A型产气荚膜梭菌α毒素疫苗抗原rCPA-HSP65的原核表达及其纯化

目的原核表达A型产气荚膜梭菌α毒素疫苗抗原rCPA-HSP65,并进行纯化。方法以CPA全基因为模板,PCR扩增rCPA基因,插入表达质粒p ET-28a(+)-HSP65,构建重组表达质粒p ET-28a-rCPA-HSP65,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物进行12%SDS-PAGE分析;优化表达工艺进行高密度发酵,发酵产物经DEAE阴离子柱上复性后,再经金属螯合层析纯化。结果重组表达质粒p ET-28a-rCPA-HSP65经双酶切及测序鉴定证明构建正确,表达的重组蛋白相对分子质量约90 000,主要以可溶性形式为主,表达量占菌体总蛋白的30.17%。利用TB培养基,IPTG 34℃诱导5 h的表达产物经纯化后,纯度约达95%,蛋白收率为4.5 mg/g湿菌。结论已成功表达并纯化了A型产气荚膜梭菌α毒素疫苗抗原rCPA-HSP65,为后期疫苗生物学活性的研究奠定了基础。     

产气荚膜梭菌β_2-β_1融合基因的构建及初步表达

目的构建产气荚膜梭菌β2-β1毒素融合基因并在重组大肠杆菌中表达。方法采用PCR方法,从含β2毒素基因质粒CPB2-9中扩增出β2毒素基因,经NcoⅠ和BamHⅠ双酶切后,回收0.73kb片段,再将含β1毒素基因质粒pXETB1经同样双酶切回收,与β2片段连接,转化BL21(DE3)中,进行诱导表达。结果经SDS-PAGE和Westernblot分析表明,重组菌株BL21(DE3)可表达β2-β1融合蛋白,且该蛋白可以被相应的抗体所识别。结论已成功构建了β2-β1融合基因,并在重组大肠杆菌中表达。     

产气荚膜梭菌α毒素的原核表达及纯化

目的克隆产气荚膜梭菌α毒素(Clostridium perfringens alpha-toxin,CPA)全基因,在大肠埃希菌(E.coli)中表达并纯化α毒素。方法设计并合成CPA的全基因,插入原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28aCPA,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,优化表达条件,并对重组蛋白进行纯化。结果双酶切和测序鉴定结果表明,CPA基因以正确的阅读框架克隆入pET-28a载体中;表达的重组蛋白相对分子质量约为43 000,主要以可溶性形式表达,最佳培养基为TB培养基,最佳诱导温度为37℃,诱导时间为3 h;纯化的重组蛋白纯度达95%以上,浓度为0.663 mg/ml,收率为5 mg/g湿菌。结论成功在E.coli中表达了CPA,纯化后的CPA纯度较高,为进一步研究其结构、功能、致病机制及制备抗α毒素人源单链抗体奠定了基础。     

产肠毒素性大肠埃希菌K99-987P-F41原核表达载体的构建、表达及其纯化

目的构建产肠毒素性大肠埃希菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)K99-987P-F41原核表达载体,诱导表达后进行纯化。方法利用PCR技术,从ETEC基因组DNA中扩增出K99、987P、F41部分基因片段,将3段目的基因融合亚克隆至大肠埃希菌原核表达载体p ET30a(+),构建重组质粒p ET30a(+)-K99-987P-F41,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经镍离子亲和层析纯化。结果重组表达质粒p ET30a(+)-K99-987P-F41经PCR、酶切及测序鉴定证明构建正确。表达的重组蛋白相对分子质量约60 000,主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的63.8%,纯度为81.2%,浓度为8.953 mg/ml,可同时被天然和重组抗原多抗识别,具有良好的反应原性。结论 ETEC重组质粒p ET30a(+)-K99-987P-F41可在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,利用镍离子亲和层析柱纯化可获得融合蛋白。     

产气荚膜梭菌α-β_2-β_1融合基因的构建及表达

目的构建产气荚膜梭菌α-β2-β1融合蛋白基因表达载体,并对表达产物进行鉴定。方法利用PCR技术,从含α毒素基因的质粒pXCPA02中扩增出α毒素基因,经NcoⅠ酶切,回收0·95kb的α基因片段,再与经NcoⅠ酶切并含融合基因β1-β2的质粒pXETB1B2连接,获得重组质粒pXETAB2B1,经NcoⅠ、BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定,并对其表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重组质粒pXETAB2B1含有α-β2-β1融合基因。表达产物相对分子质量约为95000,并可被特异性抗体识别。结论已获得高效表达α-β2-β1的重组菌株。     

