紫外诱变选育高耐受1,3-丙二醇的克雷伯氏杆菌

1,3-丙二醇具有许多优良的化学性质,可以作为中间体合成多种有经济价值的工业用化合物,是一种潜在的重要化工平台产品。文章以产1,3-丙二醇的肺炎克雷伯氏菌为出发菌株,通过紫外诱变筛选得到耐受1,3-丙二醇130 g/L的突变株。该突变株以甘油为底物,发酵48 h,发酵液中1,3-丙二醇的质量浓度达到96.57 g/L。     

产1,3-丙二醇克雷伯氏菌诱变菌株的发酵动力学研究

克雷伯氏菌是1,3-丙二醇(1,3-PD)生产菌。根据产酸克雷伯氏菌的诱变菌株Y-37的发酵过程曲线,对克雷伯氏菌生产1,3-PD的发酵动力学特性进行研究,提出了发酵过程中菌体生长、1,3-PD生物合成、甘油消耗的动力学模型,并应用matlab数值应用软件对实验数据进行拟合。该模型基本上能够描述克雷伯氏菌的发酵过程,模型的计算值与实验测定值能够比较好地拟合。     

大气压冷等离子体诱变产1,3-丙二醇菌株Klebsiella pneumoniae

采用大气压冷等离子体介质阻挡放电法对产1,3-丙二醇的克雷伯氏菌进行诱变,采用诱变与筛选同时进行的单细胞平板诱变方法,同时获得了可耐受高浓度甘油且1,3-丙二醇产量较高的优良突变株. 对诱变后菌的间歇发酵结果表明,诱变菌株比出发菌株1,3-丙二醇的质量转化率提高了23%,对数期比生长速率提高了18%. 批式流加发酵过程中,1,3-PD浓度在发酵36 h时达到70.5 g/L,甘油的质量转化率为0.57 g/g,分别比野生菌提高47%和58%. 该诱变和筛选方法具有操作简单、效率高等特点,对具有工业应用价值的菌株筛选具有实用价值.     

产1，3-丙二醇菌株克雷伯氏肺炎杆菌的诱变与筛选研究

为提高克雷伯氏肺炎杆茵Klebsiella pneumoniae产1,3-丙二醇的能力,尝试使用紫外线和氯化锂对菌种进行复合诱变,利用产酸圈和产物耐受相结合的平板筛选方法,获得可耐受高质量浓度1,3-丙二醇且副产物中乙醇及乳酸含量较少的优良突变菌株2株.与出发茵株相比,2株高产突变菌株Klebsiella pneumoniaw Kc和Klebsiella pneumoniae Kd发酵最终1,3-丙二醇质量浓度分别提高了34.7%和35.2%,达到66.7 g/L和67.1 g/L;乙醇质量浓度分别降低了49.3%和47.1%,降低至8.1 g/L和8.4 g/L;乙酸质量浓度分别提高了61.5%和68.1%,达到14.7 g/L和15.3 g/L.结果表明,该诱变和筛选方法目标明确、易操作、效率高,在1,3-丙二醇工业规模的生物法生产中将具有良好的应用价值,而且对于其它具有工业应用价值的菌株筛选工作也具有一定的借鉴意义.     

以粗甘油为原料高产1,3-丙二醇菌株的等离子体复合诱变

为提高克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)以粗甘油为底物发酵生产1,3-丙二醇的水平,尝试使用大气压介质阻挡放电等离子体与LiCl进行复合诱变,结合FeCl3和产物耐受的筛选方法,得到一株产量较高的突变菌株KpM30.经批式流加发酵,1,3-丙二醇的产量、摩尔转化率分别达到70.2 g/L和0.5...     

嗜热L-乳酸高产菌株的选育

采用高糖和平板快速筛选法从各种土壤、草料、温泉水中分离得到89株产乳酸的菌株,经过低糖与高糖的复筛,并结合高效液相色谱进行产物定量与光学纯度的检测,筛选到3株最适生长与发酵温度为50℃和55℃的L-乳酸高产菌S-18、S-32和S-44,该3株菌从100 g/L葡萄糖出发,72 h时产酸能力分别达到75.0 g/L、81.9 g/L 和86.5 g/L,光学纯度分别达到96.3%、96.6% 和97.7%。对其中产量最高的S-44进行离子注入诱变,获得多株高产菌,其中Y-4从200 g/L葡萄糖出发,产酸能力达到178.7 g/L,对糖转化率达到89.4％,为进一步的开发奠定了基础。     

甘油生产1,3-丙二醇发酵工艺优化研究

1,3-丙二醇是合成聚对苯二甲酸丙二醇酯的基础原料,利用甘油进行微生物发酵生产1,3-丙二醇的生物炼制技术具有广阔的应用前景。以克雷伯氏肺炎杆菌为出发菌种,对菌种保藏方式、发酵体系环境、氮气通气比、p H中和剂以及甘油品质等发酵工艺进行了优化研究。实验结果表明,在较优的工艺条件下,1,3-丙二醇产量可达103.38 g/L。     

高产1,3-丙二醇的等离子体诱变菌株选育及发酵动力学分析

以肺炎克雷伯氏菌为出发菌株,利用大气压介质阻挡放电等离子体诱变,确立等离子体诱变的物理参数和最佳诱变条件,分别以不同浓度的底物和产物筛选培养基对诱变菌液进行驯化,并结合96孔板筛选单菌落,获得一株高产1,3-丙二醇的突变菌株,命名为Kp-M2,其间歇发酵1,3-丙二醇产量比野生菌提高43%.基于Logistic和Lue...     

