多重PCR 检测转基因水稻的转基因成分

以水稻内源基因SPS、外源抗虫基因Cry1Ab、外源抗虫基因Cry1Ab/Ac、外源抗虫基因Btc、报告基因GUS、NOS终止子和CaMV35S启动子为检测对象,设计7对引物,通过优化PCR扩增体系中不同引物浓度的配比及退火温度,建立水稻转基因成分的七重PCR检测体系。结果表明：建立的七重PCR体系能有效检测出水稻及其他作物(大豆、玉米、棉花籽、菜籽粕)中的转基因成分,检测过程简便、特异性好。     

大豆加工食品中转基因成分多重PCR检测体系的建立

以大豆内源基因 (Lectin)、筛选基因 3 5S启动子 (Cauliflowermosaicvirus 3 5S ,CaMV3 5S)、Nos终止子 (Nopalinesynthase,Nos)和外源基因 (5 enolpyruvylshikimate 3 phosphatesynthase ,Ep sps)为检测对象 ,通过对PCR扩增体系中各引物终浓度及PCR扩增过程中退火温度的探讨 ,研究了不同引物终浓度配比及退火温度对转基因大豆多重PCR检测的影响 ,建立了大豆加工食品中转基因成分多重PCR检测体系。结果表明 ,当各组引物的终浓度分别为 1 0、2 0、2 0、3 0 μmol/L即引物终浓度配比为 1∶2∶2∶3 ,退火温度为 5 5 4℃时 ,所建立的多重PCR检测方法能够有效地检测出大豆中的转基因成分 ,具有特异性好 ,简便 ,快速 ,准确等优点。     

玉米及其制品中转基因成分的单一 PCR及多重PCR检测

采用CTAB法提取玉米及其制品的总DNA，用PCR方法检测其中的转基因成分如花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaic virus，CaMV）35S启动子、根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）胭脂碱合成酶甚因（nos）终止子、根癌农杆菌CP4菌株的EPSPS基因、吸水链霉菌（Treptomyces hygroscopicus）bar基因及苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种（Bacillus thuringiensis subsp．kurstaki）crylA（b）基因，筛选到阳性样品，并建立了几组玉米内源zein基因和转基因成分之间的多重PCR检测方法。结果表明，建立的多重PCR方法用于同时检测玉米内源基因和转基因成分是可行的，值得推广；虽然我国还未有己获准商品化生产的转基因玉米，但国外转基因玉米已流入福建省。     

食品中转基因成分的PCR快速检测研究

为建立食品中转基因成分的快速检测方法，针对转基因大豆、玉米、油菜的多个相对稳定的转基因元件，包括35S、NOS、EPSPS、Cry1A、NPTⅡ等基因，同时选定植物本身固有的基因：大豆Lectin、玉米IVR、油菜Napin基因作为内源参照指示基因，设计、筛选出9对引物分别组成多重PCR．结合高灵敏度的聚丙烯酰胺凝胶电泳组成快速检测体系对转基因食品进行检测，1～2d能完成整个检测过程。经测试：该检测体系稳定可靠、灵敏准确、特异性好，且操作简便、成本低廉，是一种进行转基因食品检测的良好技术模式。     

应用多重PCR技术快速筛查食品中的转基因成分

以转基因植物中常见的3种筛选调控元件、2种标记基因和1种目的基因为检测靶标,建立了能在一次PCR扩增中同时检测6种转基因成分的多重PCR检测方法。结果表明,当多重PCR体系中Ca MV35S启动子、Fa MV35S启动子、NOS终止子、bar基因、NPTII基因、CP4-EPSPS基因的检测引物浓度分别为0.2、0.2、0.3、0.3、0.2、0.2μmol/L,退火温度为60℃时扩增效果最佳,利用优化后的六重PCR方法可从转基因玉米、大豆、棉花、油菜等各类样品中精准检测出相应的转基因成分,方法的检测灵敏度可达到0.1%。该方法为食品中常见转基因成分的筛查提供了一种高效的手段,在转基因产品的检测工作中具有较高的应用价值。     

实时荧光PCR定量检测加工产品中转基因玉米Mon810成分

采用实时荧光PCR技术，建立了定量(性)鉴定检测加工产品中转基因玉米Mon810成分的方法。实验设计的可以扩增玉米自身基因和外源基因边界序列的引物和探针具有品种和品系特异性，特异性地检测出食品、饲料等加工产品中转基因玉米Mon810成分。某些检测样品不仅检出转基因玉米Mon810成分，还同时检出其它转基因玉米品系或其它转基因品种。本研究实验建立的转基因玉米Mon810品系鉴定检测方法，即可以用于加工产品中转基因成分的定量检测(检测低限为0．1％)，也可以用于定性检测，或作为常规PCR定性检测后的确证实验方法。     

