HCV多表位抗原的选择及结构分析

目的：设计HCV复合多表位抗原,分析其空间结构,探讨其用于疫苗研究和HCV-Ag检测的潜在可行性。方法：选择HCV多表位抗原并将其串联成HCV复合多表位抗原基因B2,利用软件和网站分析其空间结构。结果：该HCV复合多表位抗原具备涵盖多种天然表位的抗原特性,且二级结构提示具有形成T细胞位点的倾向,易于诱导T细胞介导的细胞免疫应答,三级结构有良好的亲水性,可能激发良好的体液免疫应答。结论：该HCV复合多表位抗原选择合理,空间结构分析能激发良好的免疫反应,有望用于疫苗研究和HCV-Ag检测。     

HCV多表位多克隆抗体的纯化及HCV-Ag的检测

目的：制备并纯化HCV复合多表位多克隆抗体,探讨其用于丙型肝炎抗原检测的潜在可行性。方法：将人工合成的HCV复合多表位抗原在大肠杆菌中表达融合蛋白后免疫小鼠分析表达产物的免疫特异性及免疫原性,免疫家兔获取多克隆抗体,利用盐析和亲和柱纯化多克隆抗体,利用该抗体用双抗夹心法检测HCV-Ag。结果：融合蛋白能在原核表达系统中高效表达,并可诱发小鼠及家兔产生高滴度的特异性HCV抗体,该HCV多表位复合抗原多克隆抗体,在用ELISA法检测HCV-Ag中表现出较高的灵敏性（90.63%）及特异性（78.13%）。结论：通过盐析和亲和柱可高效纯化HCV复合多表位多克隆抗体,纯化后的抗体用ELISA双抗体夹心法检测HCV-Ag具有灵敏、特异、快速的优点,有望用于HCV的抗原检测。     

丙型肝炎病毒分片段抗体检测及优势抗原表位分析

目的检测丙型肝炎病毒(HCV)分片段抗体,并分析HCV优势抗原表位,为HCV抗原、抗体检测及疫苗研究提供依据。方法收集经ELISA法检测抗HCV阳性血清样品90份,使用总抗体检测试剂及抗HCV分片段试剂进行检测,并用荧光定量PCR对抗体弱阳性及阴性样品进行复核,分析不同片段出现的阳性率,从而分析HCV的优势抗原表位。结果 90份抗HCV阳性的样品经总抗体检测试剂检测,其中阳性78份(86.67%);90份抗HCV阳性的样品中,分片段试剂检测1个片段以上阳性样品59份(65.56%);其中C、NS3、NS4及NS5片段抗体阳性分别为56份(94.92%)、57份(96.61%)、42份(71.19%)及47份(79.66%),NS3及C片段抗体是HCV的优势抗体。结论 HCV-C及NS3表位是HCV的优势抗原表位;HCV分片段抗体与总抗体检测试剂之间阳性检出率存在一定差异。     

抗-HCV多表位抗体在检测HCV抗原中的应用

目的应用丙型肝炎病毒多表位抗体,探索从血浆或血清样品中检测丙型肝炎病毒抗原(HCAg)的可能性,为献血员筛选及临床早期诊断提供检测方法。方法利用原核系统表达的丙型肝炎病毒(HCV)7个高度保守区基因的多表位复合抗原免疫动物,制备抗-HCV多克隆抗体,采用ELISA双抗体夹心法检测血浆或血清中的HCAg,并与RT-PCR法进行比较。结果制备的抗-HCV多表位复合抗原多克隆抗体,在用ELISA法检测HCAg中表现出较高的特异性及灵敏性,Cutoff值为0·239,批内CV值为5·60%~6·65%,批间CV值为7·80%。与RT-PCR比较,相关系数为0·816,灵敏度为88·89%,特异度为96·30%,一致性为95·24%,调整一致性为90·82%,阳性预测值为80·00%,阴性预测值为98·11%。HCAg检出率与美国ORTHO公司HCV-C抗原检测试剂盒差异无显著意义(P=0·06)。结论用HCV多表位复合抗原制备的多克隆抗体,采用ELISA双抗体夹心法检测HCAg,具有灵敏、特异、快速的优点,有望开发成为HCAg诊断试剂盒。     

HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合病毒样颗粒的制备及纯化

目的制备丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)中和抗原表位与HBV S抗原嵌合病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),并进行纯化和鉴定。方法采用脂质体法分别将4个HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合重组表达载体p CI-HBSE1、p CI-HBSE2、p CI-HBSE3、p CI-HBSE4转染HEK293T细胞,48 h后收集培养上清,获得自我装配的嵌合HCV中和表位的HBV VLPs,分别命名为VLPs-SE1、VLPs-SE2、VLPs-SE3、VLPs-SE4,蔗糖密度梯度离心,透析浓缩后,电镜观察VLPs,电化学发光法进行HBs Ag定量,ELISA法检测嵌合VLPs作为包被抗原与HCV感染患者血清的反应。结果电镜观察可见4种嵌合VLPs,大小约为22 nm;浓度最高的VLPs-SE2 HBs Ag含量达5.51×103ng/ml,该浓度可满足后续试验的要求;用混合VLPs作为包被抗原检测的HCV感染患者血清中和抗体水平稍高于单一VLPs作为包被抗原检测的水平。结论成功制备了HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合VLPs,为进一步评价VLPs体内诱导的中和抗体及中和抗体的保护作用奠定了基础。     

HCV复合多表位基因真核表达载体的构建及在真核细胞中的表达

目的建立丙型肝炎病毒(HCV)复合多表位基因的真核表达载体,并在COS7细胞中瞬时表达。方法用PCR方法扩增核心区羧基端部分缺失的基因片段;分别合成HCV E2区模拟表位和NS3~NS57个T或Th细胞表位基因;PCR方法将羧基端部分缺失的HCV核心区基因与合成的表位基因串联,克隆入真核表达载体pcDNA3·1(-),并通过脂质体瞬时转染COS7细胞。结果所构建的真核表达载体pcDNA3·1(-)-CtEm已成功转染COS7,间接免疫荧光和RT-PCR证实,pcDNA3·1(-)-CtEm可在COS7中表达复合多表位基因。结论已成功构建HCV复合多表位基因的真核表达载体,并在COS7细胞中瞬时表达,为进一步复合多表位的基因免疫奠定基础。     

溴氰菊酯人工抗原及多克隆抗体制备

以二溴菊酸和4-[(4-硝基苯)氧基[苯甲醛为原料经4步反应合成了溴氰菊酯半抗原1-氰基[4-(4-氨基苯)苯基]甲基-2,2-二甲基3-(2',2'-二溴乙烯基)环丙烷羧酸酯;用重氮化法将溴氰菊酯半抗原分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)相偶联制备免疫抗原和包被抗原,紫外吸收法估算偶联比分别为11:l和8:1;以BSA偶联物作免疫抗原免疫日本大耳白兔制备溴氰菊酯多克隆抗体,间接非竞争ELISA法测定两个抗血清效价分别为100000和80000,间接竞争ELISA法测定抗体特异性结果表明所制备的抗体测定溴氰菊酯的IC50值为0.16 mg/L,与其他供试农药的交叉反应率均≤1%.制备的溴氰菊酯人工抗原和多克隆抗体为研究建立溴氰菊酯农残免疫快速测定方法奠定了基础.     

关于HCV不同区段抗原的反应性研究

目的　探讨各种丙型肝炎病毒 (HCV)抗原在诊断中的作用及其与HCVRNA的关系。方法　利用HCV不同区段抗原抗 -HCV酶联免疫试验 (EIA)和逆转录聚合酶链反应法 (RT PCR) ,对不同临床型HCV患者进行检测。结果　各组患者均以抗 NS3和抗 C阳性率最高。但均有一定比例患者抗 NS4和抗 NS5阳性。与各单个片段抗 HCV阳性率相比 ,抗 HCV总抗体阳性率最高。结论　NS3和C抗原在检测抗 HCV中起很重要作用 ,但NS4和NS5抗原在抗 HCVEIA中的作用也不容忽视。联合应用不同区段HCV抗原将大大提高抗 HCVEIA试剂的灵敏度。     

