACE抑制肽的半抑制浓度IC50值为4.48 mg/mL。将制备的酶解液进行层析分析,测得具有降血压活性的紫菜蛋白酶解产物是相对分子质量小于2 000的活性肽。