鲫鱼卵唾液酸糖蛋白化学结构分析及对前成骨细胞MC3T3-E1增殖分化的影响

目的：成熟的鲫鱼卵经提取、分离纯化得到唾液酸糖蛋白（sialyglycoproteins of Carassius auratus eggs,CA-SGP）,分析其化学结构,及对前成骨细胞MC3T3-E1增殖分化的影响。方法：采用水提法从成熟鲫鱼卵中提取水溶性蛋白,经阴离子交换色谱、凝胶过滤色谱分离纯化鲫鱼卵水溶性蛋白得到CA-SGP,测定其基本组成,采用高效凝胶液相色谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其分子质量和纯度,PMP柱前衍生高效液相色谱法测定其单糖组成;采用噻唑蓝法测定MC3T3-E1细胞的增殖率,酶联免疫法测定Ⅰ型胶原蛋白（collagen type Ⅰ,COLⅠ）和骨钙素（osteocalcin,OCN）的分泌量及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）的活性,茜素红染色法测定矿化结节的数量。结果：得到单一的组分CA-SGP,在高效凝胶过滤色谱色谱图上呈现单一的糖和蛋白的检测重叠峰,在凝胶电泳图上呈现单一弥散性条带,其蛋白质含量为14.33%,己糖含量为62.81%,N-乙酰神经氨酸（N-acetylneurainic acid,Neu5Ac）含量为19.72%。单糖组成测定结果显示：CA-SGP主要由甘露糖、葡萄糖胺、半乳糖胺组成,其物质的量比为7.61∶6.70∶1.00;MC3T3-E1细胞与CA-SGP共同孵育后,其增殖率显著增加,COLⅠ和OCN的分泌量分别增加了39.28%和83.06%,ALP活性提高了285.08%,矿化结节的数量增加了96.41%,说明CA-SGP显著促进MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化。结论：CA-SGP为富含Neu5Ac的糖蛋白,具有显著促进MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化的作用,对开发抗骨质疏松功能性食品具有重要意义。     

罗非鱼鱼鳞胶原蛋白水解物对成骨细胞MC3T3-E1增殖分化的影响

目的:研究罗非鱼鱼鳞胶原蛋白水解物(tilapia fish scale collagen hydrolysate,FH)对小鼠成骨细胞前体细胞MC3T3-E1的增殖和分化的影响。方法:采用噻唑蓝法测定MC3T3-E1细胞的增殖率,用p-nitrophenyl phosphate(p-NPP)法测碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)的活性,Elisa酶联免疫法检测Ⅰ型胶原蛋白(Collagen type Ⅰ,Col Ⅰ)和骨钙素(Osteocalcin,OCN)的分泌量,茜素红染色法测定细胞外基质矿化结节的数量。结果:与空白对照组相比,FH对细胞的增殖性没有显著的促进作用,但是可以显著提高细胞ALP活性,促进Col Ⅰ和OCN的分泌。此外,FH可以促进细胞矿化结节的生成。结论:FH通过促进成骨细胞MC3T3-E1分化和矿化来提高骨的形成,对开发抗骨质疏松症和骨关节炎等疾病的功能性食品有重要的意义。     

鲫鱼卵唾液酸糖肽对成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化、矿化及OPG/RANKL基因表达的影响

目的:研究鲫鱼卵唾液酸糖肽(Ca-SGPP)对成骨细胞MC3T3-E1骨形成活性及OPG/RANKL基因表达水平的影响。方法:在MC3T3-E1细胞中加入不同浓度的Ca-SGPP,采用MTT法、试剂盒和茜素红染色法检测Ca-SGPP对MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化的影响;利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测MC3T3-E1细胞骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、骨保护素(OPG)及核因子κB受体活化因子配体(RANKL)基因m RNA表达水平。结果:Ca-SGPP可显著促进MC3T3-E1细胞增殖及ALP、OCN和COL I的分泌,提高MC3T3-E1细胞矿化能力,上调其BMP-2表达水平及OPG/RANKL的比值,且分子质量大的糖肽效果更佳。结论 :CaSGPP具有促进MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化的能力,其机制可能与OPG/RANKL比值上调有关。     