产气荚膜梭菌毒素β1的原核表达及其抗体间接ELISA检测方法的建立

目的 原核表达产气荚膜梭菌毒素β1(Clostridium perfringens Beta1 toxin,CPB1),建立该毒素抗体的间接ELISA检测方法。方法 利用基因工程技术获得cpb1基因,克隆至载体pET32a,构建重组质粒pET32α-cpb1,转化感受态E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白CPB1。以重组蛋白CPB1作为包被抗原,HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗,建立CPB1抗体的间接ELISA检测法。并以CPB1的单克隆抗体McAb 1K19为一抗,优化包被蛋白的包被浓度、一抗稀释度、封闭时间及二抗稀释度,确定方法的临界值,验证方法的特异性、精密性、灵敏性。采用建立的方法检测201份正常牛血清样品及阴性、阳性小鼠血清样品。结果 表达的重组蛋白CPB1相对分子质量约为54 000(CPB1蛋白与硫氧化还原蛋白的融合蛋白),主要以包涵体形式表达。包被蛋白最佳浓度为10μg/mL,一抗最佳稀释度为1∶16384,最佳封闭时间为120 min,二抗最佳稀释度为1∶1 000。除B和C型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,C. p...     

用于肉毒毒素活性测定的特异性绿色荧光融合蛋白的制备

目的制备含有7种血清型肉毒毒素切割位点(SNAP25-VAMP)的特异性绿色荧光融合蛋白,在E.coli中诱导表达,纯化后用于肉毒毒素活性测定。方法根据SNARE蛋白复合物中SNAPE25和VAMP基因序列及各血清型肉毒毒素(Bo NTs)的切割位点,设计合成含有SNAREs中突触小体(SNAP25)和突触小泡膜蛋白(VAMP)的Bam HⅠ-HIS6-SNAP62-Eco RⅠ-VAMP57C-TAA-HindⅢ(以下简称为SV)基因,连接至p ET-28a-GFP载体上,构建重组质粒p ET-28a-GFP-SV,转化感受态E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达后,经DEAE阴离子交换层析、Cu2+金属螯合层析、Q阴离子交换层析3步纯化,BCA法测定纯化产物的蛋白浓度,ELISA法检测B型肉毒毒素轻链蛋白(Bo NT/BL)活性。结果构建的质粒p ET-28a-GFP-SV经双酶切及测序鉴定证明构建正确,表达的GFP-SV融合蛋白相对分子量约40 000,主要以可溶形式存在,蛋白浓度为18.4μg/μl,纯度可达70%以上。利用该融合蛋白的荧光强弱变化可测定Bo NT/BL活性大小,同时也可测定其抗体中和活性大小。结论制备的含有SV的特异性绿色荧光融合蛋白在E.coli中获得了高效表达,为后续各型肉毒毒素活性检测及抗体中和毒素活性检测奠定了基础。     

C型产气荚膜梭菌保护性抗原的免疫原性

目的研究C型产气荚膜梭菌α-β2-β1融合基因重组工程菌BL21(DE3)/pXETAB2B1抗原的免疫原性。方法在对重组工程菌BL21(DE3)/pXETAB2B1进行优化表达的基础上,制备包涵体粗提物、全细胞培养物及全细胞乳糖诱导培养物3种抗原,对ICR小鼠进行攻毒保护试验。结果重组工程菌BL21(DE3)/pXETAB2B1能够表达α-β2-β1融合蛋白,该融合蛋白能够有效刺激免疫小鼠产生特异性抗体,达到保护的目的。结论已获得具有一定免疫原性的重组工程菌,可作为预防产气荚膜梭菌所引起疾病的候选菌株。     

