基于细胞组学技术提高胶球藻C-169中性脂染色的有效性

本研究基于流式细胞仪、荧光酶标仪、激光共聚焦扫描显微镜等细胞组学分析技术,系统研究了藻液细胞浓度、Nile Red浓度、助溶剂种类和浓度,以及染色温度、染色时间、振荡时间等对检测藻细胞中性脂相对含量(以平均荧光强度表示)的影响,提高了胶球藻C-169中性脂染色的有效性。结果表明,Nile Red荧光染色的最佳藻细胞浓度为106 m L,染料浓度在0.05~0.2μg/m L之间较适宜且不会产生过量的荧光干扰;添加15%~30%(V/V)丙三醇能显著增强染料进入细胞的通透性;25~40℃范围内胶球藻染色后的荧光强度较强但无显著差异(p0.05);染色时间超过10 min及振荡时间超过30 s均未显著提高胶球藻C-169染色后的平均荧光强度。系统优化后的染色方法可从细胞水平上显著提高中性脂荧光检测的精确性,同时为其他微藻采用这一荧光探针快速测定中性脂含量提供了快速有效方法。     

补充CO2提高胶球藻C-169生物量和脂肪酸产率的研究

本研究在Basal和BBM培养基中补充2%CO2或空气(0.04%CO2)光自养培养胶球藻(Coccomyxa subellipsoidea)C-169,系统比较了细胞比生长速率、生物量干重、总脂肪酸含量和产率以及中性脂含量的差异。研究表明,与空气培养相比,在Basal和BBM培养基中补充2%CO2可分别显著提高细胞的比生长速率2.6倍和2.3倍。培养13 d后,Basal培养基中补充2%CO2可获得最高生物量干重达4.67 g/L,显著高于所有其他组(p0.05);而BBM培养基中补充2%CO2可获得最高总脂肪酸含量达37.53%干重,是通入空气时的5倍,脂肪酸产率更是高达77.49 mg/(L·d),同时中性脂含量(以荧光强度表示)显著高于所有其他组(p0.05)。这就说明在Basal培养基中补充CO2有利于细胞生物量的积累;而在BBM培养基中补充CO2更有利于驱动细胞高产脂肪酸和中性脂,其生物量是制备生物柴油的极好原料。     

户外环境条件下三角褐指藻生长和积累脂肪酸的条件优化

微藻的脂肪酸含量与其应用价值有直接关系,而环境因素对微藻脂肪酸含量有着显著影响。本文以细胞密度、干重浓度、脂肪酸含量等为评价指标,研究了户外跑道池系统中不同盐度(20‰、25‰和30‰)、p H值(7.5、8.0和8.5)、氮源种类(尿素和碳酸氢铵)等环境因素下三角褐指藻户外生长、脂肪酸积累的规律。结果表明,随着培养基盐度的升高,三角褐指藻的增长速率变缓,在20‰盐度条件下获得最大生物量177.78 mg/L;在30‰盐度条件下获得最大脂肪酸含量123.99 mg/g;p H值8.0条件下,三角褐指藻生物量浓度及脂肪酸含量均达到最大值(166.39 mg/L和145.92 mg/g),而在p H值7.5条件下,三角褐指藻的生长受到抑制。尿素作为氮源较碳酸氢铵更有利于三角褐指藻的生长,最终生物量为150.83 mg/L,但以碳酸氢铵为氮源条件下,更利于脂肪酸的积累,脂肪酸含量达到169.72 mg/g。因此,户外跑道池中的最适培养条件为盐度20‰、p H值8.0、尿素为氮源。     

