荧光定量PCR与焦磷酸测序联合应用检测异烟肼、利福平耐药性结核分枝杆菌

目的联合运用荧光定量PCR和焦磷酸测序技术快速检测异烟肼、利福平耐药性结核分枝杆菌。方法收集结核病疑似患者痰液样本,提取样本总DNA,运用Taqman荧光定量PCR对结核分枝杆菌的感染进行快速筛查。对检测结果为阳性的样本,采用焦磷酸测序法分别对异烟肼、利福平耐药结核分枝杆菌相关基因katG、rpoB的突变热点进行测序分析,与标准菌株序列比对,判断结核分支杆菌异烟肼、利福平的药敏性。采取Bactec 960药敏法鉴定结核分枝杆菌耐药性,并与焦磷酸测序法药敏检测结果进行比较,评估焦磷酸测序法的可靠性。结果荧光定量PCR技术检测痰液样本结核分枝杆菌的准确率达98.95%,检测时间约3 h;以Bactec 960药敏法鉴定结果为标准,焦磷酸测序法对结核分枝杆菌异烟肼、利福平的药敏鉴定结果准确性分别达93.75%和96.15%,其中,对耐药菌株判断,两种方法的一致性高达98%。结论采用荧光定量PCR检测技术可快速、准确地进行结核分枝杆菌感染筛查,运用焦磷酸测序技术则可快速准确地筛查出耐药样本,从痰液样本采集到结核分枝杆菌感染筛查以及药敏报告发布,全程仅需7 h;耐药菌株的检测可靠性达98%。     

Xpert MTB/RIF技术在结核分枝杆菌快速检测的价值

目的:讨论Xpert MTB/RIF技术对快速检出结核分枝杆菌的意义,以期为临床提供帮助。方法:收集我院854例疑似肺结核患者痰标本,分别用抗酸染色法、Xpert MTB/RIF法和液体培养法进行检测。以综合临床诊断为标准,评估Xpert MTB/RIF的敏感性,及在抗酸染色阴性和抗酸染色阳性中比较XpertMTB/RIF法和液体培养法的阳性检出率。结果:XpertMTB/RIF法、液体培养法和抗酸染色法的敏感性分别为60.11%(217/361)、54.02%(195/361)、29.09%(105/361)。以临床诊断为标准,在确诊肺结核样本中,Xpert MTB/RIF法与液体培养法这两种方法的敏感性相较无统计学意义(χ~2=0.927p0.05),在涂阳样本中XpertMTB/RIF法和液体培养法的检出率相较,差异无统计学意义(χ~2=0.631p0.05),在涂阴样本中Xpert MTB/RIF法和液体培养法的检出率相较,差异有统计学意义(χ~2=3.911 p0.05)。结论:Xpert MTB/RIF技术在结核分枝杆菌快速检测中,敏感性与特异性较好,阳性检出率较高,具有较高的临床应用价值。     

交叉引物扩增技术在肺外结核早期诊断中的价值

目的探讨交叉引物扩增技术(crossing priming amplification,CPA)在结核病诊断中的临床应用价值。方法对237例初治结核病患者标本(包括结核性腹膜炎70例,泌尿生殖道结核24例,结核性胸膜炎80例,骨结核13例,淋巴结核16例,结核性脑膜炎34例,其中115例临床确诊为肺外结核)分别进行抗酸染色法、固体培养法及TBCPA法检测,以固体培养法和临床诊断结果为金标准,分析TB-CPA法检测标本中结核分枝杆菌的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和Kappa值。结果以固体培养法和临床诊断结果为金标准,TB-CPA法以及抗酸染色法总体敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、Kappa值分别为91.86%(79/86)、87.42%(132/151)、80.61%(79/98)、92.05%(139/151)和0.81,以及53.49%(46/86)、96.03%(145/151)、88.46%(46/52)、122.52%(185/151)和0.54。结论 TB-CPA法可快速检测肺外结核分枝杆菌,具有良好的应用前景。     

IFN γ释放试验在抗酸杆菌阳性肺疾病患者中的应用及其相关药敏分析

目的分析IFN γ释放试验(interferon gamma release assays,IGRAs)在诊断抗酸杆菌阳性肺疾病患者中的作用及其药敏试验结果,为诊疗抗酸杆菌阳性肺疾病患者提供依据。方法对2015年1月至2016年12月在重庆医科大学附属第二医院、重庆市人民医院就诊的325例痰抗酸杆菌阳性肺疾病患者的痰样本、胸腔积液、组织活检或肺泡灌洗液等样本,进行分枝杆菌菌种鉴定、IGRAs试验、药敏试验。结果 325例痰抗酸杆菌阳性患者中,结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)308例(94.8%),非结核分枝杆菌(non-tuberculosis mycobacteria,NTM)17例(5.2%);IGRAs对诊断MTB肺疾病患者灵敏度为85.1%,在抗酸杆菌阳性条件下,对诊断NTM肺疾病患者灵敏度为88.2%;MTB对一线结核药耐药率高于二线结核药(P0.05),大部分NTM对一线结核药具有高耐药。结论抗酸杆菌阳性肺疾病患者应进行菌种鉴定及药敏试验,以便精准地治疗MTB和NTM肺疾病患者。     

