树干毕赤酵母基因组文库的构建及纤维二糖酶基因的筛选

首次构建了树干毕赤酵母DNA基因组文库,该文库包含3 000个克隆,插入片段长度为0.5～8.0 kb。树干毕赤酵母染色体基因为15 441 179 bp,该文库覆盖1.08倍树干毕赤酵母染色体基因,筛选出任一基因或序列的概率为97%。提取文库中的质粒醋酸锂法转化酿酒酵母W303-1A,涂布于纤维二糖为唯一碳源的平板,通过纤维二糖酶对底物纤维二糖的底物特异性筛选文库,首次获得树干毕赤酵母来源的一个1.82 kb的纤维二糖酶基因。     

重组毕赤酵母产凝乳酶发酵条件研究

以重组毕赤酵母GS115/pPICZaA-Prochy为凝乳酶生产菌种,研究其在5L发酵罐水平的最佳产酶条件,为中试生产提供依据.采用批量发酵,甲醇浓度0.1％,诱导阶段每12h添加10g/L蛋白胨,发酵液pH值为3.0,油酸浓度0.2％,诱导初期批量加入10g/L山梨醇共基培养,诱导84h可获得152SU/mL的酶活力.采用十二烷基磺酸钠-苯琼脂糖凝胶电泳分析,在发酵液(去菌体后)样品盐离子浓度2mol/L,流速2.5mL/min,酶回收率达到82％,浓缩倍数20倍.     

固态发酵生产高活力纤维二糖酶

在固态发酵条件下,对７个纤维二糖酶生产菌株进行了筛选,发现ＡｓｐｅｒｇｉｌｕｓｎｉｇｅｒＬＯＲＲＥ０１２为纤维二糖酶高产菌株。研究了培养时间、温度、培养基含水量及初始ｐＨ等因子对该菌形成纤维二糖酶的影响。当培养基采用自然ｐＨ（约６．０）、含水量７０％,接种后在３０℃下先培养２ｄ,再在２５℃下培养２ｄ,每克干酶曲所含的纤维二糖酶活力可达到４３０．５６ＩＵ。由此获得的纤维二糖酶曲与Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｓｅｉ产生的纤维素酶曲在糖化纸浆过程中有明显的协同作用,当两者以１∶１０混合使用时（纤维二糖酶与滤纸酶活力之比约为０．４４）,可有效地消除水解产物中纤维二糖的累积,使纤维纸浆的酶水解得率高达９０．７％。     

毕赤酵母发酵产木聚糖酶条件研究

对产木聚糖酶的毕赤酵母进行5L罐发酵研究,确定了5L罐发酵的最佳种龄是24h,最佳接种量是10%.通过对pH值、搅拌转速、温度、空气流量进行正交设计试验,得出结论:pH值和温度是影响产酶的主要影响因子,并结合实际情况,得到5L罐发酵产木聚糖酶的工艺条件:pH值为5.5,温度为30.0℃,空气流量3L/min,搅拌转速为300r/min,发酵130h,毕赤酵母发酵产木聚糖酶的酶活为2780U/mL.     

重组毕赤酵母产果糖基转移酶发酵条件的优化

果糖基转移酶(EC 2.4.1.9)是利用蔗糖为底物制备低聚果糖的关键酶。利用前期构建的产果糖基转移酶的重组毕赤酵母为出发菌株,对其进行发酵优化。最适发酵产酶条件为:装液量30 m L/250 m L、V(甘油)∶V(甲醇)=1∶20、初始pH为5.5、诱导温度为30℃、初始甲醇浓度为1.0%、后续甲醇浓度为1.5%、硫酸铵浓度10 g/L、诱导时间为120 h。在优化的发酵产酶条件下,重组果糖基转移酶酶活力达218.3 U/m L,较优化前提高了5倍。     

毕赤酵母液态发酵产木聚糖酶条件研究

用麦麸、米糠农业废弃物作为主要原料生产木聚糖酶,对毕赤酵母液态发酵产木聚糖酶的条件进行研究。结果表明,最适产酶条件:以质量浓度20%的麦麸作为碳源,4%酵母浸膏作为氮源,调节初始pH值5.5,培养温度30℃,摇瓶发酵装液量6%,培养时间130 h,在此条件下毕赤酵母液态发酵产木聚糖酶最高活力达到2192 IU/mL。     

