水稻愈伤组织端粒酶催化特征检测

端粒是位于染色体末端富含鸟嘌呤的双链DNA结构.端粒酶以自身的一段RNA为模板,按照碱基互补配对的方式产生端粒重复序列以延伸端粒长度,维持染色体的稳定.以水稻愈伤组织为实验材料,分离、提取端粒酶,并以不同3'端的寡核苷酸作为前导引物对体外水稻端粒酶催化特征及不同引物对酶活性的影响进行了探究.结果显示:S水稻愈伤组织端粒酶提取液在延伸前导引物时,以催化合成的TAGGGTT末端百分比含量最高,表明在催化延伸寡核苷酸的过程中,倾向于优先催化合成TAGGGTT端粒重复序列.尤其在前导引物3'末端为TT碱基和GT碱基最突出,其次是TA碱基, 而AG碱基和GG碱基不明显,推测水稻端粒酶模板RNA与前导引物的结合位点为一个碱基,偏好性为T>A>G.这些特征、特性对尚未克隆的水稻端粒酶RNA,以及对深入研究端粒末端结构及染色体遗传稳定性具有重要意义.     

西兰花端粒酶分离与活性测定探究

植物端粒酶以自身的RNA亚基为模板，维持着染色体末端端粒的长度，从而使植物细胞可持续分裂。本研究以西兰花花蕾为材料，采用不同分子量、不同浓度的PEG分别提取端粒酶，根据PEG吸附蛋白质的原理，从具有端粒酶活性的组织中分离并富集端粒酶。结果显示：用PEG6000提取西兰花端粒酶，且用100μg的酶量进行酶促反应时测得的端粒酶活性最高。以此为参数，经改进的TRAP法成功检测到：用0．2g PEG6000／700μL洗脱液提取出的端粒酶活性很高。这些分离、检测技术为其它植物组织中端粒酶活性的检测和评价提供了新的途径，尤其对低活性的植物端粒酶检测具有重要意义，为深入研究端粒酶RNA的序列及结构奠定了基础。     

水稻端粒酶RNA候选序列的鉴定

端粒酶由端粒酶反转录蛋白和端粒酶RNA构成,端粒酶RNA中除模板序列保守外,其余区域的保守度极低,难以基于同源序列实施克隆。目前,植物中仅拟南芥端粒酶RNA得到了克隆。为了鉴定一条具水稻端粒酶RNA特征的候选序列,研究中进行了对模板序列单碱基T/A突变(5′-AAACCCTAA-3′)后的转基因愈伤组织端粒酶活性的比较,结果显示在缺乏dATP的端粒重复序列扩增法反应中,突变型的端粒酶活性明显高于未突变型;对体外延伸得到的端粒ssDNA进行测序分析,结果发现所测10条片段均含有突变特征序列;再对转基因植株进行端粒序列的检测,结果所测8个端粒序列中,有2个含有突变特征序列。因此,初步判断该候选序列为水稻端粒酶RNA基因。     

水稻端粒酶RNA模板基因序列鉴定体系的建立

利用水稻端粒酶对端粒序列的合成作用,对模板基因序列进行定点突变,构建了pCambia1301-T突变型、pCambia 1301-Y野生型载体.经农杆菌介导,选用水稻不同品种和组织,探索候选序列的鉴定体系.结果显示,不同水稻品种诱导愈伤,差异显著,其中中花11号可快速诱导愈伤,比广陆矮4诱导时间缩短一半,用成熟胚和幼胚分别诱导愈伤,无明显差异;对突变型、野生型、正常组织进行基因组DNA端粒鉴定和端粒酶活性分析,发现突变型端粒酶活性明显高于对照.这些均表明该鉴定体系完整、可靠,为端粒酶RNA模板基因序列的鉴定建立了有效的方法.     

影响RNA芯片探针杂交效率的因素分析

RNA芯片作为研究ncRNA的主要技术之一,已受到广泛关注。然而因RNA芯片中靶序列的单链特征,使得RNA芯片的探针设计比DNA复杂。本研究对加强型绿色荧光蛋白（EGFP）RNA序列进行覆瓦式探针设计,制作了RNA原位合成芯片,研究探针／靶序列杂交双链△G和Tm、靶序列二级结构以及探针的末端碱基对RNA芯片杂交信号强度的影响。结果表明,探针／靶序列杂交双链△G和Tm相同的探针间的杂交信号存在较大差异,探针／靶序列杂交双链△G和,Tm与RNA芯片杂交信号之间未发现明显的规律性;靶序列二级结构的探针PT-sc参数与芯片杂交信号强度间呈较好的线性关系;探针5’末端碱基组成对芯片杂交信号强度也有影响,5’末端碱基为6／C的探针杂交信号总体上高于其邻近的5’末端碱基为A／T的探针的杂交信号,为RNA芯片的探针筛选提供一定的理论基础。     

水稻端粒酶RNA候选序列的克隆及特征解析

端粒酶是由端粒酶反转录酶和端粒酶RNA构成,端粒酶RNA中含有端粒合成所需的模板序列.现仅获得了拟南芥的端粒酶RNA序列.为了建立快速有效的富集植物端粒酶的方法并克隆水稻的端粒酶RNA序列,研究中使用不同浓度的PEG6000选择性的沉淀端粒酶萃取液中的杂蛋白.结果表明当PEG6000浓度为4％时,端粒酶活力最高,并可以有效降低核糖体28S rRNA和18S rRNA的干扰.从端粒酶蛋白液中提取RNA,并在其3′端连接接头,在模板区设计上游引物,PCR扩增获得一条292 bp的未知片段,其中含有端粒模板序列5'-AAACCCTAA-3′.将该片段及拟南芥端粒酶RNA的转录调控区进行序列比对分析发现,两者具有类似的转录调控元件.因此,初步判定292bp的目的片段为水稻端粒酶RNA的模板下游序列.     