微滴式数字PCR定量检测转基因玉米品系VCO-01981-5

建立基于QX100微滴式数字聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)平台的我国未批准转基因玉米品系VCO-01981-5的二重微滴式数字PCR定量检测方法。该方法选择基因组中单拷贝的玉米内源基因hmg和VCO-01981-5品系边界序列为定量靶序列,分别设计不同的PCR扩增引物和TaqMan探针,并对两种探针用不同的荧光进行标记,然后将上述探针和引物置于同一个PCR反应体系中以同时定量两个靶标序列。特异性实验结果显示该法只有VCO-01981-5品系的两个靶序列才都有扩增信号。灵敏度、线性和准确性实验结果显示在定量结果相对标准偏差不大于25%时,最低可稳定定量5个拷贝的VCO-01981-5品系特异性序列分子和4个拷贝的内源基因hmg分子;而在高达50 ng模板DNA以下范围内,PCR反应模板量与测定样品拷贝数之间呈高度正相关,相关系数达0.99以上;平均误差小于10%。结果表明本研究建立的该玉米品系定量方法特异性强,稳定性好,精确性、准确性以及灵敏度高,定量范围广,可用于进、出口农产品和食品中该转基因玉米品系成分的定量检测。此外,该法还可为其他转基因玉米品系及其他转基因作物品系建立类似定量检测方法提供参考。     

多重串联式PCR基因碟片技术检测转基因大豆GTS 40-3-2

建立多重串联式PCR(MT-PCR)的基因碟片技术用于转基因大豆GTS40-3-2的检测。针对GTS 40-3-2的常见外源基因NOS终止子、CP4-EPSPS、Ca MV35S启动子和大豆内源基因Lectin设计引物,同时针对外源基因插入位点的旁临序列设计品系特异性引物。首先进行一次循环数较少(15 cycles),引物浓度较低(0.1μmol/L)的高通量多重PCR,以均匀地扩增各基因模板,同时避免引物之间的竞争,然后利用巢式荧光定量PCR检测各个基因。根据熔融曲线分析结果,灵敏度高于普通荧光定量PCR法1个数量级。该方法能够快速、高通量、准确地检测转基因大豆GTS40-3-2中的多种转基因成分,并能对该品系进行分析,重复性好,适合转基因的高通量、定量检测,可用于特异性检测转基因大豆GTS40-3-2,具有较好的应用价值。     

转基因玉米品系及转化体成分四重实时荧光PCR快速鉴定

Bt11转基因玉米品系具有抗草铵膦除草剂,鳞翅目昆虫抗性的耐除草剂抗虫玉米,MIR162和Mon89034是鳞翅目昆虫抗性的单抗虫玉米,均是国内外出入境监管主要关注的转基因玉米品系。本研究通过靶标基因筛选,转基因阳性样品采集,核酸样本制备,多重引物和荧光探针组合筛选,反应体系优化以及方法学验证等过程开发建立了四重荧光定量PCR检测技术。结果表明该技术的使用可实现一个反应管中同时检测MIR162、Bt11、Mon89034三个玉米品系的特异性基因序列和一个编码玉米淀粉合成酶异构体zSTSII-2 (zSSIIb) 玉米内源基因。通过阳性对照,阴性对照和空白对照特异性S曲线与对应的阈值大小分析可判定样品中是否含有这三个转基因玉米品系及其转化体成分。经方法学特异性检测,结果与转基因检测金标准的单实时荧光PCR结果一致;经平行样和灵敏度测试,最低检测限为18个拷贝;经标准曲线扩增分析,四个基因的扩增效率均在90%~110%范围内,扩增效果良好。该方法从DNA提取到报告结果不足3小时,可缩短检测时限,节约试剂耗材成本,操作简单易行,满足高通量特征,可为市场流通产品品系和转基因成分的实时监管和快速鉴定提供技术支撑。     

大豆及其制品中转基因成分的二重PCR检测

为了建立能同时检测多种转基因成分的二重PCR检测方法,以转基因大豆(RoundupReady品种)为实验材料,优化了二重PCR的反应体系和反应条件,包括引物浓度、TaqDNA酶用量和退火温度等;比较了二重PCR和单一PCR的灵敏度和检测含量。结果表明:二重PCR的灵敏度和检测含量与单一PCR的相当;用建立的二重PCR方法从大豆、豆腐、豆粕和油炸豆腐中筛选出含转基因成分的阳性样品;二重PCR与单一PCR相比,具有节约试剂、省时等特点,在转基因产品检测上具有很好的推广价值。     

Event-Specific Qualitative and Quantitative Detection in Transgenic Soybean OsDREB3 Based on the 5′ Flanking Sequence

