牛奶样品中志贺氏菌的快速PCR检测技术研究

建立牛奶中快速检测志贺氏菌的有效方法。根据GenBank公布的志贺氏菌ipaH基因的保守序列设计特异性引物,筛选合适的DNA模板制备方法,采用快速常规PCR和定量实时PCR结合,对培养液中及牛奶阳性样品中的志贺氏菌进行检测,检测敏感度可达到2CFU/ml,检出时间小于20h。新建的PCR方法具有特异性好,灵敏度高等特点,适用于快速、准确检测牛奶中志贺氏菌的需要。     

蛋制品中沙门氏菌的PCR及实时荧光PCR检测方法

研究针对蛋制品中沙门氏菌的检测开发了一种快速灵敏的PCR检测方法。研究方法采用煮沸法提取样品DNA,运用PCR方法筛查样品中的沙门氏菌基因成分。根据沙门氏菌基因组中的保守序列设计特异性引物与探针,PCR扩增结果表明,阳性样品扩增获得的序列与Genebank中沙门氏菌的基因序列完全匹配。采用实时PCR检测方法可检出浓度低至1.57×10-5μg.μL-1的沙门氏菌DNA,检测时间少于24 h,对比常规的微生物培养方法,该方法显著地提高了检测速度。研究方法具有特异性强、灵敏度高等优点,可以广泛应用于蛋制品及相关食品中沙门氏菌的高通量筛查检测。     

猪肉中沙门氏菌的PCR检测

选用合适的引物,利用PCR快速扩增反应检测猪肉中的沙门氏菌.根据沙门氏菌的Fimy基因设计一对引物,对不同血清型的沙门氏菌和非沙门氏菌进行PCR检测,沙门氏菌均能检测出特异条带,而非沙门氏菌无一能检测出特异条带.将沙门氏菌和非沙门氏菌混合培养,对混合培养物提取DNA模板进行检测,结果呈阳性,而不含沙门氏菌的混合培养物则没有特异条带;对模板进行梯度稀释后PCR扩增检测,当DNA含量只有0.045 ng/μL时仍能扩增出条带,将菌液进行梯度稀释后提取DNA模板,沙门氏菌含量在102cfu/mL时能被检测出来.     

FTA滤膜与多重PCR结合检测肉中3种食源性致病菌

采用FTA滤膜从肉中直接提取模板DNA,根据金黄色葡萄球菌的nuc基因、沙门氏菌的IpaB基因、福氏志贺氏菌的ipaH基因设计3对特异性引物,进行多重PCR检测.结果表明,3对引物能特异性扩增出210、280、393bp大小的目的条带;在不增菌的情况下,多重PCR同时检测肉中3种致病菌的灵敏度均为102 cfu/g,检测时间6 h.该检测方法准确、快速、高效,为同时检测肉中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、福氏志贺氏菌奠定了基础.     

3种血清型沙门氏菌多重PCR检测方法的建立

目的建立多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction,mPCR)法检测3种常见血清型沙门氏菌的分析方法。方法以肠炎沙门氏菌Hat基因、鼠伤寒沙门氏菌Stm-4495基因、乙型副伤寒沙门氏菌sdfI基因设计合成特异性引物,提取沙门氏菌基因组DNA为扩增模板,验证引物特异性,优化多重PCR退火温度及引物浓度,检测方法特异性及检出限,并利用该方法对人工污染冷鲜鸡肉进行检测。结果 3对引物特异性强且无交叉影响;25μL多重反应体系中,引物STM、HAT、SDF最佳终浓度分别为:0.5、0.5、0.4μmol/L,最佳退火温度为60℃;11株阴性对照菌无目标条带检出,方法特异性良好,以3种血清型沙门氏菌纯培养物DNA混合物为模板,检出限低至DNA质量浓度1 pg/μL;人工污染鸡肉经过12 h增菌,能同时检测出3种血清型沙门氏菌的检测限为:肠炎沙门氏菌(4.0±1.0) CFU/g、鼠伤寒沙门氏菌(8.0±0.9) CFU/g、乙型副伤寒沙门氏菌(8.0±0.6) CFU/g。结论本方法特异性强、检测限低,对食品中3种常见血清型沙门氏菌快速检测具有重要意义。     

NDM-1基因TaqMAN实时荧光PCR检测方法的建立

研究初步建立了NDM-1基因的实时荧光PCR快速检测鉴定方法。研究根据NDM-1序列,设计并合成了PCR检测引物(ND-T-F和ND-T-R)和探针(ND-T-PROBE),对NDM-1质粒DNA和其他11个标准菌株进行了实时荧光PCR检测。结果表明,携有NDM-1基因的质粒DNA模板都出现了很强的特异信号,而其他对照病菌均未出现特异荧光信号,证明这套引物及探针具有NDM-1基因检测的特异性。灵敏度测定结果,此体系可检出10fg/μL质粒DNA模板。研究表明,TaqMAN实时荧光PCR方法是一种特异、灵敏、快速的NDM-1基因检测方法。     

绝对定量PCR快速检测豆豉沙门菌

根据沙门氏菌16srDNA序列设计PCR引物,通过比较3种不同的基因组DNA提取方法,提取待检样品总DNA,进行多基因定量PCR检测.结果表明,该方法简单快速且灵敏度高,在豆豉中的检测灵敏度可达10 cfu/g,整个检测时间在4h以内.说明本方法对检测豆豉中沙门氏菌具有特异性高、灵敏、快速等特点,适用于快速、准确地检测豆豉中沙门氏菌的需要.     