牛乳中副结核分枝杆菌套式PCR检测方法的建立

目的建立牛乳中副结核分枝杆菌套式PCR检测方法,以便快速检测牛奶中副结核分枝杆菌。方法在制备的液体培养基中培养副结核分枝杆菌T、P18、P10,提取基因组DNA,应用DNAstar引物设计软件,根据副结核分枝杆菌独特的稳定性插入片段IS900设计内、外引物,建立检测牛乳中副结核分枝杆菌的套式PCR方法,并对该法的敏感性、特异性进行验证。结果用所建立的方法已成功扩增出目的基因,大小与预期一致;该法的敏感性为102个细菌/ml,特异性试验结果显示,除含副结核分枝杆菌的乳样为阳性外,含其他细菌的乳样均为阴性,表明本方法特异性强。结论已成功建立套式PCR检测方法,可用于牛乳中副结核分枝杆菌的检测。     

小分子检测技术在快速检测和鉴定细菌病原体中的价值

目前,许多耐药病原菌如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐万古霉素肠球菌(VRE)以及多重耐药的结核分枝杆菌(MDR-TB)等都呈上升趋势。传统的微生物诊断方法已不能满足临床诊断需要,而分子生物学的快速发展,许多新的分子检测技术的出现都使得临床快速、准确的诊断变成了可能,这其中包括核酸肽荧光原位杂交(PNA-FISH)、实时荧光PCR和小分子焦磷酸序列测定方法。     

实时荧光PCR法快速检测乙型肝炎病毒基因YMDD突变株

目的建立一种敏感、特异、快速的实时荧光PCR定量检测乙型肝炎病毒基因YMDD突变株的方法,为临床治疗提供指导。方法设计引物和TaqMan-MGB探针,利用TaqMan-MGB探针技术,建立实时荧光定量PCR法。检测临床HBV-YMDD变异标本36份和野生型HBV标本20份,并将其YMDD变异结果与DNA测序结果进行比较。结果该方法检测灵敏度为101拷贝/μl;特异性为100%;最低检测限度为101DNA拷贝/30μl反应体系;实时荧光PCR方法测得YMDD野生株20份,变异株36份,与DNA测序结果完全一致,符合率为100%。结论应用TaqMan-MGB探针的实时荧光定量PCR方法检测YMDD变异株基因,具有灵敏、特异和精确等优点,对临床监测拉米夫定耐药具有重要意义。     

牛乳中蜡样芽孢杆菌荧光定量PCR检测方法的建立及验证

目的建立一种快速检测牛乳中蜡样芽孢杆菌的荧光定量PCR方法,并进行验证。方法根据GenBank中登录的蜡样芽孢杆菌gyrB基因序列及荧光定量PCR要求,设计合适的特异性引物,提取菌体DNA,对目的基因进行扩增及克隆;以重组质粒为模板进行荧光定量PCR扩增,绘制标准曲线;以蜡样芽孢杆菌DNA为模板进行荧光定量PCR扩增,确定其扩增条件。对建立的方法进行特异性及灵敏性验证。结果建立的方法检测其他3种牛乳中常见致病菌(大肠埃希菌、志贺菌、沙门菌)未见特异性扩增,即无交叉反应;最低检出限为1×10~(-7) ng/μL。以掺入蜡样芽孢杆菌的牛乳为样品,可检测到牛乳中10. 4 CFU/mL的蜡样芽孢杆菌,优于国标方法(GB 4789. 14-2014)检测含有相同菌落数的蜡样芽孢杆菌(仅能检测到1. 04×10~2 CFU/mL)。结论建立的方法特异性强,灵敏性高,适用于快速、准确检测牛乳中的蜡样芽孢杆菌,为实验室快速检测致病菌提供了参考。     

荧光定量PCR技术在食品包装材料致病菌监测中的应用

建立一种新型检测食品包装材料致病菌的检测技术。采用荧光定量PCR方法对致病菌的目的基因进行扩增,结果表明荧光定量PCR可以灵敏快速的检测出包装材料中的致病菌。该方法具有良好的检测特异性,可实现食品包装材料致病菌的快速检测,为食品安全检测提供了一种快速准确的新型检测技术。     