虾肽对MC3T3-E1成骨细胞增殖、分化及矿化的影响

目的:从红虾副产物中提取虾肽,研究其促MC3T3-E1成骨细胞增殖、分化及矿化的活性。方法:用MTT法检测不同浓度虾肽对MC3T3-E1成骨细胞存活率的影响;诱导成骨细胞分化,在3 d和7 d时,测定其碱性磷酸酶(ALP)活性,在7 d和14 d时,测定其细胞骨钙素(OCN)及I型胶原蛋白(COL-I)含量,21 d时茜素红染色测定细胞诱导培养矿化程度;采用qPCR和Western blot方法检测虾肽对OPG/RANKL/RANK信号通路中骨形成关键基因和蛋白OPG、RANKL以及RUNX2表达的影响。结果:虾肽质量浓度为0.02,0.05,0.1 mg/mL时,显著促进MC3T3-E1细胞的增殖;ALP、OCN及COL-I的含量相较于对照组均增加,矿化结节面积显著增大(P < 0.05);此外,虾肽上调了ALP、OCN、COL-I基因的表达,促进OPG和RUNX2基因及蛋白表达的水平,抑制RANKL基因及蛋白表达的水平。结论:虾肽能促进MC3T3-E1成骨细胞增殖分化与矿化,激活OPG/RANKL/RANK信号通路,从而促进成骨细胞的分化及骨形成。     

鲫鱼卵唾液酸糖蛋白制备工艺优化及其促骨形成作用研究

以14种水产动物卵为原料,筛选出具有较高促前成骨MC3T3-E1细胞增殖活性的鲫鱼卵水溶性糖蛋白,采用响应面法优化了鲫鱼卵唾液酸糖蛋白(Sialoglycoprotein of Carassius auratus eggs,Ca-SGP)的提取工艺,并评价Ca-SGP对MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化的影响。结果表明,14种水产动物卵中,鲫鱼卵糖蛋白唾液酸含量最高,且对MC3T3-E1细胞增殖率最高,分别为5.76%和145.71%;采用单因素和响应面试验优化得到制备Ca-SGP的最优提取工艺为:NaCl浓度为0.38 mol/L、提取时间为4.2 h、液料比为1:3.88 w/v,在此条件下,Neu5Ac得率的预测值为592 mg/100 g,验证值为588.47 mg/100 g。Ca-SGP对骨形成作用的研究结果表明,Ca-SGP显著提高MC3T3-E1细胞增殖至135.56%,显著提高COL I、OCN和OPN的分泌量,分别提高到32.23、261.46和85.89 ng/mL,显著提高成骨细胞矿化能力至241.67%,说明Ca-SGP具有显著促骨形成作用(P<0.05)。以上研究为寻找安全、有效抗骨质疏松功能因子提供新途径。     

鸡蛋黄蛋白质水解产物制备及其对MC3T3-E1细胞增殖分化的影响

鸡蛋黄经脱脂得到蛋黄蛋白质,直接以MC3T3-E1细胞增殖活力为指标,对水解条件进行优化,从而制备蛋黄蛋白质水解产物(egg yolk proteins hydrolysate,EYPH)并对其促MC3T3-E1细胞增殖分化的活性进行研究。结果表明:在对比胰蛋白酶与风味蛋白酶水解过程中,发现单一胰蛋白酶反应得到产物活性最好,胰蛋白酶反应的最佳水解条件为水解时间6 h、水解温度37℃、酶与底物质量比1∶50、p H 8.0。EYPH使MC3T3-E1细胞增殖活力得到提高,为129.89%,细胞周期分析得到S期细胞增加了4.69%,这2个方面证实EYPH对MC3T3-E1细胞的增殖活力有显著的提高。EYPH对MC3T3-E1细胞分化矿化有显著影响,碱性磷酸酶活力提高了9.1%;刺激骨钙素分泌,其含量上升2 mg/mL;形成更多的矿化结节。此外,EYPH还能刺激RUNX2特异性转录因子的基因表达,表达量提高了6.12倍。结果说明EYPH对成骨细胞MC3T3-E1增殖分化有显著的促进作用,因此,EYPH对于抗骨质疏松方面有较好的应用潜力,为开发其功能性食品提供一定的数据参考。     

