气质联用法分析动物肌肉、肝脏和肾脏中喹喔啉-2羧酸的含量

本文研究了用气质联用仪检测动物肌肉、肝脏及肾脏中喹喔啉-2-羧酸的含量，该方法灵敏度较高，检测低限为1．0μg／kg，干扰较少，并具有较好的重现性，可达到60％～125％，相关线性系数为0．998。     

孔雀石绿人工抗原的合成及多克隆抗体的制备

通过研究孔雀石绿(MG)抗原的合成和多克隆抗体的制备,探索研究食品中孔雀石绿残留的检测方法。本实验先合成含有羧基的孔雀石绿半抗原(CMG),并用液-质联用法进行分析鉴定。半抗原经重氮化法处理后分别偶联两种载体蛋白BSA和OVA,并通过紫外分光光度法进行鉴定。与CMG标准品和两种载体蛋白的紫外吸收光谱相比,偶联物的吸收峰发生了明显的偏移,计算得免疫原的偶联比为10.6:1,说明偶联成功。通过免疫制备多克隆抗体,并通过间接ELISA法对CMG抗血清的效价进行检测,并进一步检测抗体的特异性,两只兔子的IC50值分别为8.1ng/mL和4.6ng/mL。     

高效液相色谱-串联质谱法同时测定鸡肉、 鸡蛋中喹乙醇和卡巴氧及代谢物残留

目的建立高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱法测定鸡肉、鸡蛋中喹乙醇、卡巴氧及其代谢物残留量的分析方法。方法组织样品中的卡巴氧和喹乙醇用乙腈-乙酸乙酯(1:1, V:V)溶液提取;代谢物的提取用蛋白酶酶解后经盐酸溶液酸化,采用阴离子交换固相萃取柱净化和富集。分析样品以0.1%甲酸溶液-甲醇进行梯度洗脱,经Waters Xbridge C_(18)色谱柱分离,以液相色谱串联质谱多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)正离子模式进行检测。结果 5种喹喔啉类药物在0.5～50ng/mL浓度范围内线性良好,相关系数r~2为0.9956～0.9988;该方法的检出限和定量限分别为0.1～0.5μg/kg和1.0～2.0μg/kg;鸡蛋和鸡肉样品中,喹乙醇、卡巴氧、脱氧卡巴氧、喹喔啉-2-羧酸和3-甲基喹喔啉-2-羧酸在0.2～2.0μg/kg加标水平的平均回收率为85.1%～108.2%,日内精密度为4.9%～8.7%,日间精密度为6.2%～11.7%。结论该方法简单有效、回收率好、灵敏度高、特异性好,能满足日常检测的需求。     

链霉素人工抗原及多克隆抗体的制备与鉴定

通过研究链霉素(SM)人工抗原的合成和多克隆抗体的制备,建立链霉素残留的免疫分析方法。以氧-缩甲基羟胺肟化链霉素的醛基,引入羧基,再用碳二亚胺法将半抗原与蛋白质载体连接,合成免疫原SM-cBSA。用戊二醛法合成包被原SM-OVA。用紫外扫描、SDS-PAGE分析偶联情况,计算得链霉素与cBSA、OVA的分子偶联比分别为7.6:1与17.7:1。经动物免疫获得效价为1:40000的链霉素多克隆抗体,采用间接竞争ELISA测定IC50为3.32ng/mL,与双氢链霉素的交叉反应率为105.21%,与同类的其他药物均无交叉反应。     

胭脂红酸人工抗原合成及多克隆抗体的制备

为了快速高效检测食品中胭脂红酸含量,本研究通过羟基二咪唑法制备了胭脂红酸人工抗原;通过免疫新西兰大耳白兔获得了胭脂红酸抗血清,经硫酸铵沉淀法分离纯化获得抗胭脂红酸多克隆抗体;利用棋盘滴定法检测了抗体效价,并探究了溶液pH值、离子强度和有机溶剂对ELISA反应的影响,优化出最佳ELISA反应条件;在最佳反应条件下,建立了胭脂红酸的间接竞争ELISA抑制曲线。紫外光谱扫描结果显示,免疫抗原(CA-BSA)和检测抗原(CA-OVA)均与载体蛋白成功偶联;经分离纯化获得的胭脂红酸多克隆抗体效价为1:16000;检测抗原最佳浓度为1μg/m L、ELISA反应最适缓冲液为pH7.4、含50mmol/L Na~+且无甲醇的磷酸盐缓冲液;间接竞争ELISA标准曲线的线性范围为7.8～1150ng/mL,检测限为1ng/mL,灵敏度IC_(50)值为95.2ng/mL。本研究为开发CA快速检测试剂盒对食品中胭脂红酸含量的大量快速测定奠定了基础。     