A Kinetic Study of In Vitro Lysis of Mycobacterium smegmatis

The traditional diagnostic tests for tuberculosis consist of an acid fast stain and a culture test from a sputum sample. With the emergence of drug resistant strains of tuberculosis, nucleic acid amplification has become the diagnostic test of choice. The nucleic acid amplification test consists of four steps: sputum sample collection, lysis of bacilli to release DNA, DNA amplification by PCR and detection of PCR products. The DNA extraction step has been largely overlooked and this study describes a systematic approach to measure the kinetics of cell lysis in a Tris-EDTA buffer. Mycobacterium smegmatis is a saphorytic, fast-growing mycobacterium that is often used as a surrogate of Mycobacterium tuberculosis in laboratory studies. M. smegmatis cells have been transformed with green fluorescent protein (GFP) genes. Transformed cells are lysed in a temperature-controlled cuvette that is equipped with optical input/output. The fluorescence signal increases when the GFP is released from lysed cells, and the extent of lysis of the loaded cells can be followed in real time. The experimental results are complemented by two theoretical models. The first model is based on a Monte Carlo simulation of the lysis process and the accompanying probability density function, as described by the Fokker-Planck equation. The second model follows a chemical reaction engineering approach: the cell wall is modeled as layers, where each layer is made up of “blocks”. Blocks can only be removed if they are exposed to the lysis solution and the model describes the rate of block exposure and removal. Both models are consistent with the experimental results. The main findings are: (1) the activation energy for M. smegmatis lysis in Tris-EDTA buffer is 22.1 kcal/mol, (2) cells lyse on the average after 14-17% loss in cell wall thickness locally, (3) with the help of the models, the initial distribution in cell wall thickness of the population can be resolved and (4) near complete lysis of the cells is accomplished in 200 s at 80 °C (90 s at 90 °C). The results can be used to design an optimal lysis protocol that compromises between shorter processing times at higher temperature and reduced thermal damage to DNA at lower temperature.     

结核分枝杆菌ESAT-6基因的克隆与序列分析

目的:克隆并鉴定结核分枝杆菌ESAT-6基因。方法:笔者首先获得了结核分枝杆菌基因组,利用PCR的方法得到288bp的ESAT-6基因。连接到克隆质粒载体pGEM-T中,以大肠杆菌JM109作为受体菌转化,通过筛选克隆并提取质粒,利用酶切鉴定、PCR鉴定、以及序列,来证明重组质粒pGEM-T-ESAT-6中含有结核分枝杆菌ESAT-6基因。结果:成功克隆了结核分枝杆菌ESAT-6蛋白基因。     

应用等位基因特异性扩增法快速检测结核分支杆菌对利福平的耐药性

目的　建立一套等位基因特异性扩增 (ASA)的检测体系 ,用于结核分支杆菌对利福平耐药性的快速检测。方法　根据结核分支杆菌野生型基因设计ASA特异性引物 ,ASAPCR扩增 39株结核杆菌利福平耐药株的rpoB基因 ,经琼脂糖凝胶电泳检测 ,进而推断利福平的耐药性 ;同时进行DNA序列测定以验证ASA法的检测结果 ,并分析上海地区结核杆菌rpoB基因的突变特点。结果　在 39株利福平耐药株中共检出 36株 ,敏感性为92 3% ;与DNA测序结果的符合率为 87.2 % ,并鉴定了 11种不同类型的 4 1种突变形式 ,其中包括 9种点突变和 2种基因缺失。结论　用等位基因特异性扩增法分析结核分支杆菌的rpoB基因突变具有较高的特异性与敏感性。该法快速、简便、可靠 ,可应用于临床利福平耐药性的检测。     

结核分枝杆菌RD1区重组11 kD蛋白的克隆表达及效力

目的在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌RD1区11kD蛋白,并检测表达产物的效力。方法构建11kD蛋白编码基因原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)IPTG诱导表达,离子层析柱分离纯化重组蛋白。以结核分枝杆菌致敏豚鼠进行皮肤变态反应(DTH)测定。结果结核分枝杆菌11kD蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达,表达蛋白占总菌体蛋白的33%以上,纯化后纯度达95%以上,并可诱导结核分枝杆菌致敏豚鼠产生迟发型超敏反应,5μg/ml11kD蛋白的效力与50IU/ml TB-PPD相当。结论重组11kD蛋白已在大肠杆菌中成功表达,并有望成为结核病皮试鉴别诊断用新试剂。     