胶球藻C-169户外诱导培养积累脂肪酸和色素的研究

本研究分别采用Basal、BBM以及无氮磷添加的培养基,在户外开放跑道池中培养胶球藻C-169,系统比较了比生长速率、生物量浓度、脂肪酸和色素含量的差异。研究表明,胶球藻C-169在户外开放跑道池中,水温13~20℃下,生长良好。在第二阶段氮磷限制Basal、BBM培养基中的8 d,细胞处于生长的对数期,Basal培养基中平均比生长速率是BBM培养基的1.92倍,生物量干重浓度最高为0.22 g/L。第一阶段细胞在BBM、Basal两种培养基中亚麻酸含量可分别高达总脂肪酸含量的36.6%、53.9%;第二阶段在氮磷限制的BBM培养基中,亚麻酸占总脂肪酸的比例下降了32.4%,油酸的比例增大了38.5%;氮磷限制BBM培养基中细胞内总脂肪酸含量由起始的3.99%增大到18.18%。上述两种藻液以1:1混合培养5 d,平均比生长速率下降到0.0094 d-1,总脂肪酸含量增大到20.2%。藻细胞中色素含量随着脂肪酸含量的增加而降低,呈明显的负相关。     

盐度及其调节方式对眼点拟微球藻的生长和EPA积累的影响

本文研究了盐度对海产眼点拟微球藻的生长和EPA积累的影响,同时比较了天然海水、粗海盐和NaCl三种物质在调节培养基盐度、影响藻细胞生长和EPA积累方面的作用,结果表明:盐度处于14.5 ‰(33.5 ‰之间对EPA的含量没有显著影响,但对细胞比生长速率的影响更为显著.藻细胞生长和EPA积累的最适盐度范围在27.0 ‰(29.0 ‰.用NaCl实现海水中的盐度不能有效促进细胞的生长和EPA积累,而用粗海盐实现海水中的盐度能发挥与海水基本相同的作用.     

不同碳源培养胶球藻C-169净化糖蜜酵母废水

本项目系统研究了三种碳源(CO_2、醋酸和甘油)添加到预处理后的糖蜜酵母废水,在藻菌共生条件下培养胶球藻C-169的生长情况及强化废水净化效果。结果表明,与通入空气相比,补充2%CO_2,能显著提高细胞的平均比生长速率、生物质产率,分别是通入空气的6.49、10.4倍,显著提高了对脱色废水的总氮、总磷和氨氮去除率(p0.05),但降低了废水COD(化学需氧量)去除率。研究发现胶球藻C-169能够利用甘油作为其生长的碳源,在0～20 g/L甘油浓度时,随着甘油浓度的提高,细胞生长速率增大,总氮、总磷去除率提高,并在20g/L时获得最高生物量干重达到8.80g/L,平均比生长速率是不添加甘油的2.07倍,生物量产率达0.70 g/(L·d)。甘油浓度在15 g/L以上时,总氮、总磷去除率分别高达85%、95%以上,极显著地提高了废水COD(p0.01)。添加1～4g/L醋酸,均会抑制胶球藻C-169的生长,降低废水净化效果。因此在使用C-169净化COD较高的废水时,可添加甘油作为其生长的碳源。     

氮、磷浓度对小球藻生长及油脂积累的影响

含油微藻是非常有前景的生产生物柴油的材料,其生物量和油脂含量是决定其经济可行性的重要指标。培养基组成对含油微藻的生长与油脂积累具有重要影响。实验以采自青岛海域的一株海水小球藻为研究对象,在摇瓶中考察培养基氮源、磷源浓度对小球藻生长及其油脂积累的影响。结果表明:在一定范围内,增加氮源浓度能提高小球藻生长速率,但磷源对小球藻生长影响不明显;随着氮、磷源浓度的降低,小球藻总脂和中性脂含量均逐渐增大,氮源起的作用更加显著,在0.220mmol/L的低氮胁迫下获得了最高的细胞总脂含量,总脂占细胞干重的33.5%±0.3%。氮源浓度为0.441mmol/L时,小球藻的油脂产率最高,为(10.58±0.29)mg·L-1·d-1。培养基中低磷浓度有利于小球藻的油脂积累,但差别不明显。     

高密度接种胶球藻C-169处理脱色酵母发酵废水条件优化

本文探究了胶球藻C-169的营养方式,并在未灭菌的脱色酵母废水中高密度接种胶球藻C-169,系统比较了接种密度、废水浓度对胶球藻C-169的生长及其处理酵母废水效果的影响。结果表明,胶球藻C-169可以利用葡萄糖和蔗糖进行异养和混养生长。混养条件是胶球藻C-169快速扩种的最佳条件。在混养条件下,胶球藻生长速度最快,最适葡萄糖浓度为20 g/L。通过单因素实验研究培养条件(接种密度、废水起始浓度)对胶球藻C-169的生长和废水处理效果的影响,建立的最佳培养条件为:起始接种密度不低于1 g/L,脱色废水稀释倍数为2倍。在此条件下,胶球藻C-169的生物量产率为0.23 g/(L·d),脱色废水COD(化学需氧量)、总氮、总磷的去除率分别为49.54%、70.39%和98.09%。此研究表明胶球藻C-169在藻菌共生条件下对酵母废水的净化具有很大潜力。     