重组毕赤酵母产凝乳酶发酵参数优化的研究

以重组毕赤酵母GS115PJ5(含微小毛霉凝乳酶基因)为研究对象,通过单因素实验确定其最佳生长条件:培养温度30℃、培养基pH值5.2、摇床转速280r/min、培养基装瓶量5%(12.5mL/250mL)。在单因素实验的基础上通过Plackett-Burman实验筛选出培养基装瓶量、甲醇添加量、培养基pH值等3个影响重组毕赤酵母产凝乳酶的主要因素,并通过响应面实验确定三者有利于产酶的最佳值分别为13.06%、1.52%、6.15,在此条件下,凝乳酶活力达到最大值即491.7SU/mL,验证实验证明模型预测值准确、可靠。     

毕赤酵母工程菌发酵条件的优化

从碳源、生物素、接种比率、甲醇浓度、pH、诱导时间等方面对重组酵母摇瓶发酵条件进行了研究,初步确认了摇瓶水平发酵各因素的最优条件,发现控制适宜的甲醇浓度十分重要。同时,利用30L发酵罐对长时间甲醇诱导发酵做了研究,发现随着发酵时间的增加,分泌蛋白产量先增加然后下降,菌体生长速度放慢,但菌体湿重一直在增加。      

毕赤酵母产类人胶原蛋白发酵条件的优化

胶原蛋白是结缔组织中一种重要蛋白质,具有抗皱、抗老化和补钙壮骨的功效,在食品工业中应用广泛.由于胶原蛋白的需求量大,因此利用重组微生物生产胶原蛋白成为近年来的研究热点.该文采用重组有类人胶原蛋白基因的毕赤酵母,通过优化培养基成分,使其在无机盐培养基中表达胶原蛋白.首先,类人胶原蛋白在每24 h补加体积分数1.5％甲醇诱...     

重组毕赤酵母生产凝乳酶发酵优化

为了获得毕赤酵母生产凝乳酶的最佳发酵条件,分别从起始诱导OD600、甲醇诱导浓度以及p H等方面研究了P.pastoris GS115在3.6 L发酵罐中表达微小根毛霉来源凝乳酶的高密度发酵,以恒溶氧反馈调节补加甘油和甲醇检测流加控制器在线监测流加甲醇。结果表明,在重组P.pastoris GS115/p PIC9k-chy起始诱导,OD600和甲醇诱导体积分数分别为150和2.0%,诱导p H为5.0时,发酵96 h凝乳酶活达到最大,为1 870 SU/m L,此时对应的生产强度和产物得率均达到最高水平,分别为19.48 SU/(m L·h)和2.42 SU/m L,总蛋白质质量浓度为0.64 mg/m L,凝乳活性与蛋白质水解活性的比值(MCA/PA)为63.43。     

毕赤酵母单宁酶工程菌在固、液发酵中的性质差异分析

探究固、液发酵方式在重组毕赤酵母单宁酶工程菌的形态、产酶量及酶学特性等方面的差异。研究发现，重组菌株在固、液发酵方式下表现出了较大差异。固态发酵条件下，重组菌株能够积累更多的生物量，当培养48 h后积累的生物量比液态发酵高22.3%；经电镜分析发现，固态条件下，重组菌株个体之间更容易出现聚集，并伴随着有生物膜的产生；在不同甲醇体积分数诱导下，固、液发酵的重组菌株的产酶量均出现了先升高后降低的趋势，而诱导两者最高产酶量的甲醇体积分数却存在差异，分别是2%和3%。进一步研究发现，固、液发酵条件下，重组菌株发酵的单宁酶酶学性质也存在一定差异，固、液态发酵单宁酶的最适反应温度分别为30 ℃和为20 ℃，且酶的热稳定性也有一定提高，其余酶学性质差异不显著。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳分析发现，固态发酵生产的单宁酶存在不同的修饰，这可能是造成上述性质差异的原因之一。综上所述，本研究探究了固、液发酵条件下，重组单宁酶毕赤酵母菌株生长及产酶特性的差异，为高效制备单宁酶提供了一定的理论指导。     