水稻单个端粒长度定量测定及分析

端粒是真核生物线性染色体末端的特殊结构,一定长度的端粒在维持真核生物遗传信息完整性和染色体结构稳定性中起重要作用.建立一种简单快捷定量测定水稻单个端粒绝对长度的方法对研究水稻各个染色体端粒具有积极的意义.研究将特殊接头连接到水稻染色体端粒的G-overhang末端,并利用近端粒区域的特定引物以及下游接头引物,通过PCR技术,获得所需鉴定的端粒,结合DNA凝胶电泳成像分析系统,定量检测水稻单个端粒的长度.结果显示本方法可以通过少量水稻基因组DNA有效测定单个端的粒长度.     

纳米磷灰石对人肝癌细胞端粒酶基因表达的影响

利用原位杂交细胞化学的方法对纳米磷灰石作用 4 h后的人肝癌细胞进行端粒酶基因的检测来研究纳米磷灰石对人肝癌细胞端粒酶基因的影响 ,探讨纳米磷灰石抗癌的机制。结果显示人肝癌 Bel- 74 0 2组的端粒酶阳性细胞率为 88.4 9% ,顺铂组的端粒酶活性为 2 5 .6 % ,纳米磷灰石组为 6 3.6 % ,二者与 Bel- 74 0 2组端粒酶活性相比呈明显下降 ,并存在明显的差异性 (p<0 .0 1)。表明纳米磷灰石对人肝癌细胞端粒酶基因的表达具有明显的抑制作用     

藻蓝蛋白的抗癌活性研究

活细胞脱氢酶催化四唑盐(MTT)还原,生成溶于有机溶剂的蓝色甲臜结晶,可定量反映细胞生长．流式细胞技术可根据细胞中DNA的质量分数来检测其所处的细胞周期．采用上述两种方法,研究了藻蓝蛋白(PC)对HeLa细胞的抗癌活性．实验证明,PC对HeLa细胞生长有明显的抑制作用,当PC浓度为80mg／L时对癌细胞的抑制率达31．O％．初步认为这种抑制机理为：PC使HeLa细胞由合成期(S)或分裂期(M)向G1期转变和积集,细胞DNA合成衰减．     

松口蘑菌丝体蛋白质诱导细胞调亡

采用深层发酵技术培养菌丝体并提取分离出的蛋白质,进行体外抗人子宫颈癌HeLa细胞增殖及诱导细胞凋亡机理的研究。试验发现松口蘑菌丝体水提液中活性蛋白质TMP在体外具有抑制肿瘤细胞增殖的作用,扫描电镜观察到TMP处理细胞产生明显的凋亡小体,TMP对细胞周期的影响是通过抑制细胞从S到G2M期的转化来抑制HeLa细胞增殖,诱导细胞发生凋亡的。DNA电泳出现以200bp左右为单位的DNA碎片。结果表明：采用液体培养方法生产的松口蘑菌丝体蛋白质,具有显著的抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡作用。     

镍-2,2＇-联吡啶-4,4＇二羧酸配合物的结构及其生物活性研究

过渡金属配合物催化DNA的断裂反应是近年来最为活跃的前沿研究领域之一,研究发现某些金属配合物具有催化DNA裂解的功能,因而该研究对新型抗肿瘤药物的设计及其生物学的研究具有重要意义和应用前景.为了研究金属与DNA的作用机制,在室温条件下,采用溶剂挥发法合成配合物[Ni（BDA） （H2O）4]2H2O（其中BDA为2,2＇-联吡啶-4,4 ＇二羧酸）,并应用红外光谱、元素分析和X-射线衍射技术对配合物的结构进行表征,所有表征均证明合成的是目标配合物.通过凝胶电泳法测定配合物对pBR322质粒DNA的切割能力,发现配合物对pBR322质粒DNA具有一定的切割能力.利用MTT法检测配合物对HeLa细胞的抑制活性,结果表明该配合物对HeLa细胞具有一定的抑制能力.     