3种不同培养基对斜生栅藻生长和油脂积累的影响

以斜生栅藻FACHB-12为原料,采用BG11、F/2和SE 3种培养基对其培养。通过对生物量、生长速率、油脂含量、油脂组分以及脂肪酸组成的测定,比较不同培养基对斜生栅藻生长和油脂积累的影响。结果表明:BG11培养基更有利于斜生栅藻的生长,而F/2培养基更适合油脂以及中性脂的积累;斜生栅藻在BG11培养基中比生长速率为0.095,培养15 d生物量为0.36 g/L,叶绿素a含量达到1.23 mg/L;而在F/2培养基中油脂含量可达细胞干重的24.75%,其中中性脂占总脂的36.64%,产率达0.98 mg/(L·d);并且在F/2培养基中斜生栅藻脂肪酸组成以C16∶0和C18∶1为主,含量分别占总脂肪酸的25.84%和54.47%,更适合作为制备生物柴油的原料。     

不同培养条件对缺刻叶球藻的生长和油脂、花生四烯酸积累的影响

为了提高缺刻叶球藻的花生四烯酸(AA)产量,分别研究了不同光强、初始氮浓度及更换培养基的方式对缺刻叶球藻的生长和油脂、AA积累的影响。结果表明:同等光强下,高氮条件更有利于生物量的积累,但总脂含量和AA含量较低。在双侧高光的基础上更换培养基后,最高生物量增至7.36 g/L(高氮换高氮),最高总脂含量和AA含量分别达到47.74%和6.18%(低氮换无氮)。对比发现,高氮换高氮最有利于缺刻叶球藻的生长,但AA产率相对低,仅为7.0 mg/(L·d),而高氮换无氮、低氮换低氮、低氮换无氮3种更换方式均能提高AA产率,产率分别为14.0、15.3、17.0 mg/(L·d)。研究表明,缺刻叶球藻是生产AA的潜力藻株。     

促进黄丝藻储能物质高效富集的氮调控策略

为了促进黄丝藻胞内储能物质的高效积累，研究了不同氮形态(NO^-₃、Urea和NH⁺₄)及初始氮浓度(1、3、6、9、18 mmol/L)对黄丝藻生长、碳水化合物和总脂积累的影响，在此基础上建立了基于氮调控促进黄丝藻生物量和储能物质同步高效积累的“低氮(初始氮浓度3 mmol/L)转高氮(初始氮浓度18 mmol/L)”两步法培养策略，并对两步法培养策略的培养时间进行优化。结果表明：与Urea和NH⁺₄比较，黄丝藻更倾向于利用NO^-₃,分别在3 mmol/L和18 mmol/L条件下获得最高生物量(3.69 g/L)和总脂含量(57.3%);在“低氮转高氮”两步法培养中，低氮培养时间6 d转高氮培养12 d可显著提高黄丝藻胞内储能物质的积累，储能物质产率最高，达到274.26 mg/(L·d),其中生物量、总脂产率和碳水化合物产率分别为6.37 g/L、152.92 mg/(L·d)和121.35 mg/(L·d)...     

