传统奶酪中产转糖基活性β-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选鉴定及其合成低聚半乳糖条件

分离筛选产转糖基活性β-半乳糖苷酶的乳酸菌新菌株,为酶法高效合成低聚半乳糖（galacto-oligosaccharides,GOS）提供新的酶源。以乳糖为唯一碳源,碳酸钙溶钙圈和添加5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）的MRS培养基筛选平板进行初筛,以产酶菌株粗酶液催化乳糖反应产物的薄层色谱（thin layer chromatography,TLC）分析复筛,从新疆伊犁地区牧民手工制作的奶酪样品中筛选产转糖基活性β-半乳糖苷酶的乳酸菌。结合其形态学、生理生化特征及16S rRNA序列同源性分析对产转糖基活性β-半乳糖苷酶菌株进行鉴定。单因素试验确定产酶条件和转糖基反应条件,TLC结合高效液相色谱分析转糖基反应产物各组分含量。筛选获得产转糖基活性β-半乳糖苷酶的菌株6 株,其中Lactobacillus plantarum YLBGNL-S7所产β-半乳糖苷酶的转糖基活性最强。单因素试验结果表明,在温度50 ℃、pH 6.0、乳糖质量浓度300 mg/mL的条件下反应4 h,GOS得率可达质量分数43.40%,其中转移二糖和转移三糖质量分数分别为18.29%和12.95%。以上结果表明,L. plantarum YLBGNL-S7是一株产转糖基活性β-半乳糖苷酶的新菌株,在益生性GOS的合成领域具有应用前景。     

驼乳中产转糖基活性β-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选鉴定及其酶学特性分析

分离筛选高产转糖基活性β-半乳糖苷酶的乳源微生物,为高效合成低聚半乳糖（galacto-oligosaccharides,GOS）提供新酶源。以添加5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）的乳糖为碳源的乳酸细菌培养基（MRS）进行初级分离筛选,以产酶菌株粗酶液催化乳糖转糖基反应产物的薄层层析进行复筛,单因素优化最佳产酶条件和转糖基反应条件,硫酸铵分级沉淀纯化β-半乳糖苷酶并对其酶学特性进行初步分析。筛选获得产转糖基活性β-半乳糖苷酶乳酸菌20?株,选择产酶水平较高、转糖基活性最强的产β-半乳糖苷酶菌株L6进行进一步研究。生理生化和分子生物学鉴定确定L6菌株为Lactobacillus kefiri。该菌株在2?g/100?mL乳糖、1?g/100?mL氮源（蛋白胨、牛肉膏和酵母浸粉）及初始pH?5.5的条件下,37?℃培养20?h,产酶水平最高可达（3.81±0.02）U/mL。L6菌株所产β-半乳糖苷酶催化反应的温度范围较宽,45～70?℃均能保持50%以上相对酶活力。以45?g/100?mL乳糖为底物,该酶在65?℃、pH?7.0条件下,反应4?h生成转移二糖的得率为13.51%（m/m,下同）,转移三糖为13.85%,转移三糖以上的GOS为4.15%。     

产β-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选及酶法合成低聚半乳糖的GC-MS分析

从分离自13种中国传统发酵食品的148株乳酸菌中筛选产高转糖基活性β-半乳糖苷酶的菌株。实验采用X-Gal平板初筛、薄层层析(TLC)复筛、气相色谱(GC)定量的方法,得到一株产β-半乳糖苷酶转糖基活性最高的菌株,并以乳糖为单底物,利用该高转糖基活性β-半乳糖苷酶酶法合成低聚半乳糖(GOS),并采用GC-MS的方法对其各个组分进行鉴定。研究结果表明,菌株70810所产β-半乳糖苷酶转糖基活性最高,其合成GOS产率达到39.23%(m/m);该菌株为实验室已鉴定乳酸菌,为植物乳杆菌(HQ259238)(Lactobacillus plantarum);酶法合成的GOS产物鉴定为9种低聚二糖和3种低聚三糖,主要结构多为β(1→6)和β(1→3)糖苷键。菌株70810来源于泡菜,安全性好,所产β-半乳糖苷酶转糖基活性最高,且可不经纯化直接利用,在食品与乳品加工等方面将具有很好的应用前景。     

发酵法生产低聚半乳糖技术的研究

以乳糖为唯一碳源,X-gal为显色剂,从变质的牛奶中筛选获得一株低聚半乳糖的产生菌,综合其形态学特征、生理生化特征及18S rDNA序列同源分析结果,将其鉴定成为斜卧青霉(Penicillium decumberns).通过正交试验,对菌株生产低聚半乳糖的培养条件进行优化.研究了pH值、温度、乳糖浓度、发酵时间等因素对该菌株全细胞以乳糖为唯一碳源生成低聚半乳糖的影响,最优化反应的转糖基产物经TLC、HPLC分析,确定该菌株具有生产低聚半乳糖的能力.     