毕赤酵母产α-葡聚糖酶发酵工艺研究

对毕赤酵母液体发酵产α-葡聚糖酶的主要影响因子进行了研究,考察了影响外源蛋白表达的因素,包括碳氮源、pH、装液量、接种量、温度等,单因素实验结果表明最佳培养及发酵条件为：最佳碳源氮源分别为甘油和YNB,甲醇诱导浓度为1．5％,pH为5．5～6．0,装液量为25mL／250mL,接种量为10％,表面活性剂为0．2％,摇床转速为200r／min。菌株的产酶水平由原来的47．50U／mL提高到73．16U／mL,酶活力提高了约1．5倍。     

重组牙鲆生长激素基因片断在毕赤酵母中的表达

为了开发一种有效的重组牙鲆生长激素(r-fGH)的方法,利用PCR的方法从牙鲆eDNA文库中克隆得到了牙鲆生长激素(fgh)的cDNA片断.接着将这个fgh片断克隆到整合型质粒pAO815,它可以在甲醇诱导启动子的调控下表达外源蛋白.利用这种包含一个fgh插入片段的克隆来构建含有2个和3个头尾顺序排列的fgh表达框的表达质粒.利用氯化锂转化的方法将所构建的质粒转化到毕赤酵母GS115,然后进行筛选、培养和0.5%甲醇诱导表达,最后得到重组表达的牙鲆生长激素.     

毕赤酵母工程菌产植酸酶补料分批发酵研究

对毕赤酵母工程菌PP-MS-NPm-4-16进行了补料分批发酵条件的研究,经摇瓶试验确定了发酵条件,即接种量为4%,生长阶段最适pH值为5.0,诱导阶段最适pH值为5.5,甲醇诱导浓度为30g/L,生长阶段添加豆油浓度为1.3%,诱导阶段豆油浓度为3%。在高密度发酵阶段,恒溶氧流加为最佳甘油补料方式,经过12h甘油补料,菌体密度OD600达145;甲醇诱导96h,酶活可达306.9kU/mL。     

一种通过过表达毕赤酵母翻译相关因子提高重组蛋白胞内表达的策略

本研究为筛选对毕赤酵母重组蛋白表达有促进作用的翻译相关因子,扩增了毕赤酵母中包括核糖体蛋白翻译起始因子、翻译延伸因子、氨酰-tRNA合成酶、核糖体生物合成因子、核糖体分子伴侣五类翻译相关因子(共28个)的基因片段,并将上述基因片段与质粒pPICZA进行同源重组,进一步获得重组载体后分别转化至以增强型绿色荧光蛋白eGFP为报告蛋白的毕赤酵母中。之后通过测量计算120h内28个过表达翻译相关因子菌株的荧光蛋白表达量,筛选对毕赤酵母重组蛋白表达有潜在促进作用的因子,进一步以红色荧光蛋白mRFP为报告蛋白进行验证。结果表明:本研究共筛选到了6个对毕赤酵母重组蛋白胞内表达有促进作用的翻译相关因子eIF4A、eEF1A、eEF3、Ded81、Bcy1、Ssb。其中eIF4A、eEF1A、eEF3、Ded81、Bcy1、Ssb的eGFP单位菌体表达量分别增加了18.40%、18.80%、29.50%、28.45%、21.60%,mRFP单位菌体表达量分别增加了20.00%、8.00%、19.00%、5.40%、15.40%。Bcy1使得eGFP表达菌株生物量增加20.00%,mRFP表达菌株生物量增加30.90%。为从翻译层面提高毕赤酵母重组蛋白表达提供了思路。     

