酱香大曲中高产蛋白酶功能细菌的筛选及鉴定

通过对酱香型大曲中的细菌进行分离纯化培养,获得一株高产蛋白酶的菌株FBKL1.0199,然后采用菌株形态学观察、生理生化实验和分子生物学方法,鉴定其为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。实验条件下该菌株所产中性蛋白酶高达3 925.80 U/g,酸性蛋白酶活力达139.27 U/g,为提高酱香型白酒品质研究奠定了基础。     

杨湖强化酱香麦曲的制备工艺研究

采用从贵州茅台镇酱香大曲中分离的产酱香细菌FBKL 1.0199与FBKL 1.0201,以制曲用小麦粉为原料,直接接种产酱香细菌,制备得到强化酱香麦曲。接种细菌在麦曲中形成生长优势,含菌数为2.24×10~8cfu/g,制备的麦曲酯化力强,但糖化力和液化力偏低。麦曲挥发性风味物质成分中吡嗪类含量较高,为32.8%,其中四甲基吡嗪含量达到31.11%。     

酱香型大曲中分离到的阿姆斯特丹散囊菌产酶产香特性

为了探究酱香型大曲中霉菌的种类及其功能,采用稀释平板涂布法从遵义地区的6 个企业的酱香型大曲中分离筛选霉菌菌株,结合形态观察和真菌rDNA-ITS基因序列同源性比对进行分析。在其中5 个企业的大曲样品中均能筛选分离得到一株散囊菌,归类并命名为阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium cristatus）。以茅台大曲筛选的阿姆斯特丹散囊菌（FBKL3.0120）为研究对象,该菌株产糖化型淀粉酶活力最高,达到（3 100.16±109.43） U/g,酸性蛋白酶活力为（225.69±2.69） U/g、果胶酶活力为（435.88±68.49） U/g、脂肪酶与纤维素酶活力分别为（13.56±1.73） U/g和（4.14±0.16） U/g。采用固相微萃取-气质联用技术对固态发酵的挥发性香味物质进行结果分析,该菌固态发酵具有很强花香和果蔬香,挥发性香味物质以高级醇、酮和呋喃类为主,其中L-芳樟醇、1-辛烯-3-醇、3-辛酮、2-戊基呋喃的相对含量较高,分别为挥发性物质的16.37%、41.23%、6.95%、6.75%。分离得到的这株阿姆斯特丹散囊菌（FBKL3.0120）是一株产多种酶并同时产多种香气成分的霉菌,是酱香大曲微生物组成中的重要霉菌之一。     

产四甲基吡嗪地衣芽孢杆菌的应用

利用高温大曲中分离得到的地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）提高粹沙酒酱香风格特征。将地衣芽孢杆菌FBKL1.0199添加到窖池中层的糟醅中,与空白糟醅作对比,按照粹沙工艺制酒取样,考察了不同菌株添加量对白酒中四甲基吡嗪含量的影响,采用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）对酒醅及酒样中挥发性物质成分进行分析,同时进行感官评定。结果表明,最佳菌株添加量为5%,发酵后的酒醅四甲基吡嗪含量达6.81 μg/g,是对照组的3.03倍。酒样中四甲基吡嗪相对百分含量达0.028%,且感官品质优于对照组,具有入口醇厚、柔和、酱味且口感细腻的特征。     

酱香型大曲中具产酶功能霉菌的分离筛选

目的:从酱香型大曲中筛选功能菌。方法:从贵州省某酒厂的酱香大曲中分离到19株霉菌,测定了各菌株的液化酶、糖化酶和蛋白酶活力。结果:筛选到两株同时产液化酶、糖化酶和蛋白酶三种酶活都相对较高的菌株,对两株菌进行鉴定,并构建系统进化树,经鉴定两株菌分别为谢瓦散囊菌FBKL3.0004和阿姆斯特丹散囊菌FBKL3.0013。结论:筛选的两株菌能够应用于白酒酿造。     