卵黄高磷蛋白对壳聚糖膜基质上MC3T3-E1细胞增殖的影响

本研究制备了壳聚糖和氧化石墨烯/壳聚糖复合膜,并采用CCK-8法、Annexin V/PI双染法和PI染色检测了蛋黄中提取的卵黄高磷蛋白对MC3T3-E1细胞在该复合膜基质上的生理活动的影响。结果表明:壳聚糖膜对细胞无毒性影响,并通过提高S期细胞所占比例,使MC3T3-E1细胞活性提高了31.92%,抑制细胞凋亡,使凋亡率下降45.78%;氧化石墨烯/壳聚糖膜会提高细胞的凋亡率,氧化石墨烯含量越高,促进凋亡越明显,凋亡率在氧化石墨烯含量为2%时最高,为17.64%;在壳聚糖膜基质上,100 μg/mL卵黄高磷蛋白对MC3T3-E1细胞促进增殖作用最显著(p<0.05),细胞活性提高81.59%,同时降低了细胞的凋亡比例;蛋白浓度为500 μg/mL时,细胞活性下降4.47%,促进了细胞凋亡。综上所述,壳聚糖和低浓度卵黄高磷蛋白均能提高MC3T3-E1细胞的活性。     

响应面法优化龟甲蛋白提取工艺及其对MC3T3-E1细胞增殖活性

目的:优化龟甲蛋白提取工艺,筛选龟甲促成骨细胞（MC3T3-E1）增殖活性组分。方法:以蛋白含量及对MC3T3-E1细胞增殖率为指标筛选龟甲蛋白提取方法;以料液比、提取温度、时间为自变量,龟甲蛋白含量为因变量,进行单因素提取研究,结合响应面试验设计,获得提取龟甲蛋白最佳工艺;通过超滤技术将龟甲蛋白按分子量分为5个不同组分:总提组分（组分1）,Mw>10 kDa组分（组分2）,Mw:3~10 kDa组分（组分3）,Mw:1~3 kDa组分（组分4）,Mw<1 kDa组分（组分5）,CCK8法测定不同浓度龟甲蛋白（12.5、25、50、100、200 μg/mL）及其不同组分对MC3T3-E1细胞增殖率的影响。结果:磁力搅拌方法得到的龟甲蛋白含量最高,且活性最佳,龟甲蛋白最佳提取条件为料液比1:13（g/mL）、提取温度30℃、提取3 h,此条件下测得龟甲蛋白含量为15.16%;龟甲蛋白不同组分均能促进MC3T3-E1前成骨样细胞增殖,并呈浓度依赖性,在浓度为200 μg/mL时,组分1~5对细胞的增殖率分别为20.58%、25.30%、30.24%、37.89%、38.15%,分子量小于1 kDa的组分促MC3T3-E1细胞增殖活性最佳。结论:本研究为龟甲蛋白的制备工艺提供参考,并证明龟甲蛋白及其不同组分均具有较好的促成骨细胞增殖活性,其中分子量小于1 kDa组分对MC3T3-E1细胞增殖的效果最佳。     

桑白皮提取物对破骨细胞 和成骨细胞活性的影响

目的:探究桑白皮提取物对破骨细胞和成骨细胞活性的影响。方法:通过回流提取和大孔树脂、聚酰胺柱层析制备桑白皮的四种提取物(水提物W、醇提物E、纯化提取物R和PA),采用可见分光光度法对不同提取物中的黄酮含量进行测定。采用1α,25-(OH)₂VitD₃诱导兔原代骨髓细胞以获得破骨细胞,诱导培养8 d后进行TRAP染色,通过TRAP+细胞计数考察桑白皮提取物对破骨细胞形成的影响。培养MC3T3-E1 Subclone 14细胞,采用MTT法考察桑白皮提取物对成骨细胞增殖的影响。结果:桑白皮四种提取物中黄酮的含量为:PA(37.23%) > R(26.80%) > E(21.83%) > W(15.38%)。提取物PA(10、20、50 mg/L)、R(20、50 mg/L)、E(10、20 mg/L)和W(20 mg/L)实验组与空白对照组相比,TRAP+细胞个数减少,且具有显著性差异(P<0.01或P<0.05)。MTT法增殖试验结果表明,四种提取物各剂量组均能促进MC3T3-E1 Subclone 14的增殖,与空白组相比具有极显著性差异(P<0.01),且促增殖作用随黄酮含量增加而增强。结论:桑白皮提取物能够抑制破骨细胞的形成,且对成骨细胞的增殖有促进作用,黄酮类化合物可能是桑白皮发挥活性作用的重要成分。     

响应面法优化鹿鞭肽酶解工艺及体外补肾健骨活性分析

目的：确定碱性蛋白酶酶解鹿鞭肽最佳工艺条件,并探究其体外补肾健骨活性。方法：以酶解温度、pH、酶解时间和酶用量为影响因素,水解度为响应指标,在单因素实验的基础上,结合Box-Behnken方法进行响应面试验设计,获得酶解鹿鞭肽的最佳工艺;探究不同浓度的鹿鞭肽对小鼠睾丸间质细胞（TM3）的存活率以及睾酮（Testosterone,T）的分泌影响和对成骨细胞（MC3T3-E1）的存活率、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）活力以及骨钙素（Osteocalcin,OCN）的分泌影响。结果：最佳酶解工艺条件为温度51℃,pH8.7,时间4.1 h,酶用量1300 U/g,此时水解度为40.36%±0.22%;体外活性实验结果表明,TM3细胞不同浓度（25、50、100、200μg/mL）给药组与模型组相比较,均可显著提高细胞存活率和睾酮的分泌（P<0.05）,并在50μg/mL质量浓度下,鹿鞭酶解肽对TM3细胞的T分泌促进作用最强,其分泌量为42.47 ng/mL;MC3T3-E1细胞不同浓度（25、50、100、200μg/mL）给药组与模型组相比较,细胞存活...     

Activities of MC3T3-E1 cells cultured on gamma-irradiated salmon atelocollagen scaffold

We investigated the effect of gamma-irradiation on the activities of MC3T3-E1 cells cultured on gamma-irradiated salmon atelocollagen (SAC) scaffolds. SAC-cultured samples were irradiated at doses of 10, 15, and 25 kGy. Gamma-irradiation had a significant impact on the activities of MC3T3-E1 cells. The proliferation rates and alkaline phosphatase activities of MC3T3-E1 cells increased with gamma-irradiation dose.     

金枪鱼鱼骨活性钙对鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)活力和凋亡作用

目的:以金枪鱼骨为原料,制备柠檬酸-苹果酸钙剂(CMC),研究其对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)的细胞活力、凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法:在小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)培养液中,分别加入高浓度(1 μg/mL)CMC和低浓度(0.1 μg/mL)CMC,利用MTT法检测对MC3T3-E1细胞活力的影响,流式细胞仪检测血清饥饿诱导的细胞凋亡。结果:高浓度和低浓度的钙对MC3T3-E1细胞活力均有显著的促进作用,24 h的高钙组的细胞增长率(9.67%)优于低钙组(8.95%);36 h和48 h后低钙组的增长率分别为14.96%和20.33%,明显优于36 h和48 h作用后的高钙组(6.23%和1.73%),两组细胞凋亡率与空白组比较差异较小,且均显著低于对照组(p<0.01)。结论:CMC高钙组和CMC低钙组在一定浓度范围内,能促进MC3T3-E1细胞活力显著增强,并且改善血清饥饿诱导的成骨前体细胞凋亡。     

发酵巴戟天中多糖、寡糖与蒽醌复配的抗氧化活性研究

目的 研究发酵巴戟天中多糖、寡糖与蒽醌单独及复配后的抗氧化活性。 方法 通过DPPH、羟自由基、超氧自由基的清除率和线虫模型对三种有效组分的抗氧化活性进行测定。 结果 多糖、寡糖与蒽醌单独作用及复配均对活性氧自由基具有清除作用,复配组在中低浓度下清除DPPH自由基和超氧自由基具有协同抗氧化作用;以羟自由基为清除对象时,在高浓度只有蒽醌+寡糖和多糖+寡糖+蒽醌组才存在协同作用。此外,复配组分对线虫的寿命延长和运动行为能力增强作用效果普遍优于单独作用。结论 发酵巴戟天中多糖、寡糖与蒽醌的含量较为丰富,复配后具有良好的抗氧化效果,可为发酵巴戟天的开发提供基础数据。