甲基苯丙胺人工抗原的合成及多克隆抗体的制备

利用化学法合成甲基苯丙胺人工抗原,将此抗原免疫新西兰大白兔制备抗甲基苯丙胺多克隆抗体,利用EDC法将甲基苯丙胺人工抗原与蛋白质载体BSA偶联,经蛋白质电泳以及紫外扫描检测,证明甲基苯丙胺人工抗原合成成功.用间接酶联免疫检测法检测,证明制备得到了高效价的甲基苯丙胺多克隆抗体血清,且与甲基苯丙胺人工抗原具有高特异性反应,可用于甲基苯丙胺免疫学检测方法的研究。     

液相色谱-串联质谱法测定水产品中喹乙醇和卡巴氧的代谢物残留量

目的建立液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)测定水产品中喹乙醇代谢物3-甲基-喹噁啉-2-羧酸(3-methyl-quinoxaline-2-carboxylic acid,MQCA)和卡巴氧代谢物喹噁啉-2-羧酸(quinoxaline-carboxylic acid,QCA)的残留量的分析方法。方法样品在0.2 mol/L Tris/HCL缓冲溶液作用下,47℃水浴振荡进行酶解,将与组织以结合态形式存在的MQCA和QCA转变为游离态,酶解液经盐酸酸化,乙酸乙酯提取,提取液吹干后加入20%甲醇水溶解,过PAX固相萃取柱净化,浓缩定容,采用ACQUITY UPLC HSS T_3色谱柱分离,以乙腈、0.1%甲酸溶液为流动相,多反应离子监测(multiplereaction reaction monitoring,MRM)模式测定,内标法定量。结果 MQCA和QCA在2.5~100 ng/m L范围内呈良好的线性关系,相关系数(r~2)均大于0.99。在0.5、2.5和10μg/kg加标水平下(n=6),MQCA和QCA的平均回收率为75.6%~92.4%,相对标准偏差为3.81%~9.73%。MQCA和QCA的检出限均为0.25μg/kg,定量限均为0.5μg/kg。结论该方法灵敏、准确,重复性好,适用于水产品中MQCA和QCA残留量的同时测定。     

链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸人工抗原的合成及其多克隆抗体制备

本研究采用肟化法用羧甲基羟胺半盐酸盐对链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸(Tenuaconic acid,TA)进行衍生后引入连接臂,得到了半抗原TAO。通过活性酯法将半抗原TAO分别与牛血清蛋白(Bovine serum albumin,BSA)偶联制备得到免疫原TAO-BSA、与血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin,KLH)偶联制备得到包被原TAO-KLH。经透析纯化后分别采用紫外光谱、红外光谱扫描法对合成的人工抗原进行初步鉴定,制备得到的人工抗原的偶联比分别为18.3:1、38.7:1。此人工抗原免疫Balb/c小鼠后获得的鼠源抗血清进一步验证了人工抗原合成成功,制备得到特异性识别TA的多克隆抗体。通过ELISA棋盘法确定了最佳包被原浓度以及最佳抗体稀释度并建立了TA间接竞争ELISA检测方法,其灵敏度以半抑制浓度IC50表示为335.55 ng/m L,最低检出限(LOD)为19.00 ng/m L,定量线性检测范围为200.00~1563.00 ng/m L。     

杂环胺人工抗原的合成以及多克隆抗体的制备

为建立适用于一类杂环胺的酶联免疫吸附检测方法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),利用改良的碳化二亚胺法将在2-氨基-3,4,8-三甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉(2-amino-3,4,8-trimethyl-3H-imidazo[4,5-f]quinoxaline,4,8-DiMeIQx)的2-氨基处连接丁二酸单甲酯酰氯制备的半抗原偶联蛋白获得人工抗原。该方法利用适当pH值的缓冲体系,将酯的水解和蛋白偶合一步完成,与传统方法相比,有效地节省了反应时间和成本,且对人工抗原的紫外扫描验证和多克隆抗体效价检测结果都直接和间接地表明偶合是成功的。最终免疫获得4,8-DiMeIQx结构类似物的多克隆抗体,该抗体的最高效价为1∶450 000,且经直接竞争ELISA检测,该抗体对目标物4,8-DiMeIQx的灵敏度(IC50)为24.0μg/L,最低检测限(IC15)为1.8μg/L,对其结构类似物7,8-DiMeIQx、8-Me IQx、2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉(IQx)、2-氨基-3,4,7,8-四甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉(Tri Me IQx)的灵敏度分别为35.0、30.0、28.0、40.0μg/L,而其他与目标物结构相差较大的杂环胺,像2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑[4,5-b]吡啶(Ph IP)、2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]喹啉(IQ)和2-氨基-3,4-二氨基咪唑[4,5-f]喹啉(2-amino-3,4-dimethyl-imidazo[4,5-f]quinoline,Me IQ),它们几乎不与抗体结合(CR0.01%)。由此可见,可以利用该抗体建立高效快速的杂环胺ELISA检测方法用以定量或定性检测肉类加工食品中的一类杂环胺。     