茅台大曲中一株嗜热放线菌的分离筛选及特性研究

为探究茅台大曲中的放线菌的种类及功能,建立了一种有效的放线菌的分离筛选方法,并通过此方法在45 ℃培养条件下, 从茅台大曲中分离出了1株嗜热放线菌株FBKL4.004,对其进行形态学特征、生理生化实验及分子生物学鉴定,并对菌株FBKL4.004 的产酶、产香特性进行了研究。 结果表明,菌株FBKL4.004鉴定为Streptomyces bangladeshensis,该菌株产糖化酶和果胶酶能力较为突 出,分别为345.03 U/g及318.57 U/g,且其固态发酵产物挥发性成分中酯类物质相对含量最高（34.57%）,其次分别为萜烯类物质（18.51%） 及吡嗪类物质（17.63%）。     

强化曲中毕赤酵母与地衣芽孢杆菌的相互作用研究

以实验室分离得到的毕赤酵母FBKL2.0008与产酱香风味的细菌FBKL1.0199作为主要菌种,用于强化麦曲的制备。设置了5个接种比例,30℃发酵14 d后,确定了最佳的接种比例为地衣芽孢杆菌∶毕赤酵母=1∶10。监测强化曲发酵过程中微生物生物量,酸性蛋白酶活,淀粉酶活变化情况,可知毕赤酵母的加入对地衣芽孢杆菌的生长与代谢产物的生成情况没有明显影响。强化麦曲风味物质中吡嗪类物质相对百分含量为19.286%,其中四甲基吡嗪相对百分含量为16.365%。     

酱香型大曲中高温放线菌的筛选及风味成分分析

从高温酱香型大曲中分离得到一株耐热性良好的放线菌FBKL4.010,通过形态学、生理生化特征鉴定、16S rRNA基因序列分子生物学鉴定,确定该菌株归属于高温放线菌科（Thermoactinomycetaceae）莱斯氏菌属（Laceyella sp.）,经过进一步系统发育学比对分析鉴定为1?株糖莱斯氏菌（Laceyella sacchari）,其最适生长温度为45?℃;同时针对白酒酿造体系设计纯种菌株固态发酵实验,采用固相微萃取与气相色谱-质谱联用技术分析菌株挥发性代谢产物,结果表明,该菌株在固态发酵体系下能够代谢产生大量吡嗪类、芳香类物质,为发酵液赋予特征性豆豉、坚果风味,其中四甲基吡嗪占总挥发性成分的43.318%,其被认为是酱香白酒风味的主体成分之一,为日后深入探究该菌株在酱香风味形成中的作用提供了理论支持。     

酱香大曲中Geotrichum candidum MTBD菌株筛选及发酵产物研究

对从酱香大曲中分离的白地霉菌株Geotrichum candidum MTBD进行了鉴定,并对该菌株的固态发酵和液态条件下产蛋白酶及其产酶条件进行了研究,以及该菌株利用酿酒原料的固态和液态发酵产物分析。结果表明,该菌株能产较高活力的蛋白酶,发酵代谢产物包括酸类、酯类、芳香族化合物、醛酮类、含氮化合物等多种成分,与茅台地区酱香型白酒的风味成分分析结果进行比较分析,结果表明,该菌株也是酱香型白酒生产的主要功能菌株,对提供发酵动力和风味形成具有重要的贡献。     

bdhA基因敲除及发酵条件优化提高枯草芽孢杆菌四甲基吡嗪含量研究

四甲基吡嗪是白酒重要风味物质的组成成分,赋予白酒一定的健康功效。为提高菌株发酵产四甲基吡嗪的含量,本研究以枯草芽孢杆菌E20为原始菌株,利用同源重组敲除其2,3-丁二醇脱氢酶（BDH）的编码基因（bdhA）,成功构建突变菌株E20-ΔbdhA。将突变菌株和原始菌株接种到黄豆发酵培养基模拟产酱香固态发酵。结果表明,突变菌株发酵物中四甲基吡嗪的含量为100.45 mg/kg,比原始菌株提高了71.97%,酱香风味无明显变化。利用突变菌株E20-ΔbdhA对其固态状态下合成四甲基吡嗪的条件进行优化,确定当种子菌液接种量为5%,发酵培养基为高粱小麦（1∶1）,(NH4)2HPO4的添加量为70 g/kg时,发酵物中四甲基吡嗪的含量最高为380.61 mg/kg。     