Kluyveromyces fragilis LFS-8611 β-D-半乳糖苷酶的摇瓶培养条件

脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)LFS 8611合成的β D 半乳糖苷酶具有较高的催化半乳糖基转移反应活力.脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)LFS 8611细胞生长和β D 半乳糖苷酶的合成同步.该菌株生长和产酶的最适碳源为半乳糖,乳糖次之;最适氮源为蛋白胨F403;最适培养条件为:发酵培养基的初始pH值为7.0,摇床的转速为200r/min.培养基中碳源和氮源质量浓度对菌体生物量和β D 半乳糖苷酶活力有重要影响,以12mg/mL乳糖为碳源,16mg/mL蛋白胨(F403)为氮源,在最适培养条件下培养32h后,菌体生物量和β D 半乳糖苷酶活力分别为7.56g/L和18.83U/mL.     

转糖基β-半乳糖苷酶生产含低聚半乳糖的低乳糖牛奶

研究利用具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶生产含低聚半乳糖的低乳糖牛奶。含低聚半乳糖的低乳糖牛奶既能解决乳糖不耐症问题，同时还在牛奶中增添了低聚半乳糖双歧因子。从Enterobacter sp．B5的无细胞抽提液中，利用硫酸铵沉淀制备具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶，作用鲜牛奶生成含低聚半乳糖的低乳糖牛奶。利用薄层层析、高压液相色谱技术和软件NIHImageJ1．36分析了反应产物中的糖组分（葡萄糖、半乳糖、乳糖和低聚糖（包括转移二糖和三糖））。结果显示酶作用后的鲜牛奶中大约70％的乳糖转化为葡萄糖和半乳糖，至少10％的乳糖通过转糖基反应生成低聚半乳糖。在酶浓度为3U／ml，50℃酶解4h的反应条件下，获得含低聚半乳糖的低乳糖牛奶的糖组成为0．59％低聚半乳糖（含0．37％转移二糖和0．22％三糖），1．33％乳糖，2．83％单糖。本研究利用软件NIHImageJ1．36定量分析样品糖组分的TLC结果，可以避免乳糖的同分异构体．转移二糖在高压液相色谱结果中因无法分离而造成的漏检。     

黑曲霉M_1菌株木聚糖酶复合酶的固态发酵条件及其酶学性质研究

以玉米芯和麸皮 ( 7∶3 )为碳源 ,(NH4) 2 SO4( 2 % )为氮源 ,3 0℃培养 72h ,发酵曲用蒸馏水3 0℃浸提 1h ,得到 β 1,4 木聚糖酶活力高 ,β 木糖苷酶活力低的粗酶液。β 1,4 木聚糖酶和 β 木糖苷酶的最适作用温度分别为 5 0℃和 60℃ ,最适作用pH分别为 4 8和 4 0 ,β 1,4 木聚糖酶在pH5 0～ 10 6范围内稳定 ,β 木糖苷酶在 pH 3 0～ 3 0范围内稳定。β 木糖苷酶的热稳定性比 β 1,4 木聚糖酶高     

具有β-半乳糖苷酶转苷能力的菌株筛选及鉴定

以乳糖为惟一碳源,5-溴-4-氯-3-吲哚- β -D-半乳糖苷(X-gal)为显色剂,从土壤中筛选出10株产β- 半乳糖苷酶较高、生长较好的菌株.在30 ℃下发酵产酶,测定邻硝基苯- β- D-半乳糖苷(ONPG)水解能力.在50 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中,加入400 g/L乳糖和200 g/L果糖,并分别添加10株菌所产β- 半乳糖苷酶, 至酶活为400 U/L,37 ℃下反应8 h,经高效液相色谱分析,编号为2-1样品中含有乳果糖.通过形态特征和16S rDNA 序列分析,鉴定菌株2-1为节杆菌属.     