毒死蜱人工抗原的合成及多克隆抗体制备

由毒死蜱与3-巯基丙酸在碱性条件下反应,合成了毒死蜱半抗原。然后通过碳二亚胺法将毒死蜱半抗原分别与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA)共价偶联,得到了免疫抗原和包被抗原。用免疫抗原免疫兔子获得了高效价的多克隆抗体,抗血清效价达到了1:160000。通过试验确立了毒死蜱标准曲线,检测限为0.5μg.L-1,抑制中浓度I50为18.2μg.L-1,检测线性范围为1.8～1000μg.L-1。     

口蹄疫病毒复合多表位DNA疫苗的设计及构建

目的构建口蹄疫病毒(FMDV)复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT及其DNA疫苗。方法以O型、A型FMDV结构蛋白VP1全基因和Asia1型FMDV两个基因拓扑型的结构蛋白VP1基因上的5个抗原表位基因作为主要免疫原基因,非结构蛋白3ABC上的2个Th2细胞表位基因及结构蛋白VP4上的1个Th2细胞表位基因作为辅助基因,构建表达盒。将构建好的表达盒OAAT克隆到真核表达载体pVAX1 PCMV启动子下游,构建三价口蹄疫核酸疫苗pVAX1-OAAT,并用Western blot和IFA方法检测目的蛋白在HeLa细胞中的表达。结果通过InsightⅡ软件同源建模和DNAStar5.0软件分析表明,所构建的FMDV复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT理论上符合设计要求,且在真核细胞获得了正确表达。结论已成功设计FMDV复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT,并构建了三价口蹄疫核酸疫苗pVAX1-OAAT。     

丙型肝炎病毒多表位基因核酸疫苗的构建及其免疫原性

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)多表位基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-CtEm,用该重组质粒免疫BALB/c小鼠,并检测其免疫原性。方法用BamHⅠ和HindⅢ双酶切含有HCVC区、E2区模拟表位和NS3~NS5区细胞表位串联基因的原核表达载体pQE30-CtEm,克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-),脂质体瞬时转染CHO细胞,并检测其表达。以100μg重组质粒免疫BALB/c小鼠,检测其体液免疫和细胞免疫效果。结果所构建的真核表达载体pcDNA3.1(-)-CtEm在CHO细胞中能获得有效表达。该质粒免疫小鼠后可诱导高水平的抗体,特异性淋巴细胞增殖反应、IFN-γ水平及CTL活性均明显高于空载体和生理盐水对照组。结论已成功构建HCV多表位基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-CtEm,免疫小鼠后可诱导特异性体液免疫和细胞免疫应答。     

丙型肝炎病毒中和抗原表位与乙型肝炎病毒S抗原嵌合基因重组真核表达质粒的构建及其在293T细胞中的表达

目的构建丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)中和抗原表位与乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)S抗原嵌合基因真核表达质粒,并在293T细胞中进行表达。方法从含HBV全序列的质粒pHBV中扩增HBV S抗原基因,在HBV S疏水区127和128位氨基酸序列处引入AgeⅠ酶切位点,将HCV E1和E2区保守的线性中和抗原表位及HVR1的模拟表位基因分别插入该位点,获得嵌合HCV中和抗原表位的重组HBV S基因,将该基因克隆至真核表达载体pCI-neo中,构建重组真核表达质粒pCI-HBSE1～4。将4种重组真核表达质粒转染293T细胞,间接免疫荧光和Western blot检测嵌合基因的表达。结果 4种重组真核表达质粒经双酶切证实构建正确;4种重组质粒转染的293T细胞胞浆内可见较强的绿色荧光,Western blot显示,在相对分子质量约27 000处可见蛋白条带。结论成功构建了HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合基因真核表达质粒,其在293T细胞中可有效表达,为进一步制备嵌合HCV中和抗原表位的HBV S抗原VLP,研究中和抗体对HCV假病毒颗粒(HCVpp)和JFH-1 HCV体外培养系统(HCVcc)感染的抑制作用奠定了实验基础。     