With the development of genetically modified organisms, labeling regulations have been introduced that require appropriate detection methods. Event-specific qualitative and quantitative polymerase chain reaction (PCR) detection methods have become the internationally agreed state-of-the art. Using adaptor PCR, we analyzed the flanking sequences of exogenous integrant in transgenic soybean OsDREB3, which has resistance genes. In this study 5′ region flanking sequences of exogenous gene were identified in the soybean OsDREB3 genome, which was integrated in chromosome 1 with an additional 394 bp insertion between soybean genomic DNA and exogenous gene. Based on these inserts and flanking sequences, the event-specific qualitative and quantitative PCR system was established for this line. In the conventional qualitative PCR assay, the event-specific primers designed were confirmed to be specific and the limit of detection (LOD) was 0.1%. In the quantitative real-time PCR assay, the LOD and the limit of quantity were 10 and 100 haploid genome copies, respectively. The goodness of the linearity and high efficiency of the PCR reaction indicated the utility of the established PCR system. This study provides two reliable methods and information for detection, identification, and quantification of the presence of non-authorized transgenic soybean OsDREB3.     

VEGF基因油体表达系统构建及对拟南芥的遗传转化

为研究油体系统在植物中表达外源蛋白的优势,以油菜总DNA 为模板,通过PCR 得到油菜油体(Ycoil)及启动子序列(Ycprm)。同时,将多对合成的寡核苷酸链,通过PCR 方法拼接得到血管内皮生长因子全长基因(VEGF)。以此为基础,构建Ycoil、Ycprm、VEGF 融合表达载体p1390Ycprm-Ycoil-VEGF。将重组质粒转入农杆 菌GV3101,并用花浸染法对拟南芥进行浸染。在含潮霉素(20mg/L)的1/2MS 培养基上筛选转基因拟南芥种子(T0),获得了T1 代抗性植株,通过PCR 检测、SDS-PAGE 检测和Western blotting 检测,结果表明油菜油体及血管内皮生长因子的融合基因已经转入拟南芥中,并成功得到表达,转化率约为0.1%。     

多重实时荧光定量PCR分析转基因烟草外源基因拷贝数

[目的]采用多重实时荧光定量PCR方法在一个反应内同时检测转基因烟草中插入外源基因35S、NOS、NPT Ⅱ的拷贝数。[方法]将转基因阳性参照烟草基因组DNA经梯度稀释,通过多重荧光定量PCR反应同时获得烟草内源参照基因NR、外源基因35S、NOS、NPT Ⅱ的相关性标准曲线方程,将待测株系外源基因的Ct值代入标准曲线方程后估算其拷贝数。[结果]获得了上述4个基因的标准曲线,其R2均接近于1,相关性较高。在检测的六个转基因株系中初筛到3株3个外源基因均为单拷贝的株系。[结论]可使用该方法对转基因烟草外源基因插入拷贝数进行估算,为获得稳定遗传材料提供初筛依据。      

TaqMan探针用于转基因食品的荧光定量PCR检测

选择了内源基因大豆植物凝集素 (lectin)、玉米转化酶 (invertase)和外源基因抗草甘膦除草剂的 5 烯醇式丙酮酰莽草酸 3 磷酸合成酶 (cp4epsps)、抗欧洲玉米螟的苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白 (cryIAb)的TaqMan探针 ,确定了探针浓度和镁离子浓度等反应条件 ,分别对转基因大豆和转基因玉米系列标准品进行内源基因和外源基因的荧光PCR扩增 ,在PCR反应过程中分别以TET和FAM两种荧光通道信号分别追踪同一样品DNA的内源基因和外源基因的扩增动力学变化 ,并依此绘制了ΔCt值与转基因食品百分比含量之间的标准曲线 ,建立了转基因大豆和转基因玉米的TaqMan -荧光定量PCR检测方法 ,该方法具有探针设计较简便、成本较低的特点 ,初步实现了对转基因食品的定量分析及品种鉴定。     

