绿色木霉与黑曲霉固态混菌发酵生产纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶复合酶方法的研究

以绿色木霉（Trichoderma viride）和黑曲霉（Aspergillus niger）诱变菌株为生产菌种,先用绿色木霉菌株在玉米芯等农林废弃物上进行培养,一段时间后再接入黑曲霉进行混菌培养生产纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶复合酶。结果表明其复合酶各酶最大活性条件为：绿色木霉液体种子接种量为80%,黑曲霉麸曲种子的孢子自绿色木霉接种后第6天接入。纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶第10天酶活分别为211IU/g、8038IU/g、355IU/g。     

里氏木霉与黑曲霉混合发酵产纤维素酶的条件优化

为提高纤维素酶酶解秸秆产糖效果,以碱性双氧水处理过的玉米秸秆为发酵基质,进行里氏木霉与黑曲霉混合发酵的研究。通过单因素试验确定黑曲霉延迟接种时间、里氏木霉与黑曲霉接种比例 、发酵时间和固液比4个因素的最优水平。在此基础上,采用Box-Behnken响应面设计对混合发酵产酶条件进行优化,获得最佳产酶条件：黑曲霉延迟接种时间 36h,里氏木霉与黑曲霉接种比例 5:1、发酵时间7d、固液比2:50(m/V)、吐温-80体积分数0.4%、pH 5.0和装液量50mL/250mL。此时,滤纸酶力(FPA)可达1.224 IU/mL,β-葡萄糖苷酶活力(β-GA)可达0.315 IU/mL。采用高效液相色谱法,对最佳条件下的纤维素酶酶解秸秆的水解液进行检测。结果表明,两菌株混合发酵较单菌株发酵的纤维素酶系更加完整,且降解木质纤维素类原料产可发酵性糖的能力增强。     

响应面法优化油茶粕培养里氏木霉酶系活力条件及发酵工艺研究

以油茶粕为底物,对里氏木霉发酵进行培养,研究了油茶粕比例、微晶纤维素添加量、接种量和pH对里氏木霉纤维素酶活力的影响。在单因素实验的基础上,采用响应面分析,优化发酵条件为:油茶粕比例为8. 6%,微晶纤维素添加量为0. 93%,接种量为12. 48%,pH值为4. 9。在该条件下,羧甲基纤维素酶活力为8. 47 U/mL,微晶纤维素酶活力为9. 28 U/mL,纤维二糖酶活力为5. 05 U/mL,滤纸酶活力为5. 44 U/mL。     

绿色木霉与黑曲霉混合发酵产纤维素酶的研究

为提高绿色木霉与黑曲霉混合发酵产纤维素酶的能力,进行了黑曲霉接种时间和混合发酵时间的优化。研究了绿色木霉与黑曲霉4株菌单独发酵及混合发酵产纤维素酶酶活的特点,调整黑曲霉NH11-1的接种时间与绿色木霉NM01进行混合发酵来寻找产酶能力最高的时间点。结果表明,黑曲霉NH11-1推迟48 h接种的混合发酵组产酶效果最佳。最佳混合发酵条件为30 ℃、200 r/min恒温振荡培养5 d,滤纸酶活力（FPA）达到242.80 U/mL,是出发菌黑曲霉NH11-1的2.66倍;β-葡萄糖苷酶活力（β-GA）达到297.35 U/mL,是出发菌绿色木霉NM01的1.94倍;β-GA与FPA的比值为1.22,符合纤维素酶水解天然纤维素的最佳比值范围（0.12～1.50）。     

粗壮脉纹胞菌复合多菌种发酵茶粕产纤维素酶的研究

用粗壮脉纹胞菌分别复合东方伊莎酵母、里氏木霉、绿色木霉、乳酸杆菌固态发酵已去除茶皂素的茶粕,通过测定发酵产物中3种纤维素酶：外切葡聚糖酶（C1）、内切葡聚糖酶（Cx）、β-葡萄糖苷酶（β-G）及总酶滤纸酶（filter paper activity,FPA）的酶活力来探讨其分解粗纤维素的协同作用。粗壮脉纹胞菌和绿色木霉混合发酵产生的C1酶酶活力较粗壮脉纹胞菌单菌发酵提高了51.09%,粗壮脉纹胞菌和绿色木霉复合发酵较单菌发酵延长了其纤维素酶分泌的周期,96 h时FPA酶活力达到2.782 U/g;粗壮脉纹胞菌复合里氏木霉、绿色木霉混合发酵组在发酵10 d后对茶粕粗纤维的最终降解率分别达到了64.19%和61.59%;接种量对单菌和混合菌发酵产纤维素酶影响总体趋势是随着接种量增加酶活力提高,但粗壮脉纹胞菌单菌发酵纤维素酶酶活力在接种量超过9 mL/100 g后开始下降。表明粗壮脉纹胞菌复合里氏木霉、绿色木霉混合发酵降解纤维素具有协同作用。     