不同碳、氮源质量浓度对高山被孢霉脂质积累及SNF1复合体转录调控的影响研究

高山被孢霉(M.alpina)是一株具有较强脂质合成能力的产油微生物,其脂质积累受培养基中碳、氮源调控。探究了不同葡萄糖和酒石酸铵质量浓度对M.alpina生长及脂质积累的影响,并进一步研究不同碳、氮源质量浓度下M.alpina SNF1复合体各亚基的转录水平。结果表明:初始酒石酸铵质量浓度一定时,M.alpina脂肪酸含量随碳氮比(C/N)的增加而提高,C/N为24.6时其脂肪酸含量比C/N为4.6时提高42.6%,初始葡萄糖质量浓度一定时,氮源限制下(C/N=76.7)M.alpina脂肪酸产率达到2.6 g/L,是氮源存在时的1.5~3.2倍,与葡萄糖相比氮源水平对M.alpina脂质积累影响更为显著。氮源一定时高葡萄糖质量浓度(C/N=24.6)下SNF1复合体各亚基转录水平比对照组提高13.9~20.5倍;而氮限制导致的高C/N同样可促进其转录水平的提高。高C/N和氮限制均属于营养失衡信号,说明M.alpina SNF1转录水平的变化是其对胞外营养水平的响应方式,并与脂质积累水平具有相关性。     

真菌发酵法产油脂的研究

本文以深黄被孢霉(Mortierellaisabellina)为试验菌株,采用发酵法生产油脂。采用单因素试验设计,研究了产脂培养基中碳源、氮源种类及其浓度对菌体生长和油脂积累的影响。试验确定酶法水解的玉米淀粉水解糖为最佳碳源,其最适添加浓度为100g/L;酵母膏为最适氮源,其最适添加浓度为3g/L。优化培养基条件下获得菌体生物量为12.350g/L,油脂含量为52.19%,油脂产量为6.4376g/L。但还有待于进一步优化培养基中的其它成分,以有效提高菌体油脂产量。     

培养基pH调控法高密度发酵唾液乳杆菌XH4B研究

本研究以MRS培养基为基础,通过优化碳、氮源及无机盐的配方和用量,再结合补料发酵,最终实现唾液乳杆菌XH4B高密度培养的目的。以乳酸菌的生物量为指标,同时考查发酵液pH值、乳酸含量等,最终确定酵母粉和蔗糖为最佳氮、碳源,同时增加乙酸钠用量至2%、磷酸二氢钠0.6%,可以对发酵液酸化时提供一定的缓冲作用。采用优化的PY-Suc培养基,唾液乳杆菌XH4B的生物量最高能达到6.91 g/L,明显高于MRS培养基的5.01~6.30 g/L(P0.05)。等量补料培养并且采用NaOH中和发酵液pH值时,乳酸最高积累速度可以达到5.958 g/(L·h),但是随着培养时间延长,积累速度迅速下降。发酵酸化较严重时(乳酸含量9~10 g/L),唾液乳杆菌XH4B的生物量积累变缓。结论:优化MRS培养基,并加大乙酸钠、磷酸二氢钠等能够缓冲发酵液的无机盐用量,结合补料发酵,可以实现唾液乳杆菌XH4B的高密度培养。     

Effect of Culture Variables on Mycelial Arachidonic acid Production by Mortierella alpina

Effect of culture conditions on biomass, lipid, and arachidonic acid production was investigated in the oleaginous fungus Mortierella alpina CBS 528.72 under shake flask conditions. Several factors have been found to affect the biomass buildup and lipogenesis in this fungus, complicated by the fact that different strains demonstrate varying optimization conditions. Growth, lipid accumulation, and arachidonic acid production in the strain investigated were influenced by media, pH, temperature, carbon source, nitrogen source, etc. The results indicated that the most effective medium for growth and arachidonic acid production was glucose yeast extract medium. The optimum pH and temperature were found to be 6.5 and 28°C, respectively. On the same weight basis, glucose was the most efficient carbon source for biomass and lipid production in this fungal strain which yielded 6.8 g/L dry biomass and 40.2% (w/w) total lipid after 7 days of cultivation. Maximum arachidonic acid (ARA) production of 40.41% achieved in rhamnose-containing media was not concomitant with higher biomass and lipid yields. Efficacy of organic carbon sources, viz, yeast extract and peptone over inorganic sources like sodium nitrate, ammonium sulfate, ammonium chloride, etc, was established in the present study. M. alpina CBS 528.72 grown in peptone acquired the highest lipid content (42.0% (w/w)). However, the ARA content (28.74%) proved to be significantly less than that grown in yeast extract (35.28%). Furthermore, it was found that the biomass and ARA production declined drastically in a medium with vegetable oils as the sole carbon source but triggered the lipogenic pathway leading to higher accumulation of total lipids. Under the ideal conditions mentioned above, the maximum biomass, total lipid, and arachidonic acid production were 6.8 g/L, 41.6%, and 35.28% total fatty acid, respectively, in shake flask system.     

