基于酶学特性筛选大曲来源芽孢杆菌用于强化酿酒

通过分析来源于清香型、浓香型和酱香型大曲的105 株芽孢杆菌的产淀粉酶和蛋白酶的能力,优选出1 株地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）B.L-1和1 株枯草芽孢杆菌（B. subtilis）B.S-1,将其分别应用于清香型白酒酿造中,探究强化接种微生物对发酵的影响。发酵结束后,在酒醅中共检测到挥发性代谢产物38 种,通过多元统计分析,在强化B.L-1组和B.S-1组中分别筛选出差异代谢物21 个和11 个（VIP＞1;P＜0.05）,其中4-乙基-2-甲氧基苯酚、辛酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯和四甲基吡嗪在2 组强化中均为差异代谢物,含量显著升高。结果表明,用酶学特性进行菌株筛选能够快速有效地获得特定功能菌株,由此获得的菌株进行强化发酵可显著提高酒醅中挥发性风味物质含量。该方法可以有效地为大曲微生物合成群落重塑提供菌种资源。     

清香型大曲中高糖化力霉菌的筛选、鉴定及其挥发性风味物质分析

采用传统微生物培养分离法、水解圈法及糖化力测定从牛栏山清香型大曲中分离筛选高糖化力的霉菌，通过形态观察及分子生物学技术对其进行菌种鉴定，并采用顶空固相微萃取结合气质联用法(HS-SPME-GC-MS)测定其代谢产物中的挥发性风味成分。结果表明，共筛选到5株高糖化力霉菌，经鉴定，菌株Q2、Q11为米曲霉(Aspergillus oryzae)、菌株Q19、Q70为黑曲霉(Aspergillus niger)、菌株Q48为米根霉(Rhizopus oryzae)，其中菌株Q19的糖化力最高(2 288.17 U/g)。从5株霉菌的代谢产物中共检出44种挥发性物质，包括6种醇类、18种酯类、9种醛酮类、11种芳香类。不同菌株产生的风味物质差异较大，菌株Q19和Q48代谢物中挥发性风味物质较为丰富且含量较高，且菌株Q2和Q11代谢物中1-辛烯-3-醇含量较高，菌株Q19代谢物中苯乙醇含量较高，菌株Q48和Q70代谢物中十六酸乙酯和亚油酸乙酯等高沸点酯类化合物含量较高。     

大曲微生物及其内在物质对酵母酒精发酵的协同作用

为了进一步弄清大曲在酒精发酵过程中的作用,以清香型大曲为研究对象,研究了大曲微生物及其内在物质在清香型白酒酵母酒精发酵过程中的作用。结果表明,大曲在清香型白酒酒精发酵过程中不仅提供了具有发酵力作用的酿酒酵母菌株,还提供了能协同促进酿酒酵母完成酒精发酵的菌株;同时,大曲还提供了有助于酵母酒精发酵的物质。     

一种酿酒酵母菌在白酒生产中的强化应用

从大曲中分离得到1株酵母菌。经分子鉴定该菌为酿酒酵母,通过对该菌株的发酵代谢产物进行分析,结果表明,该菌株的主要代谢产物为乙醇,其含量占代谢产物总量的40.24%,同时也代谢出较多的3-甲基丁醇、辛酸乙酯等香气成分。将该酵母菌制备成酵母曲应用于白酒的生产中,可以提高白酒的出酒率,提升白酒品质。     

高温大曲中高产吡嗪类物质芽孢杆菌的筛选与应用

采用高温培养和固态发酵,从高温大曲中筛选高产吡嗪菌株,并通过顶空固相微萃取及气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）技术检测菌株代谢产物。将高产吡嗪菌株应用于大曲生产,使用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）检测强化大曲中吡嗪类物质含量。结果表明,共筛选出6株高产吡嗪菌株（编号为X1、X2、X4、X6、X8、X9）,均被鉴定为芽孢杆菌（Bacillus）,其代谢产物共检出33种挥发性香气化合物,其中菌株X1代谢的吡嗪类物质含量最高为9 049.45 μg/kg;高产吡嗪菌株发酵主要对大曲贡献酱香、烘焙香以及花果香气;菌株X1强化大曲吡嗪类物质含量提升效果最好,其中四甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪含量相比对照大曲分别提升2.36倍、2.56倍、2.33倍,并且液态菌剂的效果要普遍优于固态菌剂。     