重组毕赤酵母发酵产纤维二糖酶

采用含黑曲霉(Aspergillus niger)纤维二糖酶基因的重组毕赤酵母发酵生产纤维二糖酶,对重组酵母的基因表达调控及发酵性能进行了研究。摇瓶试验结果表明:产酶培养基中甘油和玉米浆粉的适宜浓度分别为2.0%和3.0%,培养基最适pH值为6.0。甲醇作为碳源和基因表达的诱导物,对重组毕赤酵母的发酵结果有重要影响。发酵过程中每24h加入体积分数为1.0%的甲醇、质量浓度为0.2%的甘油及质量浓度为0.3%的玉米浆粉,有利于重组毕赤酵母持续合成纤维二糖酶。摇瓶发酵8d,发酵液中纤维二糖酶活力可达到9.01 IU/mL。     

里氏木霉与黑曲霉共同培养固态发酵生产饲用酶的研究

介绍了里氏木霉与黑曲霉共生用固态发酵工艺生产饲料用酶的方法。借助同时糖化与发酵的概念，在里氏木霉生长繁殖进入旺盛时期适时接入黑曲霉。而黑曲霉与里氏木霉共生，不仅有益于酶系的改善，而且黑曲霉的生长繁殖消耗了纤维素酶促水解所生成的葡萄糖等，有益于纤维素酶的合成。与此同时生成适量的酸性蛋白酶、果胶酶及糖化酶，提出了原料的利用价值。研究结果表明，影响酶活力的关键因素是培养基的水分及接种的时间，纤维素的量与结构亦是一个重要的因素。     

固态发酵生产高活力纤维二糖酶

在固态发酵条件下,对７个纤维二糖酶生产菌株进行了筛选,发现ＡｓｐｅｒｇｉｌｕｓｎｉｇｅｒＬＯＲＲＥ０１２为纤维二糖酶高产菌株。研究了培养时间、温度、培养基含水量及初始ｐＨ等因子对该菌形成纤维二糖酶的影响。当培养基采用自然ｐＨ（约６．０）、含水量７０％,接种后在３０℃下先培养２ｄ,再在２５℃下培养２ｄ,每克干酶曲所含的纤维二糖酶活力可达到４３０．５６ＩＵ。由此获得的纤维二糖酶曲与Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｓｅｉ产生的纤维素酶曲在糖化纸浆过程中有明显的协同作用,当两者以１∶１０混合使用时（纤维二糖酶与滤纸酶活力之比约为０．４４）,可有效地消除水解产物中纤维二糖的累积,使纤维纸浆的酶水解得率高达９０．７％。     

水稻秸秆的纤维素酶水解研究

木霉T—LSQ-18和黑曲霉SP-77固体发酵条件的优化,使T-LSQ-18菌株纤维素酶C1酶活达28.5IU／g,黑曲霉CB酶酶活达132IU／g;采用木霉T—LSQ-18：黑曲霉SP-77（6：1）的混合酶液水解预处理后的秸秆,使秸秆净减率达到35．3％。     

里氏木霉(Trichoderma reesei)产纤维素酶液态发酵条件的研究

对纤维素酶高产菌株里氏木霉(Trichoderma reesei)ZU03产纤维素酶的液态发酵条件进行了研究,确定了适宜的培养基配方和最佳发酵工艺条件。最优培养基配方及发酵条件为:培养基起始pH4.5,C/N8∶1,纸浆浓度30g/L,培养温度28℃,接种量10%(v/v),摇床转速150r/min,培养时间4d。在此优化发酵条件下,摇瓶发酵液中的纤维素酶FPA活力达11.67IU/mL,比初始发酵条件下酶活力提高近3倍。同样在此优化条件下还进行了5m3罐的中试,FPA活力达8.62Iu/mL。     