叶片衰老诱导FLP重组酶删除转基因烟草外源基因的研究

  目的   “Gene-deletor”系统可实现转基因植物中外源基因的清除。为了研究该系统在转基因烟草中对清除外源基因的作用并最终创制不含外源基因的烟草新种质。  方法   以含有“Gene-deletor”系统的转基因烟株为材料,分析外源筛合报告选融基因Bar::GUS、重组酶基因FLP在不同叶龄叶片中的表达水平,同时通过观察转基因烟草花粉中GUS蛋白的表达活性,分析外源基因GUS在花粉中的删除情况。  结果   （1）相同叶龄不同转基因烟株叶片均表现出GUS活性和对除草剂草铵膦抗性,且3个转基因烟草株系中GUS活性和对除草剂抗性都表现出随着叶龄增大而降低的特点。（2）Real-time PCR和RT-PCR结果进一步证明外源Bar::GUS基因表达水平随叶片发育成熟持续下降,而外源FLP基因的表达水平则出现先增后降的变化趋势,在测定后期两者的表达量均达到最低,（3）花粉GUS组织染色结果表明,“明,色结果降的变化趋势,特系统诱导各转基因植株中花粉外源基因清除效率不同,平均清除率分别78.3%,54.7%和75.2%。  结论   在转基因烟草中,叶片衰老特异表达基因SAG12基因启动子驱动“动启动子驱动达基因,平均清系统（LoxP/FRT）的表达不仅可引起转基因植株叶片中外源基因的特异性清除,还能诱导花粉中外源基因的删除,该技术可为进一步创制培育不含外源基因的烟草新种质提供参考。      

转基因大豆MON89788双重数字PCR通用定量检测方法的建立

建立一种特异、稳定、灵敏、通用的转基因大豆MON89788品系双重数字聚合酶链式反应（digital polymerase chain reaction,dPCR）定量检测方法,在一个体系内同时进行内外源基因的定量检测,适用于微滴式数字PCR（droplet digital PCR,ddPCR）和芯片式数字PCR（chip digital PCR,cdPCR）平台,并通过了食品分析能力评价体系国际能力验证项目的盲样检测评价。ddPCR平台对大豆MON89788品系和内源Lectin的绝对定量限分别为8.0copies/μL和8.2copies/μL;cdPCR平台对大豆MON89788品系和内源Lectin的绝对定量限分别为7.443copies/μL和7.646copies/μL;ddPCR和cdPCR对转基因大豆MON89788品系成分相对含量的相对定量限均为0.1%。     

Effect of critical processing procedures on transgenic components in quality and quantity level during soymilk processing of Roundup Ready Soybean

By taking 2.5% (w/w) transgenic Roundup Ready Soybean as raw materials, with the detecting technology of traditional PCR and real-time fluorescence quantitative PCR, this study analyzed the influence of such critical processing procedures as jordaning, siruping, blending, homogenization and sterilization in soymilk preparation on the fragment size of endogenous gene lectin and exogenous gene epsps, as well as the quantification of transgenic component in Roundup Ready Soybean, and discussed the degradation mechanism of DNA in the course of transgenic soybean processing. The results indicated that, different processing procedures differ in their impact on the degradation of endogenous gene and exogenous gene. Physical mechanical action, such as the jordaning, can make endogenous and exogenous genes degrade, and has more effect on the later. The jordaning process degraded the DNA of endogenous gene from 1883 to about 836 bp, and exogenous gene from 1512 bp to about 408 bp. In the blending procedure, exogenous gene DNA was also degraded from about 408 to 190 bp, but there was no obviously action on the endogenous gene. After the endogenous and the exogenous genes were degraded to some degree, such as 836 and 408 bp, respectively, they were not evidently affected by siruping procedure at 100 °C for 15 min. However, endogenous gene was further considerably degraded from around 836 to 162 bp in the sterilization procedure at 121 °C for 30 s. The effect of the homogenization step on endogenous and exogenous genes was similar to that of siruping procedure. In addition, jordaning and siruping greatly damaged to exogenous gene, which rapidly decreased the transgenic content from 2.5 to 1.656% and 0.435%, respectively. While the endogenous gene was not evidently affected by the blending and homogenization procedures, the exogenous gene DNA was remarkably degraded in the two procedures. Therefore, the transgenic content continued decreased to 0.377% after homogenization procedure. Hereafter, the endogenous gene was further considerably degraded more than the exogenous gene in the sterilization procedure, which caused a little bounce of the transgenic content in the final product to 0.518%.     

米曲霉pyrG 基因克隆及其同源转化系统的建立

建立以乳清酸核苷-5＇- 磷酸脱羧酶基因(pyrG)为选择标志,以米曲霉为宿主菌的同源转化系统。以米曲霉基因组为模板,通过PCR 扩增获得pyrG 基因,将该片段与表达载体pMD18-T 相连,转化大肠杆菌DH 5α,经蓝白斑筛选、PCR 快速筛选、酶切和测序验证,获得重组质粒pMD-pyrG,完成pyrG 基因的克隆。序列分析表明该基因与米曲霉KBN616 的pyrG 基因编码序列的同源性为99.9%,两者经推导的氨基酸的同源性为99.6%。以米曲霉 pyrG 营养缺陷株为受体菌,通过PEG/CaCl2 诱导的原生质体转化方法,将重组质粒导入该受体菌,使米曲霉pyrG 缺陷株发生基因转化,成为pyrG+,由此成功建立了以pyrG 为筛选标记基因、同型米曲霉pyrG 基因缺陷株为受体菌的基因转化系统。