NDM-1基因新型染料EverGreen实时荧光PCR检测方法的建立

研究初步建立了NDM-1基因的实时荧光PCR快速检测鉴定方法。研究根据超级细菌NDM-1序列,设计并合成了检测引物(ND-E-F和ND-E-R),对NDM-1质粒DNA和其他11个标准菌株进行了EVERGREEN实时荧光PCR检测。结果表明,携有NDM-1基因的质粒DNA模板都出现了很强的特异信号,而其他对照病菌均未出现特异荧光信号,证明这套引物及探针具有NDM-1基因检测的特异性。灵敏度测定结果,此体系可检出10fg/μL质粒DNA模板。研究表明,EverGreen实时荧光PCR方法是一种特异、灵敏、快速的NDM-1基因检测方法。     

添加扩增内标的PCR方法快速检测食品中的沙门氏菌

为了建立一种含扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法,以细菌16S r RNA为扩增内标对照,以沙门氏菌inv A基因为靶基因设计了一对引物,并优化了PCR反应体系。通过对20种细菌进行PCR检测显示,该方法对沙门氏菌具有良好的特异性。灵敏度实验表明,该检测方法对沙门氏菌纯DNA模板的检测灵敏度为61.1 fg/μL,对沙门氏菌纯培养物的检测灵敏度为2×102 cfu/m L。对人工污染蛋清的检测实验显示,沙门氏菌接种量为2 cfu/25 m L的鸡蛋清样品经过8 h增菌培养后,可被该方法检出。结果表明,该检测方法特异性强、灵敏度高,能排除沙门氏菌PCR检测方法中可能出现的假阴性现象,适用于鸡蛋等食品中沙门氏菌的快速检测。     

肉制品中沙门氏菌invA基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

针对沙门氏菌invA基因设计一对特异引物,建立SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法,并进行特异性、敏感性、重复性检测.结果表明,所建立的沙门氏菌实时荧光定量PCR检测方法,特异性良好,组间组内重复性良好,沙门氏菌检测下线为101CFU/mL.本研究建立了沙门氏菌特异、敏感、快速的实时荧光定量PCR检测方法,为沙门氏菌的快速诊断奠定了基础.     

PCR及其改进技术在食品检测中的应用

在介绍传统PCR的基础上,简介实时定量PCR、多重PCR、PCR—DGGE等几种常用的PCR改进技术在食品检测方面的应用。     

啤酒有害菌的PCR检测和SYBR Green实时PCR定量

啤酒有害菌是一些能在啤酒中存活并使啤酒的外观和风味发生改变的细菌,对其进行快速检测和定量是啤酒生产急待解决的问题。我们从华润雪花啤酒（中国）有限公司各工厂提供的样品中分离到28株啤酒有害菌,16S rDNA序列的系统进化分析表明,其中26个菌株属于乳杆菌属（Lactobacillus spp．）、1个菌株为明串珠菌属（Leuconostoc spp．）,1个菌株为片球菌属（Pediococcu sp．）。根据酒花（hop）抗性基因horA、horB和horC的保守序列设计了扩增这3个基因的PCR引物,用这些引物对28株啤酒有害菌进行了常规PCR检测,检出率分别为89％、79％和75％,用hor A—horC双引物进行检测,检出率为100％。用SYBR Green实时定量PCR技术,以horA基因为靶序列,建立了对啤酒有害菌的细胞数进行快速定量的新方法,用该方法测定的污染啤酒样品中有害菌的浓度与平板培养法相近。     

奶粉中阪崎肠杆菌PCR和荧光PCR检测方法的研究

建立了奶粉中可致婴幼儿高死亡率的阪崎肠杆菌的PCR和荧光PCR检测方法。利用细菌16S和23SrDNA的保守区设计通用引物,对6株阪崎肠杆菌16S-23SrDNA间区序列(ITS)进行扩增和测序,在比对阪崎肠杆菌ITS序列的基础上,设计了11条PCR和荧光PCR检测引物,组合成30对PCR引物,并筛选出一对种特异性引物,建立了奶粉中阪崎肠杆菌PCR和荧光PCR检测方法。用10株阪崎肠杆菌,18株近源菌株验证实验表明,本文所建立的PCR和荧光PCR方法特异性强;加菌实验表明,奶粉样品中阪崎肠杆菌检测低限为(2.2～5.4)CFU/100g,灵敏度高;新建的PCR和荧光PCR方法与FDABAM(美国食品及药品管理局微生物分析手册)方法比对实验表明,三种方法的检测结果完全一致。由于PCR和荧光PCR检测方法快速、可靠,因此可替代传统检验方法。     

PCR快速检测在啤酒工厂的应用

啤酒有害茵是一些能在啤酒中存活并使啤酒的外观和风味发生改变的细菌,对其进行快速、正确的检测是啤酒工厂急待解决的问题。微生物平皿培养法存在时间长及不易辨识的缺点。本文介绍了PCR用于纯生啤酒出厂检测及有害茵污染点分析两个应用实例。期望通过PCR检测技术拓展微生物检测思路,为啤酒行业同行抛砖引玉。