亚硝基胍-紫外复合诱变选育高产衣康酸菌株

为提高土曲霉KYK-031发酵生产衣康酸能力,对出发菌株开展诱变育种和高产能力选育研究。采用亚硝基胍（NTG）和紫外（UV）复合诱变方法,通过平板初筛和摇瓶复筛,筛选衣康酸高产突变株。结果表明,亚硝基胍在500μg/mL浓度下的最佳诱变时间为40 min,15 W紫外诱变的最佳诱变时间为2 min,亚硝基胍-紫外复合诱变后筛选得到一株衣康酸高产菌株KYK-1035,摇瓶发酵产量为73.7 g/L,比出发菌株（41.8 g/L）提高了76.3%,糖酸转化率为63.4%。采用亚硝基胍-紫外复合诱变,提高了出发菌株诱变的正突变率,为衣康酸发酵继续放大和工业化生产奠定了基础。     

重组肺炎克雷伯菌发酵联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇

对表达了高效醛脱氢酶的重组肺炎克雷伯氏菌以甘油为底物生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的过程进行优化,将发酵过程中补料阶段甘油浓度分别控制为0~10, 10~20, 20~30 g/L,并分3次间歇性补加甘油. 结果表明,发酵过程中补料阶段控制甘油浓度在20~30 g/L,发酵26 h得到47.20 g/L 3-羟基丙酸和43.90 g/L 1,3-丙二醇;而间歇性补加甘油产物得率最高,发酵26 h时3-羟基丙酸和1,3-丙二醇相对甘油的得率分别为0.35和0.38 mol/mol. 3-羟基丙酸和1,3-丙二醇联产可实现辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的再生平衡,从而提高碳回收率.     

有机酸对产丙二醇菌生长和生产的影响

为提高克雷伯氏肺炎杆菌厌氧发酵生产1,3-丙二醇的能力,在发酵过程中添加有机酸(OA),考察其对菌体生长、1,3-丙二醇及其他副产物合成的影响。实验表明:添加OA可促进菌体生长,加入质量浓度为0.2~0.5g/L的OA,菌体生长的菌液在590 nm处吸光度(OD)值比参照值高出30%;加入过量的OA(>1.0 g/L),则菌体生长受到抑制,OD值比参照值低37%;添加OA可促进单位细胞合成1,3-丙二醇,加入质量浓度为0.2~0.5g/L的OA,单位菌体的1,3-丙二醇质量浓度比参照高3.8%~17.5%;添加OA能提高甘油转化为1,3-丙二醇的转化速率,加入0.2~0.5 g/L的OA,甘油转化为1,3-丙二醇的最大转化速率达0.81 h-1。在15 L罐上批式发酵48 h,1,3-丙二醇最终质量浓度达42.9 g/L,甘油转化为1,3-丙二醇的平均转化率达64%。     

两段双底物发酵生产1,3–丙二醇

利用Klebsiella pneumoniae生长与催化耦合的特点，将好氧生长与厌氧转化两个过程耦合，开发了两段双底物发酵生产1,3-丙二醇的新工艺，并对其工艺特点进行了初步研究. 结果表明，采用两段双底物发酵工艺，发酵过程菌体浓度明显高于传统的厌氧转化工艺，OD650最大值达到9.37，发酵60 h, 1,3-丙二醇的浓度达到50.16 g/L，生成速率达0.836 g/(L×h)，比传统工艺提高了45%.     

葡萄糖作辅助碳源对klebsiella pneumoniae发酵生产1,3-丙二醇的影响

在Klebsiella pneumoniae发酵甘油生产1,3 丙二醇的种子培养及发酵实验中,考察了葡萄糖作辅助碳源对菌体生长及1,3 丙二醇生成的影响. 结果表明,在种子培养期,以葡萄糖和甘油为混合碳源可缩短种子培养周期;在批次发酵和流加发酵中,葡萄糖作辅助碳源可使1,3 丙二醇产率及得率明显提高,但不同的葡萄糖加入方式对产率及得率促进的效果不同. 在初始发酵培养基中添加5 g/L葡萄糖、并在4 40 h进行葡萄糖与甘油混合液连续流加的条件下,1,3 丙二醇浓度、产率及得率较单一甘油为底物的流加发酵结果分别提高41.2 , 38.6 和8.3 .     

