碳源对L-苏氨酸发酵的影响

以L-苏氨酸生产菌TRFC为供试菌株,研究了碳源对L-苏氨酸发酵的产量和糖酸转化率的影响。采用补料分批发酵工艺生产L-苏氨酸,利用氨基酸分析仪测定发酵液中L-苏氨酸的产量。确定了发酵的最佳碳源及其补料方式,通过10L罐补料分批发酵36h,产酸可达118.9 g/L,糖酸转化率为47.6%。     

L-2-氨基丁酸大肠杆菌生产菌株的构建

L-2-氨基丁酸作为新型药物的关键手性前体,在化工和制药行业应用广泛。该文以1株生产L-苏氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli) THRD为出发菌株,逐步延伸代谢途径,构建了L-2-氨基丁酸高产菌株。首先,分别把苏氨酸脱水酶编码基因ilv A2和ilv A4在THRD中过表达,菌株THRD/p Trc99a-ilv A2在5 L发酵罐中分批补料发酵,2-酮基丁酸积累量达到18 g/L。然后,分别与ilv A2串联表达酪氨酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶编码基因tyr B、gdh和bcdBS,将L-2-酮基丁酸转化为L-2-氨基丁酸,菌株THRD/p Trc99a-bcdBS-ilv A2的L-2-氨基丁酸产量达到19 g/L。最后,研究了阻断L-苏氨酸输出途径对发酵的影响,菌株THRDΔrht C/p Trc99a-bcdBS-ilv A2的L-2-氨基丁酸产量提升至22 g/L。因此,通过代谢途径延伸可以有效地将L-苏氨酸生产菌株转变为L-2-氨基丁酸生产菌株。该研究为L-2-氨基丁酸高产菌株的构建奠定了基础,且对其他延伸代谢途径获得新产品的代谢工程研究提供了参考。     

以高浓度葡萄糖为碳源的L-苏氨酸发酵工艺研究

以L-苏氨酸生产菌TRFC为供试菌株,研究了高葡萄糖浓度下各种生长因子和培养条件对L-苏氨酸发酵的影响。结果表明,脯氨酸可以解除高浓度葡萄糖对L-苏氨酸发酵的抑制作用,生物素可以提高L-苏氨酸生产菌的细胞得率及L-苏氨酸的产量,利用摇瓶发酵确定最佳用量分别为60mg/L和120μg/L;控制pH7.0和采用控制溶氧的脉冲补料方式L-苏氨酸产量得到进一步的提高。在最优条件下,利用10L发酵罐发酵38h,L-苏氨酸产量可达110.2g/L,糖酸转化率为45.7%。     

琥珀酸对大肠杆菌发酵生产L-色氨酸的影响

以色氨酸生产菌Escherichia coli TRT H为出发菌株,在30 L发酵罐上进行实验,在发酵10 h后随糖外源流加1g/L的琥珀酸,以降低代谢抑制物质的积累量,提高L-色氨酸的产量.实验结果显示:外源流加1g/L的琥珀酸发酵与未流加琥珀酸发酵相比,菌体生物量与L-色氨酸产量分别提高了5.4%和10.0%,乙酸积累量下降了9.5%,糖酸转化率提高了4.0%.这表明外源流加1 g/L琥珀酸发酵可以提高L-色氨酸的产量,降低乙酸的积累量,提高糖酸转化率.     

CRISPRi干扰中心代谢基因转录对苏氨酸合成的影响

苏氨酸是重要的饲料氨基酸,需求量持续增加,提高苏氨酸发酵产率和糖酸转化率,降低生产成本已成为一个重要课题。该实验以苏氨酸工程菌Escherichia coli THRD为出发菌,利用CRISPRi(clustered regularly interspaced short palindromic repeats interference)技术研究中心代谢9个基因转录水平的改变对苏氨酸合成的影响。发酵结果显示,干扰zwf、pfk A和glt A基因的转录水平提高了苏氨酸的合成效率,对应菌株苏氨酸产量分别为60. 3、64. 6和65. 8 g/L,与出发菌(50. 9 g/L)相比,分别提高了18. 5%、26. 9%和29. 3%。糖酸转化率分别为40%、38%和39%,与出发菌(34%)相比,分别提高了17. 7%、11. 8%和14. 7%。结果表明,通过CRISPRi干扰中心代谢基因的转录水平,可以调节合成代谢网络,使更多碳源流向苏氨酸,提高苏氨酸的合成效率。同时,该研究也为其他生物制品工程菌的构建提供了参考。     

大肠杆菌转运蛋白SstT和RhtC的改造对L-苏氨酸产量的影响

L-苏氨酸是一种必需氨基酸,广泛应用于食品、医药和饲料等领域。有报道表明降低胞内L-苏氨酸浓度,解除其对合成途径酶的反馈作用,有利于提高L-苏氨酸产量,因此,本实验利用Red重组技术和基因过表达技术,以L-苏氨酸生产菌Escherichia coli TRFC为出发菌株,成功构建了TRFCΔsstT和TRFCΔsstT+pSTV28-rhtC。摇瓶发酵结果显示,与原菌相比,TRFCΔsstT的L-苏氨酸产量较原菌提高了4.00%,TRFCΔsstT+pSTV28-rhtC的L-苏氨酸产量较TRFCΔsstT+pSTV28提高了18.16%。此外,经检测发现重组菌株胞内L-苏氨酸浓度均低于原菌。最后进行了TRFCΔsstT+pSTV28-rhtC的5 L分批补料发酵实验,其L-苏氨酸产量及糖酸转化率分别较原菌提高了15.33%和16.14%。综上所述,通过改造L-苏氨酸转运系统的SstT和RhtC蛋白,能有效地增强细胞内L-苏氨酸外排能力,降低细胞内L-苏氨酸的浓度,进而有利于L-苏氨酸产量的提高。     

代谢工程改造大肠杆菌合成L-异亮氨酸的研究

以L-苏氨酸生产菌Escherichia coli THRD为出发菌株,利用基因重组技术替换ilvLXGMEDA启动子并过表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilvA和ilvIH,以期获得L-异亮氨酸生产菌.将ilvLXGMEDA启动子替换为强启动子Ptrc并敲除ilvLXGM后获得ILE01菌株,于该菌株中分别过表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilvIH及共表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilvA和ilvIH,获得菌株ILE02和ILE03,其L-异亮氨酸产量分别达到1.75 g/L和2.19g/L.针对ILE03 α-酮丁酸积累量过高的问题,通过改变操纵子中ilvA和ilvIH的顺序调节其转录水平,获得菌株ILE04,其L-异亮氨酸产量达2.85 g/L.利用ILE04于5L发酵罐中进行发酵实验,L-异亮氨酸产量、发酵强度及转化率分别为5.23 g/L、0.17 g/(L·h)及4.6％.     

3-磷酸甘油醛脱氢酶促进谷氨酸棒杆菌发酵生产L-精氨酸和L-鸟氨酸

在谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum) SNK118中表达NADP~+依赖型的3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因,提高胞内NADPH水平,以提高L-精氨酸(L-Arginine)和L-鸟氨酸(L-Ornithine)发酵产量。通过NCBI数据库检索,选取了3个不同来源的3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因。经测定酶活力,最终选择糖丁基梭菌(Clostridium saccharobutylicum) DSM 13864来源的NADP~+依赖型的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(Csgap C)。构建了产L-精氨酸的重组菌SNK118/p XMJ19-Csgap C,当摇瓶发酵70 h时产L-精氨酸11. 55 g/L,糖酸转化率0. 13 g/g,与对照菌SNK118/p XMJ19相比,精氨酸产量和糖酸转化率分别提高了26%和10. 2%。在L-鸟氨酸生产菌株SNK118Δarg FΔargR中重组表达Csgap C,重组菌SNK118Δarg FΔargR/p XMJ19-Csgap C摇瓶发酵70 h产L-鸟氨酸27. 76 g/L,糖酸转化率0. 274 g/g,与对照菌SNK118Δarg FΔargR/p XMJ19相比,L-鸟氨酸产量和糖酸转化率分别提高了20. 1%和15. 6%。结果表明,异源表达Csgap C有助于提高谷氨酸棒杆菌发酵生产L-精氨酸和L-鸟氨酸的水平。     

正交旋转组合优化L-苏氨酸发酵的氮源

利用旋转回归法研究氮源对L-苏氨酸产量的影响并拟合出回归方程,探索L-苏氨酸发酵的最佳氮源及其用量.经回归分析表明,培养基中硫酸铵、酵母粉的含量及其配比对L-苏氨酸产量有显著影响,通过岭脊分析寻优得出:硫酸铵最佳浓度为17.66g/L、酵母粉最佳浓度为2.51 g/L.在此优化条件用10L自动发酵罐补料分批发酵38h,L-苏氨酸产量可达119.7g/L,糖酸转化率为47.9%.     

调整葡萄糖转运系统提高大肠杆菌L-苏氨酸产量

葡萄糖的有效利用是提高大肠杆菌合成L-苏氨酸能力的关键,作者通过优化葡萄糖转运来提高大肠杆菌L-苏氨酸合成能力。利用CRISPR基因编辑技术在大肠杆菌TWF001中分别敲除了PTS系统关键基因ptsH和ptsG,并在30 g/L葡萄糖质量浓度下进行了摇瓶发酵。与对照菌株TWF001相比,TWF001ΔptsH和TWF001ΔptsG合成L-苏氨酸能力均有明显改善;TWF001ΔptsH L-苏氨酸产量提升38.02%。在TWF001ΔptsH基因组上用trc启动子过表达galP基因,构建了TWF001ΔptsH,Ptrc：：PgalP。对3株突变菌在40、50、60 g/L葡萄糖质量浓度下进行了摇瓶发酵;36 h后TWF001ΔptsH,Ptrc：：PgalP在40 g/L葡萄糖质量浓度时,L-苏氨酸产量达到26.16 g/L,糖酸转化率为0.65 g/g,L-苏氨酸产量提升幅度达42.12%。研究结果说明优化葡萄糖转运可以有效提高大肠杆菌L-苏氨酸合成能力。     

黄色短杆菌YILW生产L-异亮氨酸的发酵工艺研究

本文对L-异亮氨酸产生菌YILW的发酵工艺条件做了研究,确定了其积累L-异亮氨酸的较为适宜的条件。分别研究并确定了其发酵时的最适接种量、最适宜供氧条件、发酵最适温度、最适pH以及最佳菌体浓度等条件。在此条件下,在5L发酵罐上发酵60h,L-异亮氨酸产量达到29.6g/L,糖酸转化率达到21%。     

L-亮氨酸高产菌TGL8207的定向选育及其发酵过程研究

以谷氨酸棒杆菌TG95为出发菌株,通过原生质体紫外诱变、原生质体融合和硫酸二乙酯诱变,定向选育L-亮氨酸产生菌TGL8207.该菌株在未优化条件下摇瓶发酵72 h,产L-亮氨酸27.2 g/L,并且菌株的遗传标记和产酸能力十分稳定.研究了温度、pH和溶氧对菌株TGL8207积累L-亮氨酸的影响.采用10 L罐补料分批发酵64h,L-亮氨酸产量达44.5 g/L,糖酸转化率达22.8%.     

等离子体诱变凝结芽孢杆菌提高木糖利用能力高产L-乳酸

为进一步提高凝结芽孢杆菌发酵木糖生产L-乳酸的产量和转化率,以实验室保存的一株能利用木糖产L-乳酸的野生型凝结芽孢杆菌菌株NL01为出发菌株,通过等离子体诱变育种技术和平板菌落初筛、摇瓶复筛,最终得到一株木糖耐受力强、L-乳酸产量高、遗传特性稳定的正向突变菌株NL-CC-17。该突变菌株是目前已报道的木糖耐受力最高的菌株。当以100 g/L的木糖为底物,50 ℃发酵72 h后,L-乳酸产量达到82.30 g/L,糖酸转化率为92.37%,L-乳酸产量较出发菌株提高21.51%,糖酸转化率提高了16.00%。通过初步优化发酵条件,确定该菌株最佳发酵温度为50 ℃,实验范围内最佳发酵pH值为5.5。     

柠檬酸转运蛋白突变基因在L-亮氨酸发酵中的应用

该研究利用同源重组方法敲除L-亮氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ALDP的柠檬酸合酶基因glt A,并引入柠檬酸转运蛋白突变基因CP_103,获得一株能高效摄取柠檬酸的菌株。在此基础上,比较不同的柠檬酸添加方式对菌株的OD_(600nm)值、L-亮氨酸产量和糖酸转化率的影响。结果表明,通过引入柠檬酸转运蛋白突变基因CP_103,显著提高了C. glutamicum ALDPΔglt A的柠檬酸摄取能力。当初始发酵液中的柠檬酸添加量为5 g/L,并在发酵过程中通过流加的方式维持柠檬酸含量在10～15 g/L范围内,较出发菌株C. glutamicum ALDP,C. glutamicum ALDPΔglt ACP_103的OD_(600nm)值轻微下降,但是L-亮氨酸产量达到最高,为(22.5±1.5)g/L、糖酸转化率为23.1%,分别提高23.0%和48.1%。     

活细胞在线监控L-羟脯氨酸补料发酵工艺的研究

为了研究活细胞在线监控补料技术对L-羟脯氨酸发酵的影响,在30 L发酵罐上安装活细胞在线检测仪,实时监测发酵液中活细胞数量,根据活细胞数量调整补料策略,分析活细胞在线监控补料对L-羟脯氨酸发酵补糖速率、产量、糖酸转化率和代谢流量分布的影响。结果表明,采用活细胞在线监控补料发酵工艺生产L-羟脯氨酸的最佳补糖策略是在发酵中后期及时降低补糖速率,最终降到9 g/(L·h),L-羟脯氨酸产量提高了11.39%,乙酸积累量减少了48.69%,糖酸转化率提高了14.92%,糖酵解途径和乙醛酸循环的代谢流分别减少了8.50%和16.89%,磷酸戊糖途径的代谢流增加了14.73%,乙酸合成的代谢流减少了4.97%,L-羟脯氨酸合成的代谢流提高了16.21%。上述结果说明采用活细胞在线监控补料技术生产L-羟脯氨酸,可以有效降低副产物的积累,提高L-羟脯氨酸产量及糖酸转化率。     

以棉籽饼粉为有机氮源的L-苏氨酸发酵工艺研究

以L-苏氨酸生产菌TRFC为供试菌株，研究确定了罐上棉籽饼粉的最佳用量及过程控制模式。首先分析了棉籽饼粉浓度对苏氨酸流加发酵过程中菌体生长、产物积累以及微生物稳定性的影响，得到适宜的初始棉籽饼粉浓度为3g／L，进一步研究了pH、溶氧等环境条件对L-苏氨酸发酵的影响，确定了最佳控制模式。在最优条件下，采用补料分批发酵工艺，通过10L罐发酵36h，最终产酸可达117．8g／L，糖酸转化率为47．2％。     

敲除aceA和gogat及过表达gltA对谷氨酸棒状杆菌GKGD合成α-酮戊二酸的影响

α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)在生命活动中具有重要的作用,被广泛应用于食品、医药等领域。以α-KG生产菌谷氨酸棒状杆菌GKGD为出发菌株,敲除其异柠檬酸裂解酶编码基因ace A以增加异柠檬酸供应,获得GKGD-1,摇瓶发酵条件下其α-KG产量和转化率分别提高14.72%和9.76%;敲除谷氨酸合酶编码基因gogat以降低L-谷氨酸生成量,获得GKGD-2,其α-KG产量和转化率分别提高7.39%和5.43%,L-谷氨酸生成量降低52.87%;过表达柠檬酸合酶编码基因glt A以进一步增加前体物供应,获得GKGD-3,其α-KG产量提高35.9%;于7.5 L发酵罐经30 h发酵,GKGD-3α-KG产量达49.5 g/L,较出发菌株提高36.4%,L-谷氨酸生成量降低50%。敲除ace A和gogat并过表达glt A可显著提高α-KG产量并降低L-谷氨酸生成量。     

谷氨酸高产菌GDK-9的定向选育及其发酵过程研究

以天津短杆菌GDK6为出发菌株,通过原生质体紫外诱变、紫外诱变和硫酸二乙酯(DES)诱变定向选育L-谷氨酸生产菌。经摇管初筛、摇瓶复筛、遗传标记验证、单菌落分离和连续传代,最终筛选出1株L-谷氨酸高产菌GDK-9。该菌株在未优化条件下摇瓶发酵42h产L-谷氨酸79.2g/L。另外,试验结果证实GDK-9菌株的遗传标记和产酸能力十分稳定。在优化条件下,通过7L罐发酵32h,谷氨酸产量达131.5g/L,糖酸转化率达到62.2%。     

IPTG添加时机对大肠杆菌产α-酮基丁酸的影响

探究IPTG不同添加时间对大肠杆菌Escherichia coli THRD/pWSK29-ilvA发酵生产α-酮基丁酸菌体生长、产酸、代谢副产物和耗糖的影响.摇瓶发酵结果表明:在菌体处于对数生长中后期,菌体OD600值为10～15时,添加IPTG进行诱导,菌体生物量相对较高为6.5 g/L,α-酮基丁酸积累量最高达到16 g/L,同时糖酸转化率较其他诱导时间高,且副产物乙酸含量明显降低.利用7.5L发酵罐对此诱导条件进行发酵验证,α-酮基丁酸质量浓度为22 g/L,高于已有报道中8 g/L的生产水平.     

稀土元素对L-酪氨酸发酵的影响研究

目前工业上主要采取微生物发酵法生产L-酪氨酸，此工艺存在生产周期长、糖酸转化率低等问题。因此，该研究以发酵过程中菌体量、L-酪氨酸产量、糖酸转换率以及耗糖速率为指标，通过单因素实验和正交实验探究La³⁺、Ce³⁺、Nd³⁺对L-酪氨酸发酵的影响并最终确定了稀土元素的添加组合，提高了菌体的活力，缩短了延滞期，延长了产酸高峰期。实验结果表明，向L-酪氨酸发酵培养基中添加80 mg/L La³⁺、2 mg/L Ce³⁺、0.3 mg/L Nd³⁺对发酵有利。发酵耗时35 h,缩短了2.2%;最高菌体量达到80.3,提升了10.8%;产酸量达到55.7 g/L,提升了9.7%;糖酸转化率为23.4%,提升了6.4%。验证了添加稀土元素的可行性，为L-酪氨酸大规模工业化生产提供了依据。