酱香型大曲中高温放线菌的筛选及风味成分分析

从高温酱香型大曲中分离得到一株耐热性良好的放线菌FBKL4.010,通过形态学、生理生化特征鉴定、16S rRNA基因序列分子生物学鉴定,确定该菌株归属于高温放线菌科（Thermoactinomycetaceae）莱斯氏菌属（Laceyella sp.）,经过进一步系统发育学比对分析鉴定为1?株糖莱斯氏菌（Laceyella sacchari）,其最适生长温度为45?℃;同时针对白酒酿造体系设计纯种菌株固态发酵实验,采用固相微萃取与气相色谱-质谱联用技术分析菌株挥发性代谢产物,结果表明,该菌株在固态发酵体系下能够代谢产生大量吡嗪类、芳香类物质,为发酵液赋予特征性豆豉、坚果风味,其中四甲基吡嗪占总挥发性成分的43.318%,其被认为是酱香白酒风味的主体成分之一,为日后深入探究该菌株在酱香风味形成中的作用提供了理论支持。     

中高温大曲中一株耐热细菌的分离鉴定及其风味代谢产物分析

目的:以培菌完成的中高温大曲为样品,分离鉴定耐热细菌并对其风味代谢产物进行分析。方法:通过富集培养和稀释涂布分离、形态学观察及16S r DNA序列分析、生长特性分析,并采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对其固态和液态发酵产物进行分析。结果:筛选出一株耐热能力较好的细菌NR2,鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）;该细菌培养第4 h开始进入对数生长期,培养24 h达稳定期;液态发酵可以产2,3-丁二酮、3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇等风味物质,其中3-羟基-2-丁酮为主要代谢产物;固态发酵代谢产物种类要高于液态发酵,主要是2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪等吡嗪类化合物含量增加。结论:曲香的形成及浓香型白酒风味物质的形成与耐热细菌NR2的代谢特性有关。      

基于仿生学和GC-IMS技术分析市售不同酒曲清香型白酒的风味特征

该研究基于仿生学和气相色谱-离子迁移谱（GC-IMS）技术对市售不同酒曲（大曲、小曲和麸曲）清香型白酒的色泽、滋味和风味品质以及挥发性风味化合物组成及相对含量进行解析。仿生学分析结果表明,大曲清香型白酒色泽更透明,酸味偏高而鲜味偏低,芳香类物质含量较高而有机硫化物含量较低。GC-IMS分析结果表明,大曲、小曲和麸曲清香型白酒中共鉴定到17种挥发性化合物,包括酯类9种、醇类5种和醛类3种,醇类和酯类物质是酒体的主要贡献成分,且酯类物质相对含量在大曲清香型白酒中显著偏高（P<0.05）。借助偏最小二乘判别分析（PLS-DA）确定了8种变量投影重要性（VIP）值>1且P<0.05的显著差异化合物,其中,异戊酸乙酯和乳酸乙酯对大曲清香型白酒的贡献较大,丙酸乙酯、异戊醇、糠醛、戊酸乙酯和异丁醇对小曲清香型白酒的贡献较大,乙醇对麸曲清香型白酒的贡献较大。由此可知,较之小曲和麸曲清香型白酒,大曲清香型白酒风味品质更佳。     

产乙偶姻菌株的分离鉴定及其对固态混菌发酵产物的影响

乙偶姻（ACT）是白酒中重要功能物质四甲基吡嗪（TTMP）的关键前体物,该研究从酱香型大曲中筛选分离产乙偶姻菌株,结合形态学观察及分子生物学技术对其进行鉴定,并将其应用于固态混菌发酵,考察其对发酵产物理化指标、有机酸及挥发性风味物质的影响。结果表明,分离筛选出一株产乙偶姻菌株A12F＿C118,经鉴定其为索诺拉沙漠芽孢杆菌（Bacillus sonorensis）。添加菌株A12F＿C118混菌发酵产物中,水分、还原糖、总酸、pH值分别比空白组分别提高了39.40%、38.46%、127.63%、11.93%;添加菌株A12F＿C118混菌发酵产物中共检出挥发性风味物质51种,其中正戊醇、苯乙酸乙酯、己酸乙酯、四甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和三甲基吡嗪等重要风味物质含量均有所增加。菌株A12F＿C118对固态混菌发酵过程中草酸、L-苹果酸、L-乳酸、乙酸、柠檬酸的合成皆有促进作用,但对琥珀酸的影响不明显。     

多组学解析酱香型大曲风味物质的形成

酱香型大曲是白酒发酵力和风味物质的源头,对白酒风味的形成具有重要意义。用于酱香型白酒发酵的大曲是白曲、黄曲和黑曲3种不同类型大曲经贮存后的混合物,解析不同曲种菌群结构以及代谢产物对于保障大曲稳定性、提高白酒品质有重要意义。目前对于不同曲种的研究主要集中于微生物群落结构的比较,而对风味物质差异及其形成原因的研究还非常有限。为解析不同曲种代谢物的差异及其成因,该研究利用多组学技术揭示了不同曲种的的风味代谢物差异以及菌群结构,并利用冗余分析研究了不同曲种风味代谢物差异的生物学因素。结果表明,不同曲种间菌群结构以及代谢物差异显著,不同曲种中微生物、酶和代谢产物之间存在相关性。其中芽孢杆菌与糖化酶、蛋白酶和四甲基吡嗪呈正相关。糖化酶和蛋白酶可视作微生物合成四甲基吡嗪的重要驱动因素。研究为进一步探索白酒中的风味物质和改进酿造工艺有一定的贡献。     