利用氧化还原电位调控基因工程菌株 Klebsiella pneumoniae F-1合成1,3-丙二醇

基因工程菌株Klebsiella pneumoniae厌氧发酵过程中,氧化还原电位(ORP)是一个监控发酵过程的重要指标. 考察了K. pneumoniae F-1在不同ORP(-190, -210, -240和-290 mV)下菌体生长和代谢产物合成的情况. 在ORP为-240 mV时,1,3-丙二醇的发酵终浓度和得率分别为81.5 g/L和0.423 mol/mol,分别为4种ORP条件下的最高值. 这说明ORP=-240 mV是菌株K. pneumoniae F-1的最适ORP. 此ORP既不同于野生菌株K. pneumoniae M5aL的最适ORP(-190 mV),也不同于经过诱变的菌株K. pneumoniae YMU2的最适ORP(-280 mV). 另外,通过研究发酵体系ORP对甘油代谢流的影响,发现还原性氛围较有利于甘油向1,3-PD、乙醇、2,3-丁二醇等还原性较高的代谢物转化. 首次报道了ORP调控发酵过程在基因工程改造菌株中的应用,这对于进一步研究ORP调控厌氧发酵过程具有一定的意义.     

蔗糖与葡萄糖作辅助碳源对重组Klebsiella pneumoniae发酵生产 1,3-丙二醇的影响

实验研究了重组Klebsiella pneumoniae批式发酵生产1,3-丙二醇过程中辅助碳源蔗糖与葡萄糖对发酵过程的影响,对发酵工艺进行了放大,并对流加策略进行了优化. 结果表明,葡萄糖为发酵生产1,3-丙二醇的辅助碳源优于蔗糖;以重组Klebsiella pneumoniae为菌种,以葡萄糖为辅助碳源,采用指数流加策略,30 L发酵罐中1,3-丙二醇的产量最高达85.2 g/L,产率达0.63 mol/mol,比单纯以甘油为碳源分别提高37.35%和25.00%.     

外源添加ATP对K.pneumoniae菌体生长和产物合成的影响

基于K.pneumoniae生成1,3 丙二醇过程中甘油脱水酶催化失活与复活的特性,在发酵培养基中添加不同质量浓度的三磷酸腺苷(ATP),考察ATP对菌体生长、1,3 丙二醇(1,3 PD)、其他副产物合成的影响。实验结果表明:添加ATP抑制菌体生长,加入质量浓度为0 4g/LATP,OD值比参照低53%;添加ATP促进单位细胞合成1,3 丙二醇,加入质量浓度为0 4g/LATP,1,3 丙二醇质量浓度/OD值比参照高90%;添加ATP能提高甘油到1,3 丙二醇转化率,加入0 8g/LATP,甘油到1,3 PD的最大转化率达到0 76mol/mol。     

基于生长代谢耦联的1,3-丙二醇发酵过程底物流加控制策略

研究了克雷伯氏杆菌转化甘油生产1,3-丙二醇的底物流加控制策略,其特征是批式流加发酵过程与细胞生长和代谢相耦联. 通过细胞生长动力学分析,建立了对数生长期和稳定期底物消耗与生物量和碱液消耗量之间的函数关系. 2次在线反馈补料发酵实验结果表明,甘油浓度控制在20±2 g/L时,1,3-丙二醇的终浓度分别达80.3和78.8 g/L以上,与手动反馈补料相比,1,3-丙二醇浓度分别提高了25.0和23.5 g/L.     

Production of 3-hydroxypropionic acid by recombinant <Emphasis Type="Italic">Klebsiella pneumoniae</Emphasis> based on aeration and ORP controlled strategy

A biosynthetic pathway for the production of 3-hydroxypropionic acid (3-HP) from glycerol was established in recombinant Klebsiella pneumoniae by introducing the aldehyde dehydrogenase gene from Escherichia coli. The activity of aldehyde dehydrogenase, which oxidized 3-hydroxypropionaldehyde (3-HPA) to 3-HP, was detected and 3-HP was produced by the recombinant strains. Three different oxygen supply strategies, associated with measuring the oxidoreduction potential (ORP) during the fermentation under these conditions, were adopted for higher production of 3-HP by the recombinant cells. About 0.8 g/l 3-HP and more 1,3-propanediol production by the recombinant Klebsiella pneumoniae were obtained under completely aerobic conditions. Under micro-aerobic conditions, 3-HP production could be increased to 2.2 g/l and 1,3-propanediol production was almost the same as in the original strain. Under the anaerobic conditions, 1,3-propanediol was the main product and about 1.3 g/l 3-HP was produced. Finally, 3-HP production of the recombinant strain was increased to 2.8 g/l under micro-aerobic condition with a further two-stage ORP controlled strategy.