双歧杆菌和乳酸菌β-半乳糖苷酶转糖基作用的研究进展

双歧杆菌和乳酸菌作为一般认为安全的微生物,是β-半乳糖苷酶（β-galactosidase,β-gal）的较好来源。部分双歧杆菌和乳酸菌菌株能够产生具有转糖基活力的β-gal,以乳糖为底物可合成具有益生作用的低聚半乳糖（galactooligosaccharides,GOS）,而GOS产物的产量和组成受到β-gal的来源以及反应条件的影响。因此,本文总结了能够产生具有转糖基活力的β-gal的双歧杆菌和乳酸菌菌株,比较了两类来源的β-gal的酶学性质,并重点阐述了这两类β-gal在GOS合成中的应用。     

高转苷活性乳糖酶快速筛选方法的建立与初步应用

具有良好半乳糖基转移酶活性的乳糖酶是工业制备低聚半乳糖(galacto-oligosaccharides,GOS)的主要酶制剂。通过筛选获得了以GOS为唯一碳源生长良好,在乳糖-葡萄糖-半乳糖中生长不良的长双歧杆菌B1172,确立了其GOS-生物量相关关系,进一步基于GOS-生物量相关关系建立起乳糖酶转苷活性的高通量筛选方法。运用此方法,从菌种库中筛选获得了5株具有较高转苷活性的乳糖酶产生菌株,可为后续此酶的克隆与分子进化奠定基础。     

不同金属离子和表面活性剂对转糖基β-半乳糖苷酶活性的影响

在巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)发酵产转糖基β-半乳糖苷酶过程中,以单因素试验为基础研究了不同金属离子和表面活性剂对转糖基β-半乳糖苷酶活性的影响,利用Mintab15软件响应面分析法优化在转糖基β-半乳糖苷酶活性最大时的最佳金属离子浓度、表面活性剂的添加量及加入时机。结果表明,发酵培养基中镁离子浓度为0.031%,吐温-80添加量为0.24%,钾离子浓度为0.047%时,最有利于提高转糖基β-半乳糖苷酶的活性且酶的活性最大。为保持产酶过程中β-半乳糖苷酶的最大活性,在菌体生长对数期的初期,OD值为1.6时添加0.2%的吐温-80,添加过早或过晚都会影响转糖基β-半乳糖苷酶的活性。     

基于乳糖水解酶的乳酸乳球菌乳糖代谢多样性研究

探究了磷酸-β-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶对乳酸乳球菌乳糖代谢的影响。通过对12株乳酸菌在以乳糖为单一碳源环境下的生长、产酸、乳糖代谢情况、β-半乳糖苷酶和磷酸-β-半乳糖苷酶活力及发酵液中残留半乳糖含量进行测定,了解不同菌株乳糖代谢的差异。结果表明,不同的乳酸乳球菌乳糖代谢能力存在显著性差异;β-半乳糖苷酶活力较高的菌株发酵液中半乳糖含量为270～4 110 mg/L,而磷酸-β-半乳糖苷酶活力较高的菌株发酵液中半乳糖含量为40～900 mg/L;将磷酸-β-半乳糖苷酶活力较高的乳酸乳球菌与嗜热链球菌复配,发酵液中半乳糖含量较嗜热链球菌单菌发酵时显著降低。磷酸-β-半乳糖苷酶活力较高的乳酸乳球菌有助于降低发酵乳制品中的半乳糖含量。     

碱性脂肪酶产生菌的筛选及产酶条件的优化

通过固体平板法从含油脂土样中筛选出一株产碱性脂肪酶活力较高的菌株 ,鉴定为解淀粉芽孢杆菌。此菌最佳产酶条件为 :1%淀粉为碳源 ,2 %黄豆粉和 2 %玉米粉为氮源 ,培养基起始 pH 7.0 ,3 0℃培养 72h。对发酵液性质进行初步研究发现 ,此酶最适反应温度为3 7℃ ,最佳反应 pH为 8.5。 0 .0 1mol/LCa2 + 和K+ 对酶有激活作用 ,而Cu2 + 和Fe3 + 则对该酶有抑制作用。     

嗜酸乳杆菌产生β-半乳糖苷酶活力的测定及数学模型的建立

以MRS为培养摹，对L．acidophilus Ind-1和L．acidophilus Lakcid两菌株产生β—半乳糖苷酶的活力进行了研究。结果表明，采用1％SDS：氯仿=1：10细胞破壁β—半乳糖苷酶的提取率较高，37℃ 36h培养，L．acidophilus Ind-2和Lacidophilus Lakcid可以产生2．229μ moleONP／L．min和1．808μ moleONP／L．min的β—半乳糖苷酶，且该酶在MRS培养基中积累的数学模型为Logistic和Mistcherlich方程。     

克雷伯氏菌产β-半乳糖苷酶的异源表达及低聚半乳糖合成工艺优化

β-半乳糖苷酶是低聚半乳糖制备过程中的关键酶。本文克隆生菌株克雷伯氏菌B5582Y的β-半乳糖苷酶基因lacZ,并成功构建大肠杆菌重组质粒pET28a-24。经IPTG诱导表达其酶活力比野生菌株提升近10倍。通过单因素及响应面法考察重组酶对低聚半乳糖合成的影响,得到最佳工艺条件为:加酶量130 U/mL,温度44℃,底物添加量90%,pH 7.0～7.5,反应时间10 h,低聚半乳糖的产率达44%。重组酶表现出较好的转糖苷活性,在低聚半乳糖合成领域具有较大的应用潜力。     