十二指肠贾第虫α-6贾第素的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化十二指肠贾第虫α-6贾第素(α-6 Giardin)。方法以十二指肠贾第虫的c DNA为模板,PCR扩增α-6 Giardin基因片段,连接至p MD18-T载体,得到重组克隆质粒p MD18-T-α-6,将双酶切后得到的目的片段连接至p ET-28a表达载体中,得到重组表达质粒p ET-28a-α-6,转化至E.coli Rosetta感受态细胞中,IPTG诱导表达目的蛋白α-6 Giardin,收集菌体,离心后进行SDS-PAGE及Western blot鉴定,并利用Ni-NTA亲和层析柱纯化融合的α-6 Giardin蛋白。结果质粒p ET-28a-α-6经双酶切鉴定,证明构建正确;表达的目的蛋白α-6 Giardin为带His标签的包涵体蛋白,相对分子质量约40 000,可与鼠抗His单抗特异性结合,具有良好的反应原性;纯化的重组α-6Giardin融合蛋白相对分子质量约40 000,纯度可达80%。结论成功克隆、表达并纯化了十二指肠贾第虫α-6Giardin蛋白,为十二指肠贾第虫α-6 Giardin进一步的功能研究奠定了基础。     

百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素基因的克隆及原核表达

目的克隆百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素(CyaA,ACT)基因,表达并纯化重组CyaA蛋白。方法从百日咳杆菌CS株的基因组DNA中PCR扩增CyaA编码基因,克隆入载体pET30a,构建重组原核表达质粒pET30a/cyaA,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经8mol/L尿素变性、透析复性、DEAE阴离子交换柱纯化后,采用Western blot法鉴定其反应原性。结果重组原核表达质粒pET30a/cyaA经PCR、双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的20%;纯化的重组蛋白纯度达90%左右,可与全细胞百日咳疫苗和无细胞百日咳疫苗免疫血清结合。结论已成功克隆了百日咳杆菌cyaA基因,并在大肠杆菌中表达了重组CyaA蛋白,为进一步开展CyaA的应用研究奠定了基础。     

B型肉毒毒素轻链蛋白的原核表达及纯化

目的克隆B型肉毒毒素轻链Bont-B基因,使其在大肠杆菌内表达,并对表达的重组蛋白进行纯化。方法设计并人工合成Bont-B基因,克隆入表达载体pMD19-T中,构建质粒pMD19-T-Bont-B,经酶切后与pET-28a载体连接,构建重组表达质粒pET-28a-Bont-B,将重组表达质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot分析后,经金属螯合层析Cu2+柱进行纯化,纯化产物经SDS-PAGE分析纯度。结果重组表达质粒pET-28a-Bont-B经PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约50 000,主要以可溶性形式表达,表达量约占菌体总蛋白的6%;纯化后的重组蛋白纯度可达90%以上。结论已成功克隆并在大肠杆菌BL21(DE3)中原核表达了Bont-B轻链基因,为制备抗Bont-B轻链单克隆抗体及研究肉毒中毒机制和治疗奠定了基础。     

A型肉毒毒素轻链蛋白的表达及纯化

目的构建A型肉毒毒素轻链表达载体重组质粒,在大肠埃希菌中表达后,利用金属螯合层析柱纯化。方法以p GEM-Bo NT/AL轻链质粒为模板,PCR扩增Bo NT/AL基因,克隆至表达载体p ET-28(a)中,构建重组质粒p ET-28(a)-Bo NT/AL,转化E.coli BL21(DE3),分别于37、30、25℃IPTG诱导表达,表达产物经Chelating Sepharose 4Fast Flow(Cu~(2+))层析柱纯化,纯化产物经尿素梯度复性。结果质粒p ET-28(a)-Bo NT/AL经酶切鉴定及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约52 000,主要以包涵体形式存在,37℃诱导表达量最高,占菌体沉淀总蛋白的41%;包涵体经2%Trition-X100和2 mol/L尿素洗涤后,可去除部分杂蛋白,8 mol/L尿素能溶解大部分包涵体;经再次浓缩后,蛋白浓度可达89μg/ml,纯度达90%。结论成功克隆及表达了Bo NT/A轻链基因,为制备抗Bo NT/A轻链单链抗体以及研究肉毒中毒机制和治疗方案奠定了基础。     