酱香大曲中3株放线菌的分离筛选及挥发性成分分析

为探究酱香大曲中放线菌的种类及功能,建立了一种有效的放线菌分离筛选方法,并通过此方法在28 ℃培养条件下,从茅台大曲中分离出了3株放线菌,对其进行形态学特征、生理生化实验及分子生物学鉴定,并对菌株的产酶、产香特性进行了研究。结果表明,FBKL4.001、FBKL4.002鉴定为可可链霉菌（Streptomyces cacaoi）、FBKL4.003鉴定为沙阿霉素链霉菌（Streptomyces zaomyceticus）,3株菌产果胶酶能力较为突出,分别为299.66 U/g、216.52 U/g、294.86 U/g,其固态发酵挥发性成分以酯类物质为主,分别占62.80%、59.23%、46.77%,且均能产生吡嗪类物质。     

高温大曲中产吡嗪芽孢杆菌的分离鉴定及发酵产物分析

该试验从高温大曲中筛选产吡嗪芽孢杆菌（Bacillus）,通过形态观察及磷脂脂肪酸（PLFA）分析对其进行鉴定,并采用发酵试验分析其代谢产物。共筛选出3株芽孢杆菌,即菌株B1、B2、B3。经分析鉴定后得出：菌株B1为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）;菌株B2和B3为萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）。3株菌发酵产物分析结果表明,在液态发酵条件下3株菌发酵产吡嗪,其中菌株B2和B3发酵产物中吡嗪相对含量较高,均＞60%;固态发酵条件下生成吡嗪前体物质3-羟基-2-丁酮,且发酵产物中相对含量均＞75%。表明这3株芽孢杆菌对酱香型白酒风味物质的产生有着一定的影响。     

酱香白酒酿造过程中产多元醇功能酵母的筛选

为了解酱香型白酒酿造过程中产多元醇酵母的种类和功能,以酱香型白酒大曲和酒醅中分离的酵母为研究对象,采用薄层层析法和高效液相色谱-蒸发光散射检测器法（HPLC-ELSD）对具有产多元醇功能的酵母进行筛选和多元醇定性、定量分析。实验结果显示,从142株酵母菌中筛选出5株具有产多元醇功能的酵母菌娄德酵母（Lodderomyces elongisporus） FBKL2.0073、库得毕赤酵母（Pichia kudriavzevii） FBKL2.0008、Trichosporon coremiiforme FBKL2.0310、Trichosporon coremiiforme FBKL2.0307和Trichosporonoides sp. FBKL2.0315,其中前4株菌都能产D-阿拉伯糖醇,L. elongisporus FBKL2.0073菌株产多元醇的总量最多,为（9.87±0.85） g/L。     

酱香型白酒酒糟中生香酵母的筛选及鉴定

从酱香型白酒酒糟中通过液态发酵初筛获得7株高产乙酸乙酯的菌株,将其进行固态发酵,其发酵产物经气相色谱（GC）检测共得到64种挥发性化合物,通过主成分分析表明,菌株Y3、Y19和Y22的发酵产物相似。其中,菌株Y3和Y19的乙酸乙酯产量显著高于其他菌株（P＜0.05）,其次是菌株Y22,但与对照组相比,菌株Y19的吡嗪产量显著减少（P＜0.05）,菌株Y22的高级醇产量显著增加（P＜0.05）,均不利于酱香型白酒的生香呈味。故最终选用菌株Y3为生香酵母,通过菌种鉴定,确定该菌株为毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）。     

酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测及特点

建立了白酒中8种吡嗪化合物的液相色谱串联质谱检测方法。通过检测结果找出酱香型白酒中吡嗪化合物的特点（8种吡嗪化合物中三甲基吡嗪和四甲基吡嗪含量较高）,同时对真假茅台酒酒样中8种吡嗪化合物进行测定,并将检测结果进行分析,其中真茅台酒四甲基吡嗪的含量远远高于其他吡嗪化合物,含量在9.25～28.3 mg/L,假茅台酒中四甲基吡嗪的含量在0.89～12.5 mg/L。该方法对提高酱香型白酒质量及真伪酒的鉴别提供参考。