高产乙酸乙酯酵母菌的筛选及其在清香型小曲白酒生产中的应用

该研究利用WL营养琼脂培养基从浓香型大曲中分离纯化酵母菌,采用形态学观察和分子生物学技术对其进行鉴定,经过高粱汁培养基发酵初筛、高粱固态培养基发酵复筛,获得高产乙酸乙酯的酵母菌,并将其应用于清香型小曲白酒工业生产。结果表明,从浓香型大曲中分离得到2株酵母菌,编号为Y87和Y88,经鉴定分别为异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）,其中菌株Y87乙酸乙酯产量最高,高粱汁液态发酵和高粱固态发酵乙酸乙酯产量分别达到1.13 g/L、1.14 g/L,菌株Y87强化曲酿造的白酒乙酸乙酯含量提高36.6%,杂醇含量降低7.1%,正丙醇含量降低16.1%,感官评分为90.7分,该白酒具有清香型小曲白酒的典型特征,入口醇甜,清香纯正,说明菌株Y87可显著提高小曲白酒的品质。     

清香型大曲中产香细菌的分离筛选及鉴定

为提升麸曲清香型白酒风味品质，该研究采用稀释平板涂布培养法从清香型白酒大曲中分离纯化细菌，采用感官嗅闻法从中筛选出具有产香气功能的细菌菌株，将其应用于麸曲白酒酿造，并通过形态观察及分子生物学技术对其进行菌种鉴定。结果表明，分离筛选得到2株具有香气功能的细菌，编号分别为HXX7和HXX12，其发酵液中挥发性香气成分丰富，均含有酯类、醛酮类、酚类、杂环类化合物等，具有较强产香能力。将菌株HXX7和HXX12分别应用于麸曲清香型白酒生产，其中，菌株HXX7发酵酒样中丁酸乙酯（41.91 mg/L）、4-乙基愈创木酚（148.70 mg/L）、3-羟基-2-丁酮（312.68 mg/L）、苯乙醛（79.27 mg/L）、β-苯乙醇（128.38 mg/L）含量升高。结果表明，菌株HXX7可增加原酒香气，改善原酒风味，从而提升白酒品质。菌株HXX7被鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。     

白酒发酵高糖化性能霉菌的筛选及鉴定

以不同香型大曲为筛选源分离出霉菌96株,在透明圈法初筛、糖化力测定法复筛的基础上,以清香大曲和糖化酶为对照,模拟白酒酒精发酵过程,将酿酒酵母与霉菌纯种曲混合发酵,以出酒率作为评判指标,从中筛选出1株优质霉菌Rh-07。其纯种曲糖化力、发酵结束后培养基中酒精浓度、出酒率分别为2657.00 U/g、15.40 mL/100 g、42.73%;且以Rh-07纯种曲为糖化剂,其发酵速度基本与对照大曲一致。采用传统微生物学和现代分子生物学的方法对Rh-07进行了鉴定,初步确定为Rhizopus oryzae。同时发现,霉菌糖化酶活力大小与其在酒精发酵中的作用不成严格的正相关关系;在评价霉菌在白酒酒精发酵过程中作用时,不能单纯以糖化酶作为评价指标,应以原料与霉菌作用后的整个物系对酒精发酵作用作为评价指标。     

牛栏山二锅头酒醅中芽孢杆菌分离鉴定及发酵风味分析

从牛栏山二锅头酒醅中分离筛选出5株产风味物质能力较好的芽孢杆菌,通过16SrDNA序列分析和构建系统发育树,5株细菌分别为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。分别对它们进行发酵风味分析,其发酵液经固相微萃取和GC-MS分析,并除去空白培养基中物质,地衣芽孢杆菌BL-1发酵液共检测得到14种风味物质,蜡样芽孢杆菌BC-1和短小芽孢杆菌BP-1发酵都得到12种风味物质,枯草芽孢杆菌BS-1好氧发酵共得到16种风味物质,枯草芽孢杆菌BS-2厌氧发酵共得到19种风味物质。除短小芽孢杆菌外,其他4株芽孢杆菌都含有较多数量的酯类化合物,且主要代谢风味物质都是3-羟基-2-丁酮,而短小芽孢杆菌BP-1则含有数量较多的烃类化合物,其主要风味物质是苯乙醇。     