基于人工多表位抗原的恶性疟疾抗血清筛查方法的建立

目的建立基于人工多表位抗原的恶性疟疾抗血清筛查方法。方法以人工多表位抗原M.RCAg-1(malaria random constructed antigen-1)和M.RCAg-3(malaria random constructed antigen-3)作为检测蛋白,建立间接ELISA法和双抗原夹心ELISA法,并对两种方法的抗原包被量、一抗稀释度、封闭液、孵育时间及显色时间进行优化。用两种方法检测恶性疟疾病人和正常人血清抗体水平,比较其敏感度,选出最佳检测方法,并检验其特异性和精密性。结果间接ELISA法最佳检测条件:以0.1μg/孔浓度的抗原包被酶标板120 min,用3%羊血清封闭120 min,加入一抗(1∶200稀释)孵育120 min,加入二抗(1∶20 000稀释)孵育60 min,TMB显色10 min;双抗原夹心ELISA法最佳检测条件:一抗稀释度为1∶20,二抗稀释度为1∶100,其他同间接ELISA法。经敏感性比较,确定以M.RCAg-1为抗原的间接ELISA法为最佳检测方法,且该抗原对间日疟血清抗体无明显交叉反应,该方法的批内和批间精密性试验变异系数(CV)为3.05%~5.82%和4.75%~8.54%,均10%。结论单独包被M.RCAg-1的间接ELISA法的检出率高,特异性和精密性良好,操作简便,可用于疫区恶性疟疾的血清流行病学筛查。     

HCV/HBV联合抗原免疫原性研究

目的 探讨HCV/HBV联合抗原PCX/S免疫原性。方法 将纯化的HCV复合多表位抗原蛋白PCX与HBV的S蛋白按一定比例混合并免疫小鼠,用ELISA的方法检测抗-HBs和抗-HCVAb;~3H-TdR掺入法检测免疫小鼠T淋巴细胞增殖;~(51)Cr释放法检测免疫小鼠特异性CTL杀伤作用。结果 免疫后5、10及15μg的3组均能诱导抗-HBsAb和抗-HCVAb,但抗HCVAb水平明显低于抗-HBsAb水平。免疫小鼠可诱发针对PCX或S蛋白的CTL反应,前者更明显,并刺激T细胞增殖。结论 HCV/HBV联合抗原PCX/S蛋白可诱导特异性免疫应答,为HCV/HBV双价疫苗的研究提供一定实验基础。     

癌-睾丸抗原OY-TES-1多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备癌-睾丸抗原OY-TES-1多克隆抗体,并进行鉴定。方法以大肠杆菌表达的MBP/OY-TES-1融合蛋白作为抗原,免疫新西兰白兔,制备抗血清。经蛋白A凝胶纯化后,采用ELISA法检测抗血清的效价,Western blot和免疫组化法检测多克隆抗体的特异性。结果制备的抗血清经ELISA检测,效价不低于1∶128000,纯化后,其效价不低于1∶8000。Western blot显示,抗OY-TES-1多抗可与MBP/OY-TES-1融合蛋白、MBP、OY-TES-1重组蛋白和睾丸组织总蛋白特异性结合;免疫组化检测显示,精子头部呈现阳性反应。结论已成功制备了效价高、特异性强的癌-睾丸抗原OY-TES-1多克隆抗体,为深入研究OY-TES-1的生物学功能提供了工具。     

HIV多表位核酸疫苗构建及其免疫原性

目的设计新型HIV复合多表位疫苗,并检测其在小鼠体内的免疫效果。方法检索抗原表位数据库,进行新型HIV多表位核酸疫苗的设计,利用化学合成的方法合成多表位基因,并构建重组质粒pVAX1-MEGNp24,转染BHK-21细胞,间接免疫荧光法检测多表位基因的表达。重组质粒免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测抗体动态变化,流式细胞仪检测脾T淋巴细胞亚类。结果重组质粒pVAX1-MEGNp24经酶切及测序分析,证明构建正确。间接免疫荧光显示能在BHK-21细胞中表达多表位基因。免疫小鼠可诱导小鼠特异性体液免疫和细胞免疫。结论已成功构建了重组质粒pVAX1-MEGNp24,小鼠免疫试验显示其具有良好的免疫原性。     