高产纤维素酶突变株的筛选及其产酶条件优化

通过常压室温等离子体技术诱变里氏木霉RUT-C30,筛选高产纤维素酶突变株,并对其产酶进行优化,提高纤维素酶的产量。筛选得到高产纤维素酶突变株后,进行全基因组测序分析突变型,并对产酶培养基和培养条件进行优化。结果表明：经过筛选获得高产纤维素酶突变株JNDY-13,其摇瓶发酵最高滤纸酶活可达2.21 IU/mL,为出发菌株的2.21 倍,优化后JNDY-13在5 L罐中流加发酵所产最高滤纸酶活为5.40 IU/mL;测序结果显示JNDY-13基因组中共有752 个突变发生,其中半乳糖激酶基因中被插入的18 个碱基可能是突变株纤维素酶活力增加的原因。     

New isolate of Trichoderma viride strain for enhanced cellulolytic enzyme complex production

A new Trichoderma viride stain was isolated from Singapore soil samples. Its mutants were developed by using ethyl methyl sulfonate (EMS) treatment and UV-irradiation followed by a semi-quantitative plate clearing assay on phosphoric-acid-swollen cellulose plates. Mutant EU2-77 proved to be the most promising extracellular cellulase producer among 20 mutants in a screening program performed in shake flask fermentation after plate screening. Soluble protein content, filter paper cellulase (FPase) activity, β-glucosidase activity and endoglucanase (CMCase) activity of the fermentation broths of the mutant strain were increased to 1.67, 2.49, 2.16, and 2.61 folds, respectively, compared with the wild strain. This enzyme complex produced by mutant EU2-77 contained FPase (2.19 IU/ml), CMCase (16.46 IU/ml), β-glucosidase (4.04 IU/ml), xylanase (42.37 IU/ml), and β-xylosidase (0.12 IU/ml). The soluble protein concentration in the enzyme complex was 1.69 mg/ml. The hydrolytic capacities of fermentation supernatants of T. reesei Rut-C30, the wild strain T. viride NP13a and mutant T. viride EU2-77 were compared with the commercial enzymes on the hydrolysis of waste newspaper. The crude enzymes prepared by T. viride EU2-77 showed much higher hydrolysis performance than that from the commercial strain Rut-C30 and demonstrated much comparable hydrolytic performances with the commercial enzyme mixtures. T. viride mutant EU2-77 produced high levels of extracellular cellulases as well as β-glucosidase, rendering the supplementation of β-glucosidase unnecessary in waste newspaper hydrolysis.     

利用木糖渣生产酒精的研究

研究了纤维原料 (木糖渣 )的酶水解及产酒精工艺。结果表明 ,木糖渣的酶解得率受底物浓度及酶用量的影响较大 ,加入纤维二糖酶 (CB)会明显地提高酶解得率。当纤维素酶的滤纸酶活(FPA)与CB的比例为 4∶1时 ,10 %浓度的木糖渣酶解 48h还原糖得率可达 85 %～ 88%以上。同时 ,木糖渣产酒精结果表明 ,在不添加其他营养素 ,起始 pH 5 0 ,培养温度 3 2～ 3 4℃的条件下 ,10 %酶解液摇瓶发酵 3 6h ,酒精体积分数可达 2 5 13 %。按实验结果推算 ,3 98t木糖渣原料可生产 1t成品酒精。     

响应面法优化里氏木霉Rut C-30产纤维素酶液体培养基

该试验在单因素对里氏木霉(Trichoderma reesei)Rut C-30产纤维素酶的液体培养基优化的基础上,以滤纸酶活为响应值,采用响应面法确定其最佳培养基。首先通过Plackett-Burman(PB)设计筛选出影响滤纸酶活的显著因素,结晶纤维素和麸皮;通过最陡爬坡试验逼近最大酶活力区域;最后通过Central Composite Design(CCD)设计及响应面分析确定产酶最佳培养基,其中影响酶活的显著性因素结晶纤维素41.8g,麸皮19.1g。经过优化,滤纸酶活力最高为8.21U/mL,比单因素优化结果7.03U/mL提高了16.78%,同时测得CMC酶活为63.64IU/mL,木聚糖酶活为27.4IU/mL,葡萄糖苷酶酶活0.96IU/mL。