食源性沙门氏菌实时定量PCR检测研究

根据GenBank数据库鼠伤寒沙门氏菌的invA基因序列(AE008832)设计引物,建立沙门氏菌实时荧光定量PCR检测方法。标准曲线的相关系数为0.999,检出底限约8个细菌/反应。对40份牛奶和40份生肉进行检测,阳性率分别为2.5%和5%,与传统细菌分离检测结果完全相符。因此,实时定量PCR检测沙门氏菌具有快速、灵敏的优点,适宜于食品中沙门氏菌污染的调查及监测。     

食源性沙门氏菌实时定量PCR检测研究

根据GenBank数据库鼠伤寒沙门氏菌的invA基因序列(AE008832)设计引物,建立沙门氏菌实时荧光定量PCR检测方法。标准曲线的相关系数为0.999,检出底限约8个细菌/反应。对40份牛奶和40份生肉进行检测,阳性率分别为2.5%和5%,与传统细菌分离检测结果完全相符。因此,实时定量PCR检测沙门氏菌具有快速、灵敏的优点,适宜于食品中沙门氏菌污染的调查及监测。      

实时荧光PCR法检测食品中亚利桑那沙门氏菌

沙门氏菌（Salmonella）是食品检测过程中最常见的致病菌之一,亚利桑那沙门氏菌（Salmonella arizonae）又是沙门氏菌中比 较难鉴定的亚种。该实验通过实时荧光聚合酶链式反应（PCR）方法快速准确的检测亚利桑那沙门氏菌和其他沙门氏菌。根据GenBank 公布的亚利桑那沙门氏菌和其他沙门氏菌gud D基因序列, 分别设计引物和Taqman探针。 使用10株不同血清型的沙门氏菌标准菌 株、88株沙门氏菌分离株和29株食品中常见食源性致病菌进行实时荧光PCR特异性实验。结果显示,该实验所设计的引物探针特异 性非常好。 实时荧光PCR灵敏性试验结果表明,检测灵敏度可达到1～10 CFU/mL的添加浓度。 经模拟污染样品验证,所建立的实时 荧光PCR方法与传统方法的检测结果相一致,具有检测周期短、操作简便的优势。     

预包装柳州螺蛳粉沙门氏菌实时荧光PCR快速检测

目的建立实时荧光PCR法快速检测预包装柳州螺蛳粉中沙门氏菌的分析方法。方法根据沙门氏菌invA基因设计引物和探针,优化反应体系中的探针浓度后对人工添加沙门氏菌和干扰菌模拟受污染的预包装柳州螺蛳粉样品进行检测。结果设计的引物和探针只对阳性菌株有荧光反应,具有良好的特异性,最佳反应探针终浓度为0.2μmol/L,检测灵敏度为100CFU/mL,扩增效率103.92%;对模拟污染的预包装柳州螺蛳粉经过一步增菌18 h后最低能检测出4 CFU/25 g沙门氏菌。结论实时荧光PCR检测灵敏度高、特异性强,可应用于预包装柳州螺蛳粉中沙门氏菌的快速高效检测。     

运用实时荧光PCR法辅助鉴定能力验证样品中的沙门氏菌

目的运用实时荧光PCR法辅助鉴定能力验证样品中的沙门氏菌,以提高检验准确度。方法采用传统的增菌、选择性培养、生化鉴定方法进行样品检验,实时荧光PCR法作为辅助手段对BPW增菌液及可疑菌落进行扩增,最后用API20E鉴定系统对可疑菌落进行确认。结果 3个样品经增菌、选择性培养、生化鉴定后均无显著符合沙门氏菌菌落特征及生化特征的可疑菌落;缓冲蛋白胨水增菌液实时荧光PCR法扩增结果表明样品S02为可疑样品,其分离得到的菌落S02-4有典型扩增曲线;经API20E鉴定系统确认,样品S02为阳性样品,阳性菌为猪霍乱沙门氏菌亚利桑那亚种。结论实时荧光PCR法操作简单,准确度高,可作为传统检验方法的有效补充。     