乙型肝炎病毒s基因变异株抗原表位的研究

对HepG2细胞表达的HBsAg的点突变体129Ha、142Lf、145Rb、143Sg和148及野生型HBsAgb3进行了初步纯化及抗原表位的研究，发现这些突变体的颗粒密度与野生型HBsAg差异无显著意义，约为1．2；用5种HBsAga决定簇的单克隆抗体对其表位进行分析，发现129Ha、142Lf、145Rb和142Sg与这5种单抗的结合力与野生型HBsAg差异大显著意义，但148突变体的表位与野生型HBsAg明显不同，其原因还有待进一步研究。     

稳定表达丙型肝炎病毒HLA-A2限制性多表位基因C1R-AAD细胞克隆的建立

目的建立稳定表达丙型肝炎病毒(HCV)HLA-A2限制性多表位基因的C1R-AAD细胞克隆。方法合成人泛素基因(Ub)和HCVHLA-A2限制性多表位基因(Mep),分别克隆入原核表达质粒pRSET-A,构建多表位抗原基因的原核表达质粒pRSET-Ub-Mep。用BamHⅠ和HindⅢ双酶切质粒pRSET-Ub-Mep,得到复合多表位基因Ub-Mep,亚克隆入真核表达载体pcD-NA3.1(-),构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(-)-Ub-Mep,转染至C1R-AAD细胞,G418压力筛选后,通过有限稀释法获得稳定表达Ub-Mep融合蛋白的C1R-AAD细胞克隆,采用RT-PCR法检测稳定转染细胞中Ub-Mep基因mRNA的转录;间接免疫荧光法和Westernblot法检测Ub-Mep蛋白在稳定转染细胞中的表达。结果重组真核表达质粒pcDNA3.1(-)-Ub-Mep经酶切鉴定证明构建正确;在稳定转染的C1R-AAD细胞中可检测到Ub-MepmRNA和蛋白水平的表达。结论已建立了稳定表达HCVHLA-A2限制性多表位抗原的C1R-AAD细胞克隆,为进一步研究HLA-A2限制性多表位基因诱导的细胞免疫应答建立了靶细胞。     

甲磺隆人工抗原的合成及多克隆抗体的制备

为了建立测定磺酰脲除草剂甲磺隆残留的酶联免疫吸附检测方法(ELISA),以邻甲酸甲酯苯磺酰胺与琥珀酸酐反应合成半抗原1-[(2-甲酸甲酯)苯磺酰]单胺琥珀酸.用活性酯化法将半抗原分别与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联制备免疫抗原和包被抗原.通过免疫抗原免疫新西兰大白兔获得甲磺隆的多克隆抗体,抗体效价达800 000.以此抗体建立的间接竞争ELISA法,检测甲磺隆的线性范围在0.7~40 mg/L,最低检测限为0.16mg/L.与甲磺隆结构相似的磺酰脲类除草剂的交叉反应结果表明,氯嘧磺隆的交叉反应率为38.2%,其他4种除草剂的交叉反应率都小于1%.     

EV71抗原表位的研究方法及研究进展

肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)属于小RNA病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus)的成员,是引起亚太地区手足口病暴发的主要病原体之一。EV71可引起严重的神经系统病变,对6岁以下儿童造成较高的死亡率。目前尚无上市的疫苗来预防EV71的感染。因此,研制EV71疫苗及治疗药物十分迫切。病毒中和表位是刺激机体产生特异性免疫反应的物质基础,研究其结构、功能对于疫苗的研发,特别是亚单位疫苗的研制、药物靶点筛选至关重要。本文主要对研究EV71抗原表位的方法及最新近况作一综述。