重组毕赤酵母表达人血清白蛋白-人白介素2融合蛋白过程的代谢特性

分析了重组甲醇营养型毕赤酵母在5L多参数自控发酵罐上生产人血清白蛋白-人白介素2融合蛋白(HSA-IL-2)的发酵过程。在使用多种在线传感器和离线检测参数的基础上,应用相关性分析的方法将细胞生长的关键酶(乙醇氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶)酶活和代谢特性相关联。实验结果显示,甲醇诱导后葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶的酶活分别下降了46.1%和66.8%,说明胞内代谢流发生了迁移:三羧酸循环(TCA)和磷酸戊糖途径(HMP)中代谢流通量下降,甲醇完全氧化代谢成为主要代谢流。此外,在不同控制策略下,乙醇氧化酶的酶活和重组蛋白HSA-IL-2表达量也呈现出一定的差异。高溶氧低甲醇控制方式下HSA-IL2的表达量达到27mg/L,比低溶氧高甲醇条件下的表达量高33.7%。     

Neutral CeUulase Production by Recombinant Pichia pastoris

通过对6个重组毕氏酵母转化子的产酶试验,筛选出一个优良转化子。在摇瓶条件下对该重组毕氏酵母的发酵过程进行了研究,得到适宜的培养条件为：250 mL三角瓶装液量30 mL,培养基起始pH4.8,此后不加控制,接种量10%,发酵过程中每隔24h补加1%的甲醇对产酶有明显的促进作用,中性纤维素酶活力可达1 144U/mL。研究结果表明：重组毕氏酵母中性纤维素酶的适宜催化条件为：50℃、pH 6.0;Zn2＋和Mg2＋对该酶有激活作用,Fe2＋、Fe3＋和Cu2＋对该酶有抑制作用。牛仔服水洗试验结果显示：重组毕氏酵母中性纤维素酶可以明显降低靛蓝对牛仔服的反染作用,其工业应用前景良好。     

重组毕氏酵母产中性纤维素酶条件的优化

通过对6个重组毕氏酵母转化子的产酶试验,筛选出一个优良转化子。在摇瓶条件下对该重组毕氏酵母的发酵过程进行了研究,得到适宜的培养条件为:250 mL三角瓶装液量30 mL,培养基起始pH4.8,此后不加控制,接种量10%,发酵过程中每隔24h补加1%的甲醇对产酶有明显的促进作用,中性纤维素酶活力可达1 144U/mL。研究结果表明:重组毕氏酵母中性纤维素酶的适宜催化条件为:50℃、pH 6.0;Zn2+和Mg2+对该酶有激活作用,Fe2+、Fe3+和Cu2+对该酶有抑制作用。牛仔服水洗试验结果显示:重组毕氏酵母中性纤维素酶可以明显降低靛蓝对牛仔服的反染作用,其工业应用前景良好。     

人源Ⅲ型胶原蛋白在毕赤酵母中的多拷贝重组表达、鉴定及抗氧化活性分析

胶原蛋白在人体内有重要作用,并且在食品、保健品、医疗等方面有广泛应用。该研究针对毕赤酵母的密码子偏好性对人源Ⅲ型胶原蛋白基因进行了密码子优化,在此基础上构建了人源Ⅲ型胶原蛋白单串联、二串联和二串联四拷贝表达载体pPIC9K-COL3-S、pPIC9K-COL3-2和pPIC9K-COL3-4,转化毕赤酵母GS115实现了人源Ⅲ型胶原蛋白的整合表达,获得了胶原蛋白单串联、胶原蛋白二串联和胶原蛋白二串联四拷贝的毕赤酵母工程菌株。对pPIC9K-COL3-S、pPIC9K-COL3-2重组菌株进行了摇瓶模拟高密度发酵,甲醇诱导浓度为0.5%,经SDS-PAGE和Western Blot检测,重组菌株成功表达了重组胶原蛋白,其中单串联蛋白表观分子量约为26.7 ku,双串联蛋白表观分子量约为52.3 ku。四拷贝重组菌株在0.5%甲醇诱导下的高密度摇瓶发酵产量最高,在最佳诱导时间为72 h时,蛋白产量达到约0.45 g/L。通过镍柱纯化后获得高纯度重组蛋白,抗氧化活性实验表明,重组胶原蛋白DPPH自由基清除率达到51.49%、ABTS自由基清除率达到41.24%,证明具有抗氧化活性,为其在食品,保健品和医疗领域的应用提供理论依据。