TaqMan实时荧光PCR对沙门氏菌能力验证样品的快速检测与鉴定

本研究依据GB 4789.4-2016标准对沙门氏菌ACAS-PT526能力验证样品进行常规培养法检测,同时使用TaqMan实时荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术对预增菌培养物进行快速检测和鉴定。本研究首先以沙门氏菌特异性基因hut基因为靶基因,设计合成特异性引物和探针,提取各类食源性菌种的核酸DNA进行实时荧光PCR反应,仅沙门氏菌属出现阳性扩增,非沙门氏菌属、阴性对照和空白对照均无扩增信号,验证设计合成的引物探针具有较高的特异性。其次将能力验证样品和加标样品经预增菌、增菌、分离、纯化、生化试验和血清学鉴定,同时将预增菌培养物经实时荧光PCR测定后,18-D319和加标样品有显著的S型扩增曲线,Ct值分别为24.34和26.21,为沙门氏菌阳性,18-M906无显著荧光信号,Ct值>40.00,为沙门氏菌阴性。经API20E试剂条鉴定,18-D319为猪霍乱沙门菌亚利桑那亚种,鉴定百分率为99.90%,T值为0.97,18-M906为大肠埃希氏菌,鉴定百分率为99.80%,T值为0.94。实时荧光PCR检测结果与常规培养法检测结果一致,且更为简单快速,从预增菌到结果判定仅需12 h,结果准确度高,一批次可检测多个样品,可用于大量样品中沙门氏菌的快速筛查和对能力验证样品的检测验证。     

实时荧光PCR法检测鼠伤寒沙门氏菌

目的 建立实时荧光PCR法检测鼠伤寒沙门氏菌的方法。方法 基于鼠伤寒沙门氏菌II型限制酶基因, 设计引物及Taqman探针, 利用实时荧光PCR进行特异性、灵敏性及模拟样品的检测实验。结果 特异性探针可从25种血清型沙门氏菌(共49株)及11株阴性对照菌株中检测出全部的11株鼠伤寒沙门氏菌。以鼠伤寒沙门氏菌梯度稀释菌液DNA为模板进行实时荧光PCR实验, 菌株模板浓度与Ct值呈良好线性关系, 线性系数(R2)为0.998, 扩增效率90%, 最低检测浓度300 cfu/mL。对已接种鼠伤寒沙门氏菌的4种模拟样品同时进行实时荧光PCR检测和传统方法鉴定, 两者结果一致。结论 此方法特异、灵敏、准确, 适于食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测。     

免疫磁珠分离-实时荧光PCR快速检测虾中沙门氏菌

建立了免疫磁珠分离(Immunomagnetic separation,IMS)联合实时荧光PCR(real time PCR)快速、灵敏地检测虾中沙门氏菌的方法。用纳米磁珠与抗沙门氏菌多克隆抗体制备免疫磁珠,优化反应条件,建立IMS方法。同时针对沙门氏菌ttr基因合成探针和引物,构建real time PCR体系,选4株代表性的沙门氏菌检测其特异性和灵敏度。结果显示,免疫磁珠的最适添加量为100μL,免疫磁珠与样品菌液的最佳反应时间为30 min。建立的免疫磁珠分离-实时荧光PCR(IMS-real time PCR)方法特异性高,对于虾中沙门氏菌的检测限为鼠伤寒沙门氏菌5×10~1 CFU/25 g,猪霍乱沙门氏菌5×10~2 CFU/25 g,肠炎沙门氏菌和甲型副伤寒沙门氏菌1×10~2CFU/25 g,检测全程可在6 h内完成。对40份实际样品,IMS-real time PCR方法与国标法检测结果完全一致。建立的IMS-Real time PCR方法用时短、灵敏度高,为水产品中沙门氏菌的快速检测提供了技术支撑,对沙门氏菌引起的食源性疾病的预防和控制具有现实意义。     

免疫磁捕获-实时荧光PCR快速检测鸡肉中沙门氏菌

对免疫磁捕获-实时荧光PCR检测鸡肉中沙门氏菌进行了初步研究。主要包括免疫磁珠制备条件的选择及优化,通过实验最终确定了以6 mg/mL EDC和5 mg/mL NHS活化直径为700 nm的羧基聚苯乙烯磁性微球,与浓度为100μg/mL的沙门氏菌抗体在37℃振荡孵育1.5 h,制备得到抗沙门氏菌免疫磁珠,与市售沙门氏菌免疫磁珠试剂盒(Dynal产品)捕获效率相当。免疫磁捕获-实时荧光PCR检测方法检测限为104 CFU/mL左右,能在16 h内检测出鸡肉中104 CFU/mL的沙门氏菌,可用于食品中沙门氏菌的快速检测。     