基于植物p53保守序列构建RNAi的DNA片段方法

构建p53基因RNA干涉DNA片段的目的,是将其应用于植物悬浮培养中的细胞周期调节．依据拟南芥p53基因与其他高等植物具有高度保守区域的特点,合成其两个区域的核苷酸片段（Ⅰ和Ⅱ）及其相应的反向片段（Ⅰ＇和Ⅱ＇）,并在Ⅱ和Ⅱ＇端部分别引入内含子两个端部核苷酸序列．在相互连接后进行PCR选择扩增,其产物再与克隆裁体连接并经过蓝白斑筛选获得重组DNA;在电泳和核苷酸测序鉴定后表明,最终得到了Ⅰ-5＇-内含子-Ⅱ＇-Ⅱ-内含子-3＇-Ⅰ＇序列的重组DNA片段该片段两端含多克隆位点,通过插入植物的表达载体进入细胞基因组,在细胞中其转录产物将形成发夹结构,经胞内酶切后可以形成短的双链RNA片段,将具有干涉p53基因表达的功能     

阴离子卟啉对DNA转录和端粒酶抑制的研究

新型抗肿瘤药物的设计是当今化学生物学中发展迅速且具有挑战性的研究领域之一,阴离子卟啉有着比阳离子卟啉更好的膜通透性.利用合成的阴离子卟啉化合物1,2和3,通过凝胶电泳和端粒酶重复序列扩增法(TRAP),研究了药物对DNA转录成为RNA和它们对端粒酶的抑制作用.实验结果表明:阴离子卟啉化合物1,2和3均可抑制DNA的转录和端粒酶的活性,其中化合物2的抑制作用尤为显著,其完全抑制的浓度分别为5 μmol/L和3μmol/L,这与化合物2 β-位所连8个强拉电子的溴原子所导致的整个分子的缺电子性有关.     

人α-防御素HNP-1基因克隆及其结构分析

为了获得一种具有生物学活性的小分子多肽基因人α 防御素HNP 1,提取人外周静脉血液总RNA,反转录为cDNA作为模板,采用PCR的方法扩增得到长度约为380bp的防御素(De fensin)基因片段,并将该扩增产物连接入pMD18 T载体,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,对PCR鉴定含有目的片段的克隆进行核苷酸序列测定,获得α 防御素HNP 1基因克隆。用序列处理在线工具包分析HNP 1基因结构。     

复插值逼近从单位圆盘扩大到Jordan区域的边界充要条件

D是复平面上Jordan闭曲线Γ围成的单连区域.自20世纪40年代以来,在闭域D上用Hermite插值多项式一致逼近和平均逼近f(z)∈A(q)(D),已经有很多研究而且还在继续研究.大量作者接连不断地减少区域边界条件以期提高论文的水平.什么是最少的边界条件?直到现在,这个问题似乎还没有解决.本文已经发现并证明了:为了Hermite插值多项式收敛于f(z)∈A(q)(D—),其充分必要条件是Γ∈C~,即设这区域边界曲线Γ的参数表示是z=z(t),它具有一阶导数z'(t)连续且不等于零于[0,2π]上.     

配合物锌-2,5-噻吩二羧酸-邻菲啰啉的合成及其与DNA作用的研究

合成锌混合配体配合物[Zn(thca)(phen)(H2O)](其中thca:2,5-噻吩二羧酸,phen:邻菲啰啉).Bruker smart 1000 CCD-X射线单晶衍射仪确定了配合物的晶体结构.用紫外可见光谱、荧光光谱研究该配合物与HC-DNA(Hela细胞DNA)的作用规律,用凝胶电泳法研究该配合物对pBR322-DNA的切割作用,从插入方式角度讨论配合物与DNA相互作用机理,并进行HeLa细胞凋亡实验.     

特异性抗肿瘤免疫核糖核酸的提取

用H22细胞接种于小鼠腹腔，抽取癌性腹水，分离肿瘤细胞，用肿瘤细胞裂解物加弗氏完全佐剂充分乳化制备成免疫原，接种于小鼠，取小鼠的免疫器官提取核糖核酸，并进行相关性能检测。结果表明该方法制备提取免疫的核糖核酸携带供体肿瘤特异性免疫信息，能提高抗肿瘤的疗效。     

乙酰肝素酶-1/多配体蛋白聚糖-1轴对肝癌细胞侵袭能力的影响

乙酰肝素酶-1(Heparanase-1,HPA-1)/多配体蛋白聚糖-1(Syndecan-1,SDC-1)轴调控多种肿瘤细胞的转移。肿瘤细胞侵袭能力的改变是导致肿瘤脱离原发组织,进而向远隔器官转移的关键启动因素。为了检测Heparanase-1/Syndecan-1轴在肝癌细胞中是否存在及其对肝癌细胞侵袭能力的影响,我们利用SDC-1小干扰RNA及重组HPA-1(rHPA-1)分别处理肝癌细胞Hepa1-6,再通过反转录PCR(RT-PCR)、Western-blot及免疫细胞化学检测SDC-1表达,应用体外基质胶侵袭实验观察细胞侵袭能力的改变。结果显示:SDC-1小干扰RNA明显抑制SDC-1表达;r HPA-1处理显著下调SDC-1蛋白的分子量,但没有改变SDC-1的mRNA表达;SDC-1表达下调及rHPA-1处理均促进Hepa1-6细胞的侵袭。因此得出结论:HPA-1通过作用于SDC-1蛋白,即形成Heparanase-1/Syndecan-1轴启动肝癌细胞转移。