庆大霉素人工抗原及多克隆抗体的制备与鉴定

为研究建立庆大霉素的免疫分析技术,合成庆大霉素人工抗原:采用碳二亚胺法将庆大霉素(gentamicin,GM)偶联到牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)上,分别合成免疫原GM-BSA和包被原GM-OVA。通过紫外扫描和SDS-PAGE垂直电泳鉴定证明人工抗原偶联成功。以GM-BSA为免疫原,采用新的动物免疫方案免疫新西兰大白兔,获得抗庆大霉素抗血清。在本次免疫新方案中,在动物的生命周期内获得了多于普通免疫的血清量,在多抗血清的制备上是一次抗体工程上的尝试。通过间接酶联免疫对抗血清效价和灵敏度进行跟踪检测,结果表明抗血清效价在九免后稳定在1:20000左右,IC50则稳定在3 ng/mL左右。并在八免血清基础上建立了GM间接竞争ELISA法。结果表明,庆大霉素浓度在0.3~243 ng/mL,方法的线性回归方程为y=-0.1009lnx+0.6093和R2=0.9845,方法的检测灵敏度IC50=2.954 ng/mL,最低检测限IC10=0.056 ng/mL。该研究结果为多抗血清制备在量上的突破提供了思路,同时为研制庆大霉素试剂盒提供了良好的基础。     

展青霉素人工抗原及多克隆抗体的研制

采用戊二酸酐法合成展青霉素-半戊二酸（PAT-HG），通过活泼酯法将PAT-HG偶联到牛血清白蛋白，制备了展青霉素免疫抗原（PAT—HG—BSA），免疫3只BALB／c小鼠，经4次免疫后，1号小鼠血清抗展青霉索抗体效价迭1：1600，且小鼠抗展青霉素多克隆抗体与展青霉素检测抗原的结合能被展青霉素阻断。     

莱克多巴胺的抗原合成鉴定及其抗体的制备纯化

莱克多巴胺属于β-兴奋剂类药物中的苯乙醇类衍生物，具有显著改善动物饲料利用效率，显著提高胴体瘦肉率的生产性能，因为其具有严重的副作用所以H前该类药物在我国和其他国家是被禁用的。本试验通过连接剂butane-1，4-diol diglyciydylether把莱克多巴胺和载体蛋白BSA和OVA偶联成免疫抗原和包被抗原，并采用紫外全波长扫描和SDS-聚丙烯酰胺凝胶的方法对合成的抗原进行了鉴定。通过免疫兔子获得了RCT的多克隆抗体，然后又通过饱和硫铵沉淀和proteinA-Sepharose4B的方法对抗体进行了纯化。纯化的抗体表现出对RCT较高的特异性和灵敏性。     

重金属铅多克隆抗体的制备及鉴定

目的：合成铅离子完全抗原,并对其进行鉴定;用合成的完全抗原免疫Balb/c 小鼠制备多克隆抗体,鉴定效价和特异性。方法：用双功能螯合剂p-SCN-Bn-DTPA 将Pb2+ 与载体蛋白BSA 和OVA 偶联在一起,合成免疫抗原(Pb-DTPA-BSA)和检测抗原(Pb-DTPA-OVA),并通过SDS-PAGE、紫外扫描、电感耦合等离子体(ICP) 检测抗原中Pb2+ 含量,以及通过免疫Balb/c 小鼠,采集血清进行间接ELISA 和竞争ELISA 检测。结果：两种合成的抗原相对于各自的载体蛋白均出现了蛋白条带滞后,紫外吸收峰偏移等现象;免疫的4 号和5 号Balb/c 小鼠的抗血清效价达1:400000;与OVA 无交叉反应,ELISA 检测IC50 值为1.5ng/mL,与Fe3+ 有近5% 的交叉反应,与其他重金属离子的交叉反应均小于1%。结论：铅离子多克隆抗体制备成功。     

芴完全抗原和多克隆抗体制备与鉴定

以9-芴乙酸（fluorene-9-aceticacid,FLU）为原料,经活性酯法合成完全抗原FLU-牛血清白蛋白（bovineserum albumin,BSA）和FLU-卵清白蛋白（ovalbumin,OVA）,偶联产物通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及紫外扫描法鉴定。使用FLU-BSA足垫免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,间接酶联免疫吸附实验（enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA）测得多克隆抗体效价为51 200,间接竞争ELISA方法测得芴多克隆抗体的特异性,与荧蒽的交叉反应率为12%,与其他14 种多环芳烃交叉反应不明显。     

甲硝唑人工抗原的合成及鼠源多抗的制备

为了获得效价高、特异性好的甲硝唑（metronidazole,MNZ）的小鼠多抗血清,采用琥珀酸酐法将甲硝唑上的羟基改造成羧基,然后通过碳二亚胺法把改造后的甲硝唑分别与牛血清白蛋白（albumin from bovine serum,BSA）和卵清蛋白（ovalbumin,OVA）进行偶联,制备免疫原MNZ-BSA和包被原MNZ-OVA。经紫外扫描和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳初步鉴定偶联成功。将免疫原MNZ-BSA分成20 μg/只和50 μg /只2 个剂量分别免疫8 周龄的BALB/c小鼠。获得了效价高、特异性好的小鼠多抗血清,效价均达到1∶104以上,IC50值为61.39 ng/mL。