屋尘螨变应原Derp 5在大肠埃希菌中的表达及纯化

目的克隆表达屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus,Derp)第5组变应原Derp 5基因,在E.coli中表达、纯化重组Derp 5蛋白,并分析其血清Ig E反应原性。方法以合成的Derp 5核酸序列为模板进行PCR扩增,产物经双酶切后与载体pCold-TFM连接,构建重组表达质粒pCold-TFM-Derp 5,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。用镍离子亲和层析柱和凝胶过滤层析柱纯化目的蛋白,尘螨过敏患者血清鉴定其IgE反应原性。结果重组表达质粒pCold-TFM-Derp 5经双酶切、PCR及测序鉴定证明构建正确;在E.coli BL21(DE3)中实现了目的蛋白的可溶性高表达,毎升细菌表达产物经纯化可得到纯度95%以上的Derp 5蛋白约6 mg。纯化的重组Derp 5蛋白与尘螨过敏患者血清IgE有结合活性。结论成功构建了Derp 5原核表达载体,高效表达并纯化了目的蛋白,纯化的重组Derp 5蛋白具有良好的IgE反应原性,为屋尘螨变态反应性疾病的特异性诊断和治疗以及致敏蛋白的进一步研究奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌α-溶血素及其突变体的原核表达和免疫学活性

目的原核表达金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)α-溶血素(α-hemolysin,Hla)及其突变体,并检测其免疫学活性。方法采用PCR法从S.aureus中扩增hla基因,将该基因克隆至原核表达载体p ET28a中,构建重组表达质粒p ET28a-hla,并利用点突变试剂盒进行突变,获得重组质粒p ET28a-hlaH35L。将两种重组表达质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;表达的重组蛋白经Ni-NTA亲和层析和CM离子交换层析纯化后,检测其溶血活性、免疫血清的抑制溶血活性及HlaH35L蛋白的免疫保护作用。结果重组表达质粒p ET28a-hla经双酶切和测序证明构建正确;重组质粒p ET28a-hlaH35L的测序结果显示,第35位氨基酸突变位点与设计相符。表达的Hla和HlaH35L蛋白相对分子质量约为36 000,均为可溶性表达,表达量约占菌体总蛋白的50%,纯化后纯度均在90%以上。Hla具有溶血活性,溶血比活为152 HU/mg;HlaH35L无溶血活性;抗Hla和抗HlaH35L血清均具有抑制Hla溶血的活性;在小鼠滴鼻攻击模型中,HlaH35L具有一定的保护作用。结论成功在大肠埃希菌中表达了具有良好免疫学活性的Hla及其突变体HlaH35L,为筛选S.aureus候选疫苗组分奠定了实验基础。     

产气荚膜梭菌α毒素基因PLC-Asp56定点突变及其特性鉴定

本实验通过对A型产气荚膜梭菌α毒素PLC基因第56位氨基酸进行定点突变,将天冬氨酸Asp突变为丙氨酸Ala,构建了含有PLC-Asp56Ala突变基因的表达质粒,测序结果表明,重组质粒pPLC-Asp56Ala已经含有α毒素PLC基因的PLC-Asp56Ala突变基因。经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,PLC-Asp56Ala突变体蛋白含量占菌体总蛋白相对含量的22.48%。二级结构预测结果表明PLC-Asp56Ala突变体蛋白的二级结构第55位和第56位突变位点相对于α毒素由原来的无规则卷曲变成β转角。生物学活性检测表明PLC-Asp56Ala突变体蛋白已经完全丧失该酶活性。本研究结果可为今后对A型产气荚膜梭菌α毒素的致病机制的探究提供基础理论依据。     

呼吸道合胞病毒F1蛋白截短体(F_(212-489))的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)F1蛋白截短体(F212-489)。方法从质粒p MD-18T-f中PCR扩增截短f1基因(f212-489),经TA克隆测序正确后,将目的片段插入原核表达载体p ET-28a,构建重组表达质粒p ET-28a-f212-489,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经镍离子亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定。结果重组表达质粒p ET-28a-f212-489经双酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为30 000,主要以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的10%;纯化的重组蛋白纯度为85%,可与羊抗RSV多克隆抗体特异性结合。结论成功表达了RSV F1蛋白截短体(F212-489),纯化的重组蛋白反应原性良好,为更好地研究RSV的免疫机理及通过基因工程方法研制特定部位的亚单位或多肽疫苗奠定了基础。     