专利介绍(10则)

降解鼠李半乳糖醛酸聚糖ＩＩ的酶和微生物专利申请号 :96195 0 86公开号 :1189185公开了降解鼠李半乳糖醛酸聚糖 (ＲＧ -Ⅱ ) ,具有内切 -β-Ｌ -吡喃鼠李糖基 - (1→ 3′) -Ｄ -呋喃芹菜糖基水解酶活性和 /或内切 -α -Ｌ -吡喃岩藻糖 - (1→ 4) -Ｌ -吡喃鼠李糖基水解酶活性的酶。该酶可通过微生物 ,尤其是青霉属菌株 ,例如保藏在ＣＮＣＭ ,保藏号为 1- 15 77和 1- 15 78菌株来产生。可通过包括层析步骤的方法从植物提取物中获得ＲＧ -Ⅱ。 (法国 )啤酒酿造设备专利申请号 :96193 2 63公开号 :1181781一种啤酒酿造设备 ,特别是小型酿造设…     

β-半乳糖苷酶产生真菌的筛选及酶学性质研究

以乳糖为唯一碳源,从土壤中筛选出产β-半乳糖苷酶的37株真菌,从其中合成低聚半乳糖能力较强的Q5菌株提取胞内酶,进行酶学性质的研究,结果表明,该酶的最适pH为4.5,最适温度为55℃,在pH3-8、低于60℃时稳定;该酶被Fe2+、EDTA激活,受Pb2+、Zn2+抑制,其中被Pb2+完全抑制。     

中温α-淀粉酶改性甜菊糖的研究

利用中温α-淀粉酶BAN 480L的转糖基活性,对甜菊糖分子进行改性。实验结果表明,以马铃薯淀粉和甜菊糖为底物,转糖基反应主要发生在味质需要改善的组分甜菊苷上,而味质最好的组分莱鲍迪苷A几乎不发生转糖基反应。经优化得到反应的最佳条件:甜菊糖20 g/L,马铃薯淀粉160 g/L,温度70℃,pH 6.5,酶添加量2 KNU/g淀粉,反应6 h。甜菊苷的转化率为38.9%。反应液经大孔吸附树脂分离纯化,得到了脱除淀粉糖的产品。感官评定结果表明,产品后苦味明显改善,甜度和口感均优于原料。     

体外偶联UDP-糖基转移酶与蔗糖合成酶 高效催化合成莱鲍迪苷A

本研究构建了UDP-糖基转移酶UGT76G1基因的重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K-UGT76G1和绿豆来源的蔗糖合成酶(mbSUS)基因的重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K/pPICZA-mbSUS。通过甲醇诱导产酶,制备UDP-糖基转移酶UGT76G1和蔗糖合成酶,并构建生物催化级联反应体系,生物催化甜菊糖苷(Stevioside,ST)合成莱鲍迪苷A(rebaudioside A,RA),有效实现了级联反应体系中尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的循环利用。本研究通过反应条件优化,发现级联反应中的限速酶是糖基转移酶UGT76G1,添加酶活比例为U_((UGT76G1)):U_((mbSUS))=6:1为合成莱鲍迪苷A的最佳酶活比例,在pH7.0,UDP浓度1mM,蔗糖浓度50mM,MgCl_2浓度3 mM的反应条件下,10 mM ST转化合成8.20±0.11 mM RA,RA的产率达到82.91%,与在大肠杆菌表达系统中相比,极大缩短了催化反应时间。利用体外偶联UDP-糖基转移酶与蔗糖合成酶催化合成RA为酶法高效生物合成RA及其产业化应用提供技术支持。     

嗜热脱氮芽孢杆菌产α-半乳糖苷酶影响因素的研究

该文对前期筛选出的嗜热脱氮芽孢杆菌YWX5产α-半乳糖苷酶的影响因素进行了初步的研究,通过测定α-半乳糖苷酶酶活,探究了培养基成分(包括碳源、氮源、无机盐)及培养条件(初始p H值、培养温度、培养时间)对该嗜热脱氮芽孢杆菌产α-半乳糖苷酶能力的影响。实验结果表明,对该菌产酶最有效的碳源为3%豆粕,氮源为0.5%硝酸钾,附加氮源为0.5%酵母浸出物;添加0.5%氯化钠和0.1%磷酸氢二钾有助于该菌产酶。另外,该菌最佳产酶培养温度为60℃,培养基最适初始p H在7.0~8.0,培养时间为65 h。