以结核分枝杆菌38kD重组蛋白为抗原的血清学诊断

目的克隆表达结核分枝杆菌38kD抗原基因,并以此蛋白为抗原,进行分枝杆菌的血清学诊断。方法采用PCR自结核分枝杆菌基因组DNA中扩增38kD抗原基因,经测序鉴定正确后,克隆于pGEX-4T-2表达载体,转化大肠杆菌BL21进行诱导表达,利用GSTrapFF蛋白柱纯化表达产物,经ELISA检测其抗原的灵敏度与特异性。结果目的蛋白表达量约占菌体总蛋白量的28%,ELISA检测灵敏度为79.8%,特异性为99.0%。结论重组38kD抗原可用于结核分枝杆菌的诊断。     

结核分枝杆菌H_(37)Rv株Rv0341编码基因iniB的克隆与表达

目的克隆并表达编码结核分枝杆菌H37Rv株Rv0341蛋白的iniB基因。方法利用PCR从结核分枝杆菌H37Rv株中扩增iniB基因,克隆于pET-22b(+)原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,镍离子亲和层析柱纯化后,通过SDS-PAGE和Western-blot鉴定目的蛋白的表达及反应原性。结果克隆并表达了iniB基因,表达的蛋白相对分子质量约43000,诱导2h表达量较高,约为25%。目的蛋白主要以包涵体形式存在于超声沉淀中,纯化后蛋白纯度可达98%以上。经Western blot检测,纯化蛋白与依赖利福平结核分枝杆菌(依R菌)肺结核患者血清呈现强阳性反应,而与非依R菌肺结核患者血清不反应。结论已成功克隆并表达了编码结核分枝杆菌H37Rv株Rv0341蛋白的iniB基因,表达的重组蛋白具有反应原性及特异性,为依R菌结核病临床血清学快速诊断方法的建立及试剂盒的研发奠定了基础。     

结核分枝杆菌ESAT-6重组二聚体的表达、纯化及其在血清学诊断中的初步应用

目的表达和纯化结核分枝杆菌早期分泌蛋白ESAT-6重组二聚体(rdESAT-6),并探讨其在结核病血清学诊断中的价值。方法以HG856A核酸疫苗质粒为模板,经PCR扩增获得2×esat-6基因,克隆至pET-28a质粒,构建原核表达质粒pET2E6;转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;用Ni2+柱亲和层析纯化重组蛋白,并用Western blot鉴定其反应原性,ELISA检测其敏感性和特异性。结果ESAT-6重组二聚体以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的35%;纯化的rdESAT-6纯度可达95%,可与ESAT-6小鼠抗血清发生特异性反应;用于结核病血清学诊断的敏感性为30%,特异性为95.8%。结论已成功表达并纯化了rdESAT-6,可作为结核病血清学诊断或皮试检测用的抗原之一。     

结核分枝杆菌PPE68蛋白的原核表达及纯化

目的构建结核分枝杆菌PPE68基因的原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR法扩增PPE68基因,将其克隆至pET-32a(+)载体中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPE68,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,进行纯化。结果重组表达质粒pET-32a(+)-PPE68经PCR及双酶切鉴定构建正确,测序结果与GenBank中登录的PPE68基因序列一致。表达的Trx-PPE68融合蛋白相对分子质量约为57000,表达量约占菌体总蛋白的41%,可与结核分枝杆菌免疫小鼠血清发生特异性反应。纯化的重组蛋白纯度约为93%。结论已成功构建了结核分枝杆菌PPE68基因重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPE68,原核表达并纯化了重组蛋白,为PPE68作为结核病特异性诊断抗原的开发及重组BCG疫苗的研制奠定了基础。     

结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌分泌蛋白指纹图谱的比较

目的比较结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌分泌蛋白的指纹图谱,分析分泌蛋白表达的差异,为分枝杆菌的快速鉴别奠定基础。方法选取结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌标准菌株,培养后灭活,提取分泌蛋白,用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)检测菌株分泌蛋白的表达,Biomaker Wizard Software分析软件筛选差异蛋白。重复测定20次分枝杆菌分泌蛋白,评价SELDI-TOF-MS检测分枝杆菌分泌蛋白相对分子质量的重复性。结果AU芯片能捕获近30个分枝杆菌分泌蛋白峰,4个蛋白峰为分枝杆菌共有。与非结核分枝杆菌分泌蛋白指纹图谱比较,有1个蛋白峰为结核分枝杆菌所特有。SELDI-TOF-MS重复检测20次分枝杆菌分泌蛋白显示,同一蛋白峰的相对分子质量变异系数≤0.05%。结论结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌差异蛋白的发现,可能有助于分枝杆菌的鉴别。