实时荧光PCR检测食品中丙型副伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌

建立实时荧光PCR检测丙型副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi C/Salmonella paratyphi C)和猪霍乱沙门氏菌(S.Choleraesuis/Salmonella Choleraesuis)的方法。根据GenBank公布的丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门氏菌序列,分别设计引物和Taqman探针,使用168株不同血清型的沙门氏菌和21株变形杆菌等非沙门氏菌进行实时荧光PCR检测的特异性试验,可以实现特异性检测丙型副伤寒沙门氏菌,并且可以同时检测丙型副伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌。经模拟污染样品检测,灵敏度可达到2～5 cfu/mL的添加浓度。该方法可以快速检测食品中丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门氏菌。     

牛奶样品中志贺氏菌的快速PCR检测技术研究

建立牛奶中快速检测志贺氏菌的有效方法。根据GenBank公布的志贺氏菌ipaH基因的保守序列设计特异性引物,筛选合适的DNA模板制备方法,采用快速常规PCR和定量实时PCR结合,对培养液中及牛奶阳性样品中的志贺氏菌进行检测,检测敏感度可达到2CFU/ml,检出时间小于20h。新建的PCR方法具有特异性好,灵敏度高等特点,适用于快速、准确检测牛奶中志贺氏菌的需要。     

应用PCR技术检测猪肉中沙门氏菌的研究

用聚合酶链式反应(PCR)技术检测猪肉中沙门氏菌,对已知和未知被沙门氏菌污染的猪肉的培养物均能准确检测;取不同稀释度的样品进行PCR扩增,当DNA含量只有0.01pg时,还能扩增出条带,说明本方法对检测猪肉中沙门氏菌具有特异性高且灵敏、快速等特点,适用于快速、准确地检测猪肉中沙门氏菌的需要。     

聚合酶链反应检测食品中的沙门氏菌

参考沙门氏菌侵袭性基因invA的序列,设计合成一对引物扩增其中一段序列,建立了特异性检测沙门氏菌的PCR方法。引物两端分别加了Bam HI和EcoR I切点,扩增片段大小为300bp。对收集的50个血清型123株沙门氏菌及7种23株非沙门氏菌进行PCR检测,结果仅沙门氏菌有300bp的扩增产物,显示了很强的特异性,为下一步克隆而设计的两个酶切位点对引物的特异性没有影响。经琼脂糖凝胶电泳,PCR的检出极限是10pg染色体DNA和10~2 cfu的细菌。将扩增产物经slot—blot与辣根过氧化物酶(HRP)直接标记的invA基因探针杂交,经增强型化学发光反应(ECL)及化学发光自显影(CPD)检测,可提高检测的敏感性一个数量级,同时增加了特异性。为推广应用,本文试验了8种模拟食品样品对PCR反应的影响,结果除奶酪外,其余都得到较好扩增。对120份污水及食品样品进行检测,该检测系统检出70份阳性结果,检出率高于常规分离。初步应用显示,PCR检测方法敏感、特异、简便、快速,适合于食品卫生检验和临床标本检验的现场应用。     

食品中沙门菌PCR检测方法的建立

为建立食品中快速检测沙门菌的PCR方法。选取沙门菌属侵袭性抗原保守基因invA基因上的靶序列设计一对引物,选择最适Mg 浓度和退火温度,建立最适PCR反应体系,用2%琼脂糖,5μl反应产物(包括EB),100V,40min进行电泳,显像。用该引物对已经传统方法鉴定的22种77株沙门菌和24种24株非沙门菌进行特异性检测,并对人工污染的食品进行检测条件的研究。Mg 浓度和退火温度对该反应体系的影响较小,稳定性较好;经传统方法鉴定的22种77株沙门菌和24种24株非沙门菌验证了该检验方法具有很好的特异性;该检测方法可以在19h内检出含有沙门菌102CFUg的食品(火腿肠、鸡蛋、散装肉馅)。与传统方法比较,该方法快速、敏感、特异,能在较短的时间内对大量样品同时进行检测,适用于食品中沙门菌的快速、敏感、特异检测。     

食品过敏原胡桃PCR检测方法研究

胡桃是坚果类食品中能引起过敏反应的主要食品之一.根据胡桃叶绿体成熟酶K基因(matK)设计特异引物WAL Ⅰ/WAL Ⅱ,建立检测胡桃成分的PCR方法.该引物能够在胡桃和美洲山核桃中扩增出长度为120bp的目的片段,再通过限制性内切酶Bfa Ⅰ时扩增产物进行酶切,可有效区分胡桃和美洲山核桃.食品添加试验表明,该方法对食品中胡桃成分的检测限为0.01%(质量分数),故适于分析食品中的胡桃成分.     