艰难梭菌细胞毒素B羧基末端功能区片段的表达及纯化

目的表达并纯化艰难梭菌细胞毒素B羧基末端功能区片段,为制备高效防治艰难梭菌感染的疫苗和诊断抗原奠定基础。方法提取艰难梭菌染色体基因组DNA,用PCR扩增ToxinB3基因,将其克隆至表达载体pET22b(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)。诱导表达产物经金属螯合层析纯化,用SDS-PAGE进行分析。结果已成功地克隆了艰难梭菌细胞毒素B羧基末端重复区域的1848bp的基因,经双酶切、PCR和测序鉴定,插入到载体的基因与GenBank中公布的艰难梭菌VPI10463ToxinB3基因序列的同源性为99%。SDS-PAGE显示,目的基因表达产物的相对分子质量为71300,重组蛋白表达量占菌体总蛋白的34%,可溶性表达占上清的14%,包涵体占沉淀的82·7%,纯化后可溶性蛋白浓度为0·781mg/ml。结论所构建的含艰难梭菌ToxinB3基因的pET22b(+)CDB3重组质粒能高效表达目的基因。金属螯合层析纯化重组蛋白CDB3的方法简便,特异性好。     

重组大肠杆菌的构建及利用木糖生产木糖醇的研究

xylB基因失活可以降低木酮糖的磷酸化,使木糖还原为木糖醇而不进入PPP途径。利用Red重组技术构建xylB缺失大肠杆菌DxylB/E.coli BL21(DE3)可以提高木糖醇的产率。通过PCR克隆得到来自Neurospora crassa的木糖还原酶基因xr,将该基因与载体p ET30a(+)连接构建表达质粒p ET30a-xr;PCR克隆得到来自E.coli K-12的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6-PGDH)基因gnd和葡萄糖6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PDH)基因zwf,依次与双启动子原核表达载体p CDFDute-1连接构建表达质粒p CDFDuet-gnd-zwf;将上述构建好的两个重组质粒同时转化到DxylB/E.coli BL21(DE3)宿主体内。经异丙基-?-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得分子量约为38、51、54 k D的三种蛋白,酶活测定显示,重组菌种XR的比酶活为7.25 U×mg-1,6-PGDH的比酶活为2.26 U×mg-1,G6PDH的比酶活为1.31 U×mg-1。5 L发酵罐发酵结果显示,xylB基因敲除可以提高木糖醇的产率,含NADPH再生系统的菌株木糖醇的体积产率是1.04 g×(L×h)-1,比只含有木糖还原酶的重组菌株0.88 g×(L×h)-1高24.32%,为后续工业化利用大肠杆菌生产木糖醇奠定了基础。     

重组人抗缪勒管激素C-末端蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达重组人抗缪勒管激素(human anti-Müllerian hormone,hAMH)C-末端蛋白,并进行纯化。方法 PCR法扩增hAMH C-末端蛋白基因,插入至载体pET-28a,构建重组表达质粒pET-28a-hAMH C。重组质粒转化感受态E. coli BL21(DE3),终浓度为1. 0 mmol/L的IPTG诱导表达h AMH C-末端蛋白。扩大培养后进行Ni亲和层析柱纯化,12%SDS-PAGE分析纯化产物。结果经菌落PCR及测序鉴定,重组质粒pET-28a-hAMH C构建正确。表达及纯化产物均可见相对分子质量约12 500的目的蛋白条带,纯度达90%以上。结论原核表达了重组hAMH C-末端蛋白,纯化后获得了较高纯度的目的蛋白。     

幽门螺旋杆菌尿素酶多表位疫苗CTB-UE的生物信息学分析及其表达

目的通过生物信息学软件评价幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,Hp)尿素酶多表位疫苗CTB-UE的抗原结构,并在E.coli中表达、纯化融合蛋白CTB-UE。方法应用生物信息学软件DNAstar、Geno3D、MOE分析Hp尿素酶多表位疫苗CTB-UE的二级结构和三级结构;将人工合成的尿素酶多表位肽基因UE插入含CTB基因的重组质粒p ETC中,构建重组表达质粒p ETCUE,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,通过Ni-NTP镍离子亲和层析纯化重组蛋白CTB-UE,并进行Western blot分析。结果生物信息学软件分析显示,Hp尿素酶多表位疫苗CTB-UE具有合理的结构;重组表达质粒p ETCUE经双酶切和测序鉴定证实,融合基因CTB-UE与设计序列完全一致;表达的融合蛋白CTB-UE相对分子质量约为33 000,主要以包涵体形式表达,表达量占全菌蛋白的22.3%;纯化的融合蛋白CTB-UE纯度达95.6%,可与兔抗Hp多克隆抗体发生特异性结合。结论设计的Hp尿素酶多表位疫苗CTB-UE具有合理的结构,能在E.coli中高效表达,纯化后纯度较高,且具有较强的反应原性,为进一步研究针对尿素酶A、B双亚基的Hp多表位疫苗奠定了基础。