Effect of Tween 80 on the growth, lipid accumulation and fatty acid composition of Thraustochytrium aureum ATCC 34304

Thraustochytrium aureum ATCC 34304 was grown in the presence and absence of polyoxyethylene sorbitan monooleate (Tween 80). The aim of this work was to obtain basic knowledge about the effect of Tween 80 on growth, lipid accumulation and fatty acid composition in T. aureum. The addition of Tween 80 to a culture medium significantly enhanced the growth of T. aureum, and the biomass increased with an increase of Tween 80 content. Total lipid content and total fatty acid content were significantly higher in 1.0% Tween 80 in comparison with the control (absence of Tween 80). The fatty acid profile showed that the content of C18:1n-9 (oleic acid) significantly increased as a result of the addition of Tween 80. These results indicated that part of the Tween 80 added to the medium was utilized as a carbon source or that the oleate included in Tween 80 was directly incorporated into T. aureum cells as a fatty acid. Neither the DHA content nor the percentage of DHA did not change in spite of the addition of Tween 80. However, the DHA yield significantly increased because the biomass increased due to the addition of Tween 80.     

外源油脂的添加促进卷枝毛霉脂肪酸的积累

卷枝毛霉（Mucor circinelloides）可利用多种碳源实现脂质积累,不同的碳源对其脂质积累的影响不同。在不改变其它发酵培养条件和碳氮比的情况下,以100%葡萄糖为对照,添加不同比例的外源油脂（大豆油）作为另一种碳源,对其细胞生长和脂质生成的影响进行了研究。采用氯仿-甲醇法提取脂质,通过气相色谱技术（gas chromatography,GC）测定其脂肪酸组成及含量。同时,采用实时荧光定量PCR法检测了与脂肪酸合成相关的脱饱和酶基因在菌株中的表达情况。结果表明：碳氮比不变的情况下,最佳碳源混合比例为葡萄糖35 g/L,大豆油24.3 g/L,该培养基中生长的卷枝毛霉的生物量、脂质含量和脂质产量在发酵前期迅速增长,在发酵后期的增长趋势逐渐平缓,在发酵72 h之后略有下降,其最高生物量、脂质含量和产量分别为19.60 g/L、42.62%和8.35 g/L,而对照组（以葡萄糖为单一碳源）仅为14.72 g/L、34.41%和5.06 g/L。与对照组相比,经混合碳源培养的卷枝毛霉的生物量、脂质含量和产量分别提高了33.15%、23.8%和65.10%,且可以将大豆油中的α-亚麻酸...     

三角褐指藻跑道池规模化培养及岩藻黄素积累条件的优化

岩藻黄素是一种广泛存在于海洋藻类的类胡萝卜素,具有清除自由基、抗癌和抗肥胖等生理活性,尤其在抗肿瘤和减肥方面功效突出。三角褐指藻中的岩藻黄素含量丰富,而环境因子及营养因素对微藻生长及岩藻黄素含量有着显著影响。本文以OD值、细胞密度、干重和岩藻黄素含量等为评价指标,研究了不同盐度(20、25、30)、pH值(7.5、8.0、8.5)、氮源种类(尿素、碳酸氢铵)等因素对三角褐指藻户外生长、岩藻黄素积累的影响。研究表明:盐度为20条件下,三角褐指藻获得最大细胞密度6.01×10~6/m L,不同盐度对岩藻黄素含量的增长无明显效果;pH值8.0条件下,三角褐指藻细胞密度及岩藻黄素含量均达到最大值(5.8×10~6/m L和17.79 mg/g);与碳铵相比尿素作为氮源更有利于三角褐指藻的生长,最终细胞密度为4.1×10~6/m L,但以碳铵为氮源条件下,更利于岩藻黄素的积累,岩藻黄素含量达到9.96 mg/g。因此,户外跑道池中的最适培养条件为盐度20、pH值8.0、碳铵为氮源。