基于GC-IMS技术分析不同香型白酒挥发性成分差异

为了分析不同香型白酒的挥发性成分差异,利用气相色谱-离子迁移谱法（GC-IMS）对馥郁香、浓香、酱香、兼香、小曲清香、大曲清香型六种白酒中挥发性成分进行定性和相对定量分析,并结合指纹图谱、主成分分析（PCA）对样品进行鉴别。结果表明,六种白酒共检出73种挥发性风味物质,包括酯类28种、醇类11种、醛类12种、酮类9种、萜稀类6种以及其他类7种;指纹图谱表明,清香和小曲清香型白酒的特征风味物质有2-乙基呋喃、甲酸乙酯,酱香型白酒是3-羟基-2-丁酮、糠醛、二丙基二硫,馥郁香型白酒为丁酸异丁酯、2-已烯醛、柠檬烯、己酸丁酯;主成分分析结果表明,在风味物质种类和含量上馥郁香型和浓香型、兼香型白酒更接近,小曲清香型白酒和大曲清香型白酒归为一类,酱香型独成一类。     

中药材对清香型白酒主要酿造微生物及风味物质的影响

为筛选可提升清香型白酒酿造质量的中药材,探究了20种中药材对发酵微生物酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y1、异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y29和米根霉（Rhizopus oryzae）G1生长的影响。于绿衣观音土曲中添加中药材,模拟清香型白酒工艺进行固态发酵小试实验,分析中药材的添加对糖化醅中微生物数量及清香型白酒原酒中主要风味物质的影响。结果表明,添加杏仁和甘草等中药材可促进菌株Y1和Y29的生长,添加桂皮、杏仁等中药材可促进菌株G1生长。添加丁香、红景天对菌株Y1、Y29和G1的抑制作用明显,其最适添加量为0.5 g/L。川芎、辣蓼和人参分别使糖化醅中细菌、酵母和霉菌增殖的效果最佳,其微生物增长率分别为143.03%、47.69%和73.47%。气相色谱表明,茴香使清香型白酒乙酸乙酯含量增加32.44%,茯苓使清香型白酒杂醇油含量降低9.23%。     

基于响应面法优化高产乙酸乙酯清香型白酒大米查酒醅发酵工艺

以清香型白酒大米查酒醅发酵工艺为基础，采用单因素试验探究发酵温度、水添加量、大曲添加量、发酵时间等影响因素对清香型白酒发酵过程酒醅中乙酸乙酯形成的影响，并在单因素试验基础上，以乙酸乙酯产量为评价指标，通过响应面试验优化清香型白酒发酵工艺条件。结果表明，发酵温度、水添加量、大曲添加量、发酵时间对酒醅中乙酸乙酯的形成具有一定影响，最佳发酵工艺为：大曲添加量12.2%，发酵温度28℃，水添加量118%、发酵时间21 d。在此优化条件下，酒醅中乙酸乙酯含量最高，为（0.91±0.02）g/kg。     

浓香型大曲中功能性酵母菌的筛选、鉴定及发酵特性研究

以浓香型大曲为研究对象,采用稀释涂布平板法从中分离酵母菌,对其形态特征进行观察;采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）显色法初筛,通过发酵力、产酒能力、耐高温、耐酒精能力实验进行复筛,筛选一株优良的功能性酵母菌,利用Biolog微生物自动分析系统对其进行鉴定,并利用顶空固相微萃取气质联用（HS-SPME-GC-MS）法对其液态发酵产物进行分析。结果表明,从浓香型大曲中共分离出9株酵母菌,其中菌株NDY-06性能最突出,可耐受42 ℃的高温,16%vol的酒精度,且具有一定的发酵产酒能力;该菌株被鉴定为产香酵母Zygosaccharomyces cidri,从其液态发酵产物中共检测到35种挥发性风味物质,包括醇类物质7种,酯类物质13种,酸类物质7种,吡嗪类物质3种,对白酒香气成分有一定的贡献。     

高温大曲中产吡嗪芽孢杆菌的分离鉴定及发酵产物分析

该试验从高温大曲中筛选产吡嗪芽孢杆菌（Bacillus）,通过形态观察及磷脂脂肪酸（PLFA）分析对其进行鉴定,并采用发酵试验分析其代谢产物。共筛选出3株芽孢杆菌,即菌株B1、B2、B3。经分析鉴定后得出：菌株B1为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）;菌株B2和B3为萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）。3株菌发酵产物分析结果表明,在液态发酵条件下3株菌发酵产吡嗪,其中菌株B2和B3发酵产物中吡嗪相对含量较高,均＞60%;固态发酵条件下生成吡嗪前体物质3-羟基-2-丁酮,且发酵产物中相对含量均＞75%。表明这3株芽孢杆菌对酱香型白酒风味物质的产生有着一定的影响。