乳粉中阪琦肠杆菌的PCR检测

针对我国食品进出口和生产卫生的需要,使用以16 S rRNA基因为靶序列设计合成了一对可扩增282 bp的目的片段的引物,建立了检测阪琦肠杆菌的PCR方法.结果表明,阪琦肠杆菌PCR产物有282 bp的特异性片段,而金黄色葡萄球菌无此目的条带,证实该引物具有特异性.该方法快速、可靠、灵敏,特异性强,可用于食品中阪琦肠杆菌的检测.     

G-四联体与聚合酶链式反应联用可视化检测沙门氏菌

建立对沙门氏菌的G-四联体与聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）联用可视化检测方法。以沙门氏菌属特异性基因invH为检测目标,设计5’端含有G-四联体互补序列的上下游引物,通过PCR的特异性识别并扩增目标序列,获得大量含G-四联体的双链DNA,变性后与氯高铁血红素结合生成具有过氧化物酶活性的模拟酶（DNAzyme）,并催化H2O2与2,2’-联氮-双(3-乙基-苯并噻唑琳-6-磺酸)二胺盐由无色变为绿色,实现G-四联体与PCR联用对沙门氏菌的可视化检测。在优化的检测体系下,沙门氏菌基因组的质量浓度对数与421 nm处的吸光度具有良好的线性关系,其回归方程为y=0.129 9x＋0.217 9,R2=0.994 5,线性范围0.07～771.6 ng/μL,灵敏度为0.07 ng/μL。特异性分析表明：此方法适用于沙门氏菌属的检测,可成功应用于人工污染沙门氏菌牛奶的检测,检出限为1.2×102 CFU/mL。通过检测30 种市售样品,发现其结果与国标检测方法结果一致。本研究为食源性致病菌的检测提供了新的策略。     

Quantitative Detection ofVibrio vulnificus in Shellfish by Competitive Polymerase Chain Reaction

Quantitative detection of V. vulnificus in shellfish via competitive PCR was herein developed. We designed a forward primer, a reverse primer and a hybrid forward primer based on the V. vulnificus specific hemolysin gene (vvh), which was used to amplify target DNA and an internal competitive PCR standard. The specificity of the primers for V. vulnificus was proven by gel electrophoresis. The detection sensitivity for V. vulnificus was 220 CFU per PCR reaction with cells from a pure culture and 270 CFU/g of tissue without enrichment. After 10 hours of enrichment at 37° C the minimum detection level was reduced to 7 CFU/g of tissue.     

Quantitative Detection ofVibrio vulnificus in Shellfish by Competitive Polymerase Chain Reaction

Quantitative detection of V. vulnificus in shellfish via competitive PCR was herein developed. We designed a forward primer, a reverse primer and a hybrid forward primer based on the V. vulnificus specific hemolysin gene (vvh), which was used to amplify target DNA and an internal competitive PCR standard. The specificity of the primers for V. vulnificus was proven by gel electrophoresis. The detection sensitivity for V. vulnificus was 220 CFU per PCR reaction with cells from a pure culture and 270 CFU/g of tissue without enrichment. After 10 hours of enrichment at 37° C the minimum detection level was reduced to 7 CFU/g of tissue.     

PCR法检测肉鸭屠宰加工生产链中沙门氏菌的污染

为建立肉鸭加工中快速、准确的沙门氏菌PCR 检测方法,并应用于肉鸭屠宰生产加工链沙门氏菌的实时监测。采用Primer Premier 5.0 软件针对沙门氏菌特有的fimY 基因设计合成一对引物5′- GCATTCCGCTCATTAGAT-3′和5′-TGGAGGCTGATAACAAGG-3′,并对沙门氏菌DNA 扩增PCR 体系的退火温度、引物浓度、Mg2+ 浓度和聚合酶浓度进行优化。结果表明：成功扩增出沙门氏菌标准株和分离株的2 7 5b p 目的片段,灵敏度达到了1.2pg;应用建立的PCR 方法对国内某典型肉鸭屠宰厂的肉鸭屠宰链环节进行沙门氏菌污染的检测,发现在屠宰环境、拔毛浸烫水、浸蜡冷却水、清洗池水、宰前毛、食道、粪便和沥水体腔内共有25 个样品中扩增出了275bp大小的特异性